Name: Zapisy całokomórkowe patch-clamp do elektrofizjologicznego oznaczania selektywności jonowej w rodopsynach kanałowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Poznaj metodę zapisywania całokomórkowego patch-clamp do oznaczania selektywności jonowej chloru w rodopsynach kanałowych w komórkach HEK293. Technika ta umożliwia badanie biofizyki światłoczułych kanałów jonowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Maila Reh, Tharsana Tharmalingam, a szczególnie Altinie Klein za doskonałą pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 do P. H.) oraz Cluster of Excellence Unifying Concepts in Catalysis, UniCat, BIG-NSE (J.V.) i E4 (P.H.).

<ol><li>Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algal+sensory+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Algal sensory photoreceptors.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 59, 167-189 (2008).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-1%3A+a+light-gated+proton+channel+in+green+algae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae.</a> Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).</li>
<li>Bruegmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+contractile+function+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of contractile function in skeletal muscle.</a> Nat. Commun. 6 (7153), 1-8 (2015).</li>
<li>Bruegmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+heart+muscle+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo.</a> Nat. Methods. 7 (11), 897-900 (2010).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbial+opsin+family+of+optogenetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The microbial opsin family of optogenetic tools.</a> Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr. Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+noninvasive+activation+and+inhibition+of+neural+and+network+activity+by+vertebrate+rhodopsin+and+green+algae+channelrhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (49), 17816-17821 (2005).</li>
<li>Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+evaluation+of+photosensitivity+in+genetically+engineered+neurons+expressing+green+algae+light-gated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels.</a> Neurosci. Res. 54 (2), 85-94 (2006).</li>
<li>Wietek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+channelrhodopsin+into+a+light-gated+chloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel.</a> Science. 344 (6182), 409-412 (2014).</li>
<li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+foundations+of+optogenetics%3A+Determinants+of+channelrhodopsin+ion+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113 (4), 822-829 (2016).</li>
<li>Tsunoda, S. P., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glu+87+of+Channelrhodopsin-1+Causes+pH-dependent+Color+Tuning+and+Fast+Photocurrent+Inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation.</a> Photochem. Photobiol. 85 (2), 564-569 (2009).</li>
<li>Schneider, F., Gradmann, D., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+selectivity+and+competition+in+channelrhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ion selectivity and competition in channelrhodopsins.</a> Biophys. J. 105 (1), 91-100 (2013).</li>
<li>Prigge, M. Über die elektrophysiologische Untersuchung und Entwicklung von farbverschobenen Kanalrhodopsinchimären aus der Grünalge Volvox carteri. , Diss. Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100203476">http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100203476</a> (2012).</li>
<li>Govorunova, E. G., Spudich, E. N., Lane, C. E., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Channelrhodopsin+with+a+Red-Shifted+Spectrum+and+Rapid+Kinetics+from+Mesostigma+viride%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">New Channelrhodopsin with a Red-Shifted Spectrum and Rapid Kinetics from Mesostigma viride.</a> MBio. 2 (3), 1-9 (2011).</li>
<li>Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Li, H., Janz, R., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+highly+efficient+blue-shifted+channelrhodopsin+from+the+marine+alga+Platymonas+subcordiformis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of a highly efficient blue-shifted channelrhodopsin from the marine alga Platymonas subcordiformis.</a> J. Biol. Chem. 288 (41), 29911-29922 (2013).</li>
<li>Hou, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+Chlamydomonas+Channelrhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Diversity of Chlamydomonas Channelrhodopsins.</a> Photochem. Photobiol. 88 (1), 119-128 (2012).</li>
<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li>
<li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys. J. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li>
<li>Yizhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortical+excitation%2Finhibition+balance+in+information+processing+and+social+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction.</a> Nature. 477 (7363), 171-178 (2011).</li>
<li>Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. a, Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-stable+neural+state+switches%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bi-stable neural state switches.</a> Nat. Neurosci. 12 (2), 229-234 (2009).</li>
<li>Berndt, A., Lee, S. Y., Ramakrishnan, C., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-Guided+Transformation+of+Channelrhodopsin+into+a+Light-Activated+Chloride+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure-Guided Transformation of Channelrhodopsin into a Light-Activated Chloride Channel.</a> Science. 344 (6182), 420-424 (2014).</li>
<li>Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomonas+sulcata+ACR1%3A+A+Fast+Anion+Channelrhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Proteomonas sulcata ACR1: A Fast Anion Channelrhodopsin.</a> Photochem. Photobiol. 92 (2), 257-263 (2016).</li>
<li>Wietek, J., Broser, M., Krause, B. S., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Natural+Green+Light+Absorbing+Chloride+Conducting+Channelrhodopsin+from+Proteomonas+sulcata%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a Natural Green Light Absorbing Chloride Conducting Channelrhodopsin from Proteomonas sulcata.</a> J. Biol. Chem. 291 (8), 4121-4127 (2016).</li>
<li>Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+light-gated+anion+channels%3A+A+family+of+microbial+rhodopsins+for+advanced+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics.</a> Science. 349 (6248), 647-650 (2015).</li>
