Łatwe i dokładne profilowanie mechaniczne na matrycach Micropost

Ogólnym celem tej techniki jest zebranie istotnych właściwości mechanobiologicznych z izolowanych pojedynczych komórek poprzez wizualizację sił wynikających z ich charakterystycznych interakcji z substratami komórkowymi za pomocą standardowej mikroskopii świetlnej. Prezentowana metoda stanowi technologię platformową dla mechanobiologii. Może pomóc w badaniu kluczowych pytań w badaniach nad rakiem, takich jak rola skurczu komórek w przerzutach komórek rakowych.

Głównymi zaletami tej techniki jest to, że solidnie wydobywa informacje neurobiologiczne przy niewielkim przeszkoleniu użytkownika. Jest kompatybilny ze standardową mikroskopią świetlną i jest nastawiony na wysoką przepustowość. Po trzecie, metoda ta dostarcza informacji na temat właściwości mechanicznych biologicznych ludzkich komórek raka kości.

Może być również stosowany do typów komórek automatycznych, takich jak gładkie komórki musco lub kardiomiocyty. Zacznij od umieszczenia szklanego podłoża tak, aby układ mikrosłupków był skierowany do góry do studzienki płytki 12-dołkowej, pośrednio dodaj jeden mililitr 99% etanolu do studzienki, aby podłoże zostało pokryte. Upewnij się, że podczas jakichkolwiek etapów obchodzenia się z cieczą nie tworzy się pęcherzyki i że układ mikrosłupków jest zawsze pokryty cienką warstwą płynu.

Następnie inkubuj matrycę w temperaturze pokojowej przez 20 do 30 sekund przed dodaniem jednego mililitra sterylnej wody dejonizowanej z boku studzienki. Po zmieszaniu z etanolem odessać około jednego mililitra roztworu etanolu ze studni i dodać dodatkowy mililitr wody dejonizowanej. Powtórzyć ten proces co najmniej trzy razy, aby zwilżyć próbkę.

Następnie zastąp dejonizowaną wodę w studni PBS w ten sam sposób, dodając, a następnie zasysając około jednego mililitra na raz przez trzy powtórzenia. Następnie użyj tego samego procesu, aby zastąpić PBS nośnikiem. Teraz, gdy tablica jest pokryta około jednym mililitrem pożywki, odpipetuj 25 000 interesujących komórek w jednym mililitrze pożywki do studzienki z przygotowanym układem mikro słupków.

Następnie zamknij płytkę wielodołkową i przenieś ją do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Pozwól komórkom przylegać i rosnąć na mikrosłupkach przez sześć do siedmiu godzin, sprawdzając proces adhezji. Od czasu do czasu za pomocą mikroskopu świetlnego odessać pożywkę ze studzienki, a następnie dwukrotnie przemyć komórki jednym mililitrem PBS.

Upewnij się, że podczas mycia PBS używasz delikatnej siły, aby usunąć resztki komórek, które nagromadziły się na matrycy mikrosłupków podczas inkubacji i odłączyć martwe komórki. Następnie dodaj 0,5 mililitra 3,7% buforowanego roztworu formaldehydu przez pięć minut, aby utrwalić komórki. Następnie usuń roztwór formaldehydu i umyj matrycę mikrosłupków dwukrotnie za pomocą jednego mililitra sterylnej wody dejonizowanej.

Przy każdym praniu przykryj stałe komórki 0,05% niebieskim barwnikiem kumasi w 50% wodzie, 40% etanolu i 10% kwasie octowym przez około 90 sekund, zmyj nadmiar roztworu barwiącego dwoma płukaniami w jednym mililitrze sterylnej wody dejonizowanej. Następnie dodaj jeden mililitr wody dejonizowanej do matrycy mikrosłupków i sprawdź wynik barwienia pod mikroskopem świetlnym. Zacznij od dodania dwóch mililitrów dejonizowanej wody do szalki Petriego z cienkim szklanym dnem za pomocą pęsety, przenieś matrycę mikrosłupków z płytki 12-dołkowej do naczynia do obrazowania mikrowkładką skierowaną do góry.

Następnie umieść obrazowaną szalkę Petriego na ruchomym stoliku mikroskopu świetlnego. Jeśli optyka mikroskopu nie jest skorygowana o nieskończoność, obróć pierścień kompensacyjny soczewki używanej do obrazowania, aż liczba na skali będzie reprezentować całkowitą grubość wszystkich materiałów wzdłuż ścieżki optycznej. Następnie usuń wszelkie pierścienie kontrastu twarzy ze ścieżki optycznej, aby włączyć zwykły tryb jasnego pola, a następnie zmniejsz przysłonę po stronie oświetlenia do 50%Ustaw szalkę Petriego tak, aby mikrosłupki matrycy tworzyły poziomą lub pionową linię w poprzek pola obserwacji.

Zdefiniuj punkt początkowy w lewym górnym rogu i przesuwaj szalkę Petriego krok po scenie. Skanowanie matrycy micro post podczas wykonywania wielu zdjęć w wysokiej rozdzielczości za pomocą obiektywu 20x lub 40x. Staraj się, aby pojedyncza komórka znajdowała się na środku każdego obrazu w każdej nowej pozycji.

