Ocena funkcjonalnego połączenia nerwowo-mięśniowego za pomocą jednoczesnej stymulacji optycznej i nagrywania wideo

Zacznij od bioreaktora z komorą mięśniową zawierającą tkankę mięśniową zatopioną w kolagenie, wspartą na filarach komory.

Kanał neurosfery zawiera neurosferę w macierzy kolagenowej. Neurony ruchowe neurosfery wyrażają kanały wrażliwe na światło.

Dodaj pożywkę różnicującą zawierającą neuronalne czynniki wzrostu, które stymulują neurony do rozszerzania swoich projekcji.

Regularnie wymieniaj pożywkę, aby zapewnić ciągłe rozciąganie neuronów w kierunku tkanki mięśniowej, tworząc połączenia nerwowo-mięśniowe.

Obserwuj bioreaktor pod mikroskopem wyposażonym w kamerę i źródło niebieskiego światła.

Zastosuj impulsy niebieskiego światła, aby otworzyć wrażliwe na światło kanały w neuronach, umożliwiając przepływ jonów z pożywki i stymulując neurony do generowania sygnałów elektrycznych.

Sygnały te przemieszczają się przez projekcje neuronalne do połączeń nerwowo-mięśniowych, przekazując sygnał elektryczny do tkanki mięśniowej.

Nagrywaj wideo jednocześnie. Stopniowe kurczenie się włókna mięśniowego potwierdza rozwój funkcjonalnego połączenia nerwowo-mięśniowego.

Przygotuj mieszankę 4 do 1 3 miligramów na mililitr kolagenu I i rozpuszczonej macierzy błony podstawnej. Następnie ponownie zawieś mioblasty w tej świeżo przygotowanej mieszance kolagenu.

Następnie dodaj 15 mikrolitrów tej zawiesiny kolagenu komórkowego do każdej komory mięśniowej bioreaktora, upewniając się, że zawiesina została rozprowadzona na obu filarach za pomocą końcówki pipety. Pozostaw mieszaninę żelu komórkowego do polimeryzacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie napełnij każdy bioreaktor studzienką 450 mikrolitrami miotonicznej pożywki wzrostowej.

W 11 dniu różnicowania neuronów ruchowych przenieś komórki i pożywkę do 50-mililitrowej rurki i pozwól neurosferom osiąść na dnie przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 15 mililitrach pożywki hodowlanej zawiesiny neuronów ruchowych uzupełnionej 20 nanogramami na mililitr neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego i 10 nanogramów na mililitr czynnika neurotroficznego pochodzącego z komórek glejowych.

W 14 dniu protokołów różnicowania umieść neurony ruchowe w platformie. Przygotuj mieszaninę żelu 4 do 1 zawierającą 2 miligramy na mililitr kolagenu I i rozpuszczoną macierz błony podstawnej. Użyj 400-nanometrowego sitka komórkowego, aby wybrać duże neurosfery i ponownie zawiesić je w przygotowanej mieszaninie żelu.

Ostrożnie odessaj pożywkę ze zbiornika i dobrze neurosfery. Następnie dodaj 15 mikrolitrów mieszaniny żelu do kanału neurosfery. Załaduj pipetę o pojemności 10 mikrolitrów z 10 mikrolitrami żelu i wybierz jedną neurosferę. Umieść neurosferę w kanale neurosfery, upewniając się, że znajduje się w komorze. Następnie powoli podnieś pipetę, jednocześnie uwalniając pozostały żel, gdy neurosfera zostanie osadzona.

Pozostaw żel do polimeryzacji przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj do zbiorników 450 mikrolitrów NbActiv4 uzupełnionych 20 nanogramami na mililitr neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego i 10 nanogramów na mililitr neurotroficznego czynnika pochodzącego z komórek glejowych.

Do obrazowania należy użyć odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z naukowym komplementarnym oprogramowaniem kamery półprzewodnikowej z tlenku metalu. Ustaw binning na 2 na 2, ekspozycję na 20 milisekund, włączoną migawkę typu rolling shutter, częstotliwość odczytu na 540 megaherców, zakres dynamiczny na 12 bitów i wzmocnienie 1 oraz tryb czujnika na nakładanie się. Użyj obiektywu 2x na mikroskopie, aby zobrazować mikrotkanki i przymocuj komorę żywych komórek do stolika mikroskopu.

Wybierz obszar zainteresowania, który zawiera unerwione tkanki szkieletowe, aby zminimalizować rozmiar pliku i czas przetwarzania. Następnie umieść 594-nanometrowy filtr emisyjny długoprzepustowy między próbką a obiektywem obrazowania, aby odfiltrować impulsy światła niebieskiego z kamery. Następnie umieść prostokątną czterodołkową płytkę zawierającą cztery bioreaktory w komorze na żywe komórki. Następnie kliknij opcję Live View (Podgląd na żywo), wyśrodkuj i ustaw ostrość obrazu z żądanym zwrotem akcji.

Pobierz niestandardowy makrokod z folderu GitHub, aby kontrolować pozycję sceny, płytę Arduino i akwizycję wideo. Następnie ustaw film wyjściowy jako day_tissuegroup_tissuename_experiment. ND2. Uruchom makrokod z żądanymi współrzędnymi x i y ustawionymi na stole montażowym i uzyskaj szybki film poklatkowy z 1 700 klatkami przy 50 klatkach na sekundę.

Po zobrazowaniu należy wymienić pożywkę i umieścić próbki z powrotem w inkubatorze. Odczekaj co najmniej 24 godziny między sesjami pozyskiwania obrazu, aby uniknąć zmęczenia tkanek.