<li>Neher, E., Sakmann, B., Steinbach, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+patch+clamp%3A+A+method+for+resolving+currents+through+individual+open+channels+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch.+Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The extracellular patch clamp: A method for resolving currents through individual open channels in biological membranes.</a> Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 375 (2), 219-228 (1978).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch.+Eur.+J.+Physiol.+Arch.+Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. Arch. Eur. J. Physiol. 391 (2), 85-100 (1981).</li>
<li>Barry, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JPCalc%2C+a+software+package+for+calculating+liquid+junction+potential+corrections+in+patch-clamp%2C+intracellular%2C+epithelial+and+bilayer+measurements+and+for+correcting+junction+potential+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements.</a> J. Neurosci. Methods. 51 (1), 107-116 (1994).</li>
<li>Amtmann, A., Sanders, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unified+procedure+for+the+correction+of+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments+on+endo-+and+plasma+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">A unified procedure for the correction of liquid junction potentials in patch clamp experiments on endo- and plasma membranes.</a> J. Exp. Bot. 48, (Special) 361-364 (1997).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
<li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+laboratory+techniques%3A+plating+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Aseptic laboratory techniques: plating methods.</a> J. Vis. Exp. (63), e1-e18 (2012).</li>
<li>Felgner, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofection%3A+a+highly+efficient%2C+lipid-mediated+DNA-transfection+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84 (21), 7413-7417 (1987).</li>
<li>Halliwell, J., Whitaker, M., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.utdallas.edu/~tres/microelectrode/microelectrodes_ch01.pdf">Using microelectrodes.</a> Microelectrode Tech. Plymouth Work. Handb. 3, 1-15 (1949).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J. Vis. Exp. (20), e1-e2 (2008).</li>
<li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51 (3), 187-200 (2005).</li>
<li>Pusch, M., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+diffusional+exchange+between+small+cells+and+a+measuring+patch+pipette%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch.+Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette.</a> Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 411 (2), 204-211 (1988).</li>
<li>Berndt, A. Mechanismus und anwendungsbezogene Optimierung von Channelrhodopsin-2. , Diss Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100191266">http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100191266</a> (2011).</li>
<li>Prigge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Color-tuned+channelrhodopsins+for+multiwavelength+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Color-tuned channelrhodopsins for multiwavelength optogenetics.</a> J. Biol. Chem. 287 (38), 31804-31812 (2012).</li>
<li>Gradmann, D., Berndt, A., Schneider, F., Hegemann, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3325117/">Rectification of the channelrhodopsin early conductance.</a> Biophys. J. 101 (5), 1057-1068 (2011).</li>
<li>Beppu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+countering+of+glial+acidosis+suppresses+glial+glutamate+release+and+ischemic+brain+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage.</a> Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).</li>
<li>Wietek, J., Prigge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+Channelrhodopsins%3A+An+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Enhancing Channelrhodopsins: An Overview.</a> Methods Mol. Biol. 1408, 141-165 (2016).</li>
<li>Ferenczi, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+approaches+addressing+extracellular+modulation+of+neural+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Optogenetic approaches addressing extracellular modulation of neural excitability.</a> Sci. Rep. 6, 1-20 (2016).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red-shifted+optogenetic+excitation%3A+a+tool+for+fast+neural+control+derived+from+Volvox+carteri%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carteri.</a> Nat. Neurosci. 11 (6), 631-633 (2008).</li>
<li>Sugiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocurrent+attenuation+by+a+single+polar-to-nonpolar+point+mutation+of+channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Photocurrent attenuation by a single polar-to-nonpolar point mutation of channelrhodopsin-2.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 8 (3), 328-336 (2009).</li>
<li>Kleinlogel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/neuro/journal/v14/n4/full/nn.2776.html">Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh.</a> Nat. Neurosci. 14 (4), 513-518 (2011).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+differentiating+photocurrent+properties+of+two+channelrhodopsins+from+chlamydomonas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants differentiating photocurrent properties of two channelrhodopsins from chlamydomonas.</a> J. Biol. Chem. 284 (9), 5685-5696 (2009).</li>
<li>Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((eNpHR%3A+a+Natronomonas+halorhodopsin+enhanced+for+optogenetic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications.</a> Brain Cell Biol. 36 (1-4), 129-139 (2008).</li>
<li>Berglund, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminopsins+integrate+opto-+and+chemogenetics+by+using+physical+and+biological+light+sources+for+opsin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (3), 358-367 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wyznaczanie potencjałów odwrócenia w określonych warunkach jonowych i elektrycznych dostarcza informacji o formach jonów transportowanych po aktywacji światłem ChR. Jeśli tylko jeden rodzaj jonów jest zmieniany w złożonym ośrodku fizjologicznym, a uzyskany potencjał odwrócenia zmienia się zgodnie z teoretycznym potencjałem Nernsta, ten rodzaj jonu jest jedynym transportowanym.