Przesuń wzdłuż ZXs od dołu mikrosłupka w kierunku końcówki mikrosłupka, aż końcówka będzie ostrą. Korzystanie z pokrętła dostrajania z mikroskopu. Następnie opuść płaszczyznę ostrości o dwa do trzech mikronów w kierunku dna mikrosłupka.

Zacznij od załadowania oprogramowania mec, profilera i załadowania szeregu obrazów, które należy przeanalizować, klikając otwórz i wybierając obrazy. Następnie przejdź do sekcji ustawień i wprowadź parametry zgodnie z instrukcją obsługi oprogramowania. Następnie przeanalizuj obrazy jeden po drugim.

Zacznij od wybrania przycisku przycinania, a następnie kliknij i przeciągnij, aby utworzyć prostokątny kontur wokół obszaru zainteresowania. Po zakończeniu kliknij dwukrotnie wewnątrz narysowanego prostokąta, aby zakończyć akcję. Następnie wybierz narysuj kontur komórki i użyj kursora krzyżyka, aby narysować kontur wokół wszystkich mikro słupków pokrytych widoczną komórką na obrazie.

Odrzuć wszelkie niechciane mikro posty, klikając na, aby odrzucić posty i użyj kursora krzyżyka do rysowania. Następnie umieść wszystkie mikroposty, które należą do komórki poza sekcją obrazu lub które są odchylone z jakiegokolwiek innego powodu, ale nie przez komórkę zainteresowania. Następnie kliknij Znajdź identyfikatory OID, aby uruchomić podprogram oprogramowania.

Dostosuj ustawienie filtra tuż obok przycisku znajdź OIDs, aż wszystkie mikroposty zostaną zarejestrowane, co jest widoczne przez Czerwony Krzyż w ich środku. Jeśli jest wiele lub brakuje pozycji mikro postów, skorzystaj z funkcji ręcznej edycji, klikając ręczną edycję i użyj krzyżyka myszy, aby wybrać dany mikro post. Kliknij dwukrotnie wewnątrz prostokąta i umieść pojedynczy czerwony znacznik w sekcji powiększonego obrazu, która automatycznie się zamknie.

Znajdź idealną siatkę mikrosłupków, aktywując funkcję generowania siatki jednym kliknięciem myszy. Upewnij się, że pozycja odpowiada prawdziwej głowicy mikrosłupka pokazanej przez niebieski pierścień wewnątrz narysowanej linii konturu komórki. Następnie w razie potrzeby popraw wszelkie zagubione znaczniki siatki w obszarze komórki.

Korzystając z odpowiedniej funkcji edycji ręcznej za pomocą kliknięcia myszą, użyj krzyżyka, aby wybrać pytanie dotyczące mikro publikowania, klikając i przeciągając je w poprzek. Kliknij dwukrotnie wewnątrz pojawiającego się prostokąta i umieść poprawiony niebieski znacznik w powiększonej sekcji obrazu, która automatycznie się zamknie. Następnie kliknij Oblicz ugięcia, aby uzyskać histogram obliczonych wartości ugięcia na podstawie różnicy między położeniem mikrosłupka w sekcji obrazu a wygenerowaną idealną siatką.

Na koniec zapisz całą analizę, w tym tabele wartości. Kontynuuj analizę obrazu, klikając resetowanie widoku, aby przeanalizować inną sekcję obrazu, lub klikając następny pokaz obrazu. Pokazano. Oto przykład profilowania meno dwóch linii komórkowych raka kości Q lub dziewięciu komórek, które mają niski potencjał przerzutowy, a wysoce przerzutowe komórki M 132 zostały osadzone na podłożu z tej samej partii produkcyjnej.

Wynik pokazuje, że komórki Q oh dziewięć mają tendencję do przykładania większej siły w swoich punktach przyczepienia niż komórki o wysokim stopniu przerzutów, kategoryzując wartości siły. Jeśli chodzi o obszar komórki, stwierdza się, że średnia siła na komórkę jest podwyższona dla dziewięciu komórek huo w porównaniu z M 132. Ponadto średnia siła na mikrosłupek wzrasta wraz z rozprzestrzenianiem się komórek, aż średnia siła na słupek osiągnie bardziej stabilną wartość.

Oprócz różnic w wariancjach morfologicznych można określić ilościowo z interesującymi wynikami. Na przykład, w przeciwieństwie do wysoce przerzutowych komórek M 132, które mają tendencję do zajmowania mniejszej liczby mikropostów, komórki HU oh dziewięć mają bardziej niejednorodny profil pod względem pokrycia mikropostów. Krótko mówiąc, profil Meno dla rodzicielskiej linii komórkowej HU oh nine ujawnia, że zazwyczaj pokrywają one większy obszar i przykładają nieco większą siłę do mikro słupków.

Natomiast przerzutowa linia komórkowa M 132 i agresywny typ komórek charakteryzują się mniejszą liczbą mikrosłupków i przykładają mniejszą siłę na mikro słupek. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby bardzo ostrożnie i nigdy nie umieszczać go bezpośrednio na matrycy mikrosłupków. Unikanie wprowadzania jakichkolwiek bąbelków, ponieważ prowadzą one do zawalenia się mikropostów.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyodrębnić informacje biologiczne meno z izolowanych pojedynczych komórek za pomocą mikro postAries w połączeniu z naszym profilem siatki lub oprogramowaniem. Ciesz się swoimi wynikami.