JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 4:18 min. • July 8th, 2025
W mózgu myszy ciało migdałowate zawiera neurony, które tworzą połączenia synaptyczne z przyśrodkową korą przedczołową lub neuronami mPFC.
Weźmy wycinek mózgu ciała migdałowatego, w którym neurony mPFC wyrażają światłoczuły kanał rodopsyny połączony z białkiem fluorescencyjnym.
Umieść wycinek w komorze rejestracyjnej i zwizualizuj go pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby zlokalizować neurony mPFC.
Przełącz się na widok jasnego pola i wprowadź pipetę krosową zawierającą roztwór wewnętrzny.
Zastosuj nadciśnienie, aby przesunąć pipetę w kierunku neuronu ciała migdałowatego.
Po kontakcie neuronalnym tworzy się dołek.
Zastosuj ssanie, aby uzyskać szczelne uszczelnienie.
Kontynuuj ssanie, aby rozerwać membranę, nawiązując kontakt z wnętrzem komórki.
Oświetl plasterek, aby aktywować neuronalny kanał kanałowy mPFC, wyzwalając napływ jonów dodatnich, generowanie potencjału czynnościowego i uwalnianie neuroprzekaźników.
Neuroprzekaźniki wiążą się z postsynaptycznymi receptorami neuronów ciała migdałowatego, powodując napływ jonów i wytwarzanie prądu.
Zarejestruj postsynaptyczny prąd neuronalny, aby przeanalizować połączenie mPFC-ciało migdałowate.
Aby przygotować mikroskop płatowy do optogenetycznej aktywacji włókien i komórek, wyśrodkuj zamontowaną diodę elektroluminescencyjną lub diodę LED na ścieżce dostarczania światła. Użyj miernika mocy, aby zmierzyć natężenie światła LED w tylnej płaszczyźnie ogniskowej oraz na wyjściu każdego obiektywu o długości fali 470 nanometrów. Użyj arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć natężenie światła w miliwatach na milimetr kwadratowy i utwórz krzywą kalibracyjną dla każdego obiektywu.
Następnie wyjmij wycinek ciała migdałowatego z komory interfejsu i umieść go w komorze na wycinki zamontowanej na mikroskopie. Ustaw plasterek tak, aby powierzchnia warstwy skierowana do góry w komorze interfejsu była również skierowana do góry w komorze nagrywania. Perfanduj plasterek świeżym, natlenionym ACSF w ilości od 1 do 2 mililitrów na minutę. Temperatura powinna wynosić około 31 stopni Celsjusza. Włącz lampę fluorescencyjną i wybierz odpowiednie zestawy filtrów dla określonego białka fluorescencyjnego, które ulega ekspresji. Użyj obiektywu 5x, aby uzyskać przegląd.
Następnie otwórz lub ogranicz aperturę w ścieżce świetlnej mikroskopu, w zależności od potrzeb eksperymentu. Aby uzyskać zapis plastra, należy napełnić pipetę plastrową roztworem wewnętrznym i zamontować ją w uchwycie elektrody. Zastosuj nadciśnienie do pipety z plastrem i powoli zanurz ją w roztworze do kąpieli. Następnie, pod kontrolą wzrokową, za pomocą mikromanipulatora opuścić pipetę z plastrem do plastra do plastru. Zbliż się do interesującego neuronu za pomocą pipety z plastrem z boku i od góry.
Zwolnij nadciśnienie, gdy pipeta dotrze do powierzchni celi, na co wskazuje wgłębienie widoczne na powierzchni komórki. Zastosuj podciśnienie, aby uzyskać gigaseal. Zastosuj dalsze ssanie, aby rozerwać łatkę membrany i uzyskać zapis całej komórki. Następnie stymuluj znakowane włókna za pomocą podłączonej diody LED, aktywując rodopsynę kanałową światłem o długości fali 470 nanometrów, jednocześnie rejestrując odpowiedzi elektryczne z komórki.
Do stymulacji synaptycznej użyj wyjść cyfrowych oprogramowania do akwizycji danych, aby wyzwolić diodę LED. Ręcznie dostosuj intensywność stymulacji LED. Powtórzyć stymulację z otwartym lub ograniczonym otworem, w zależności od potrzeb dla następnej zarejestrowanej komórki lub w obecności określonych substancji badanych.