Jednak w przypadku ChR przesunięcia potencjału odwrócenia są zwykle mniej wyraźne niż oczekiwano na podstawie równania...

Rodopsyny kanałowe (ChR) to bramkowane światłem kanały jonowe, które występują w plamce oka ruchliwych zielonych alg i służą jako główne fotosensory dla fototaksji i reakcji fobicznych1. Od czasu ich pierwszego opisu w 2002 roku2, ChR utorowały drogę dla rozwijającej się dziedziny optogenetyki i mogą być stosowane w różnych komórkach pobudliwych, np. w mięśniach szkieletowych, sercu lub mózgu3,4,5. Ekspresja ChR w komórkach docelowych powoduje kontrolowaną przez światło przepuszczalność jonów danej komórki. W kontekście neuronalnym pozwala to na aktywację6,7,8 lub inhibition9,10 potencjału czynnościowego (AP) wystrzeliwania – w zależności od przewodzonego jonu – z przestrzenną i czasową precyzją światła, podkreślając, w jaki sposób selektywność jonowa wariantu ChR determinuje jego optogenetyczne zastosowanie.
Pierwsze odkryte ChR z Chlamydomonas reinhardtii i Volvox carteri są przepuszczalne dla protonów, ale także dla kationów jednowartościowych, takich jak sód, potas, i w mniejszym stopniu dla kationów dwuwartościowych, takich jak wapń i magnez11,12,13. Obecnie ponad 70 naturalnych rodopsyn kanałowych przewodzących kationy (CCR)14,15,16,17 i kilka zaprojektowanych wariantów18,19,20 o różnych właściwościach, takich jak Dostępne są rozmiary prądów fotologicznych, czułość spektralna, kinetyka i selektywność kationowa. Podczas gdy w neurobiologii CCR są wykorzystywane do aktywacji komórek i wyzwalania AP, napędzane światłem pompy mikrobiologiczne były jedynymi dostępnymi antagonistami do wyciszania neuronów przez lata. W 2014 roku dwie grupy jednocześnie wykazały, że CCR mogą być przekształcane w przewodniki kantylacyjne (ACR) poprzez zmianę polarności wzdłuż przypuszczalnego poru przewodzącego jony za pomocą inżynierii molekularnej9,21. Następnie naturalne ACR zostały zidentyfikowane w kilku kryptofitowych algach22,23,24. Co najważniejsze, aktywacja światłem ACR pośredniczy w prądach chlorkowych w dorosłych neuronach, umożliwiając hamowanie aktywności neuronów przy znacznie niższym natężeniu światła niż pompy mikrobiologiczne, które transportują tylko pojedyncze ładunki na pochłonięty foton.
Aktywność ChR może być bezpośrednio adresowana przez elektrofizjologiczne zapisy prądów indukowanych światłem w komórkach HEK293. Technika patch-clamp została pierwotnie opracowana pod koniec lat siedemdziesiątych XX wieku25 i dalej ulepszona przez Hamilla i wsp., umożliwiając rejestrację jednostki prądów z małej komórki (tryb całego ogniwa) z wysoką rozdzielczością prądu i bezpośrednią kontrolą napięcia membrany26. Technika ta, zastosowana w hodowli komórkowej, zapewnia dokładną kontrolę warunków zapisu jonowego i elektrycznego oraz umożliwia badanie selektywności jonów wraz ze względnym udziałem jonów w całkowitym prądzie. Tutaj ilustrujemy badanie selektywności jonowej dla przewodzącej anion rodopsyny kanałowej Proteomonas sulcata (PsACR1)22,23 poprzez rejestrację relacji prąd-napięcie przy różnych zewnątrzkomórkowych stężeniach chlorków w celu udowodnienia wysokiej przewodności chlorków.

<table><tbody><tr><td>Komórki HEK293</td><td>Sigma Aldrich</td><td>85120602</td><td>Ludzkie embrionalne komórki nerkowe</td></tr><tr><td>Retinal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2500</td><td>all-trans retinal</td></tr><tr><td>FuGENE HD</td><td>Promega</td><td>E2312</td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom</td><td>FG 0445</td><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Roth</td><td>3810</td><td>Mostki agarowe</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Roth</td><td>5239</td><td>CaCl2 2H2O</td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Biomol</td><td>2452</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Roth</td><td>3054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biochrome</td><td>S0615</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Roth</td><td>HN06</td><td>D(+)-Glukoza</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Roth</td><td>6781</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td>2189</td><td>MgCl2 6H2O</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>3957</td><td></td></tr><tr><td>NMG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004</td><td>N-metylo-D-glukamina</td></tr><tr><td>Na-asparaginian</td><td>Sigma</td><td>Aldrich A6683</td><td>Kwas L-asparaginowy sól sodowa jednowodna</td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Roth</td><td>6490</td><td></td></tr><tr><td>AgeI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER1462</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER0695</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>NheI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER0975</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>XL1Blue E. coli</td><td>Agilent Technologies</td><td>200249</td><td>Chemocompetent E. coli</td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>Roth</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka bulionowa lizogenna</td><td>Roth</td><td>X964</td><td></td></tr><tr><td>Agar-Agar</td><td>Roth</td><td>6494</td><td>Płytki agarowe</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania plazmidu</td><td>Marchery-Nagel</td><td>740727.25</td><td></td></tr><tr><td>Penicyna/Streptomycyna</td><td>Biochrom</td><td>A 2213</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-D-lizyny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td>Powłoka szkiełkowa nakrywkowa</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Wykonane</td><td></td> na zamówienie <td>Polerowanie ogniowe</td></tr><tr><td>Pipety serologiczne</td><td>TPP</td><td></td><td>Różne rozmiary</td></tr><tr><td>Czysta ławka</td><td>Kojair</td><td>Biowizard SL130</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło</td><td>IKA</td><td>RCT klasyczne</td><td></td></tr><tr><td>Srebrny drut</td><td>Science Products</td><td>AG-T25; AG-T10</td><td>Elektrody, 0,64 mm (kąpiel); 0,25 mm (elektroda)</td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Osmometr kalimetryczny</td><td></td>Knick <td>765 Mikroskop</td></tr><tr><td></td><td>Vogel</td><td>OM 815</td><td></td></tr> Inkubator <tr><td></td><td>Carl Zeiss</td><td>ID03</td><td>Polerowanie ogniowe</td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Binder</td><td>CB150</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli komórkowych</td><td>TPP</td><td>93040</td><td>34 mm wewnętrzne średnica</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Roth</td><td>P232</td><td>Termometr o średnicy 15 mm</td></tr><tr><td>R</td><td>&ouml; ssel Messtechnik</td><td>MTM12</td><td></td></tr><tr><td>Beamsplitter</td><td>Chroma</td><td>21011</td><td>90/10 transmisja</td></tr><tr><td>Uchwyt na pipety</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>PPH-1P-AXU-0-1.5</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Headstage Molecular Devices</td><td>CV203BU</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>AxoPatch200B</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>DigiData1400</td><td>Przetwornik cyfrowo-analogowy</td></tr><tr><td>Źródło światła</td><td>TILL Photonics</td><td>Polychrome V</td><td>Zestaw na pełną intensywność 540 nm</td></tr> Mikroskop <tr><td></td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 100</td><td></td></tr><tr><td>Shutter</td><td>Vincent Associates</td><td>VS25</td><td></td></tr><tr><td>Shutter Vincent</td><td>Associates</td><td>VCM-D1</td><td></td></tr><tr><td>Szklane kapsle</td><td>Warner Instruments</td><td>G150F-3</td><td>Kapilary borokrzemianowe z ogniowo polerowanymi końcami OD 1,5 mm ID&nbsp; 0,86 mm</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>P1000</td><td></td></tr><tr><td>Manipulator wannowy</td><td>Lorenz Messger&auml; tebau</td><td>MPCU</td><td></td></tr><tr><td>Trzypasmowy zestaw filtrów</td><td>Chroma</td><td>69008</td><td>Filtr fluorescencyjny&nbsp; ECFP/EYFP/mWiśnia&nbsp;</td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>Watec</td><td>Wat-221SCCD</td><td></td></tr><tr><td>Optometr</td><td>Gigahertz Optik</td><td>P9710</td><td>Pomiar natężenia światła</td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td>Carl Zeiss</td><td>421462-9900-000</td><td>W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Scientifica</td><td>PatchStar</td><td></td></tr><tr><td>Komora nagraniowa</td><td>Zasilacz</td> na zamówienie <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Manson</td><td>HCS-3202</td><td>Unika szumów elektrycznych z mikroskopu Wbudowany zasilacz</td></tr><tr><td>Stół z izolacją drgań</td><td>Newport</td><td>M-VW-3636-OPT-01</td><td></td></tr><tr><td>Klatka Faradaya</td><td>Wykonany na zamówienie lub dowolny komercyjny stół</td><td></td><td></td>pasujący</tr><tr><td>Węże</td><td>Dowolna komercjalność; np. Roth</td><td></td><td>Różne rozmiary i materiały do kąpieli i stosowania ciśnienia w pipetach; mostki agarowe</td></tr><tr><td>Liniowy Wytrząsarka</td><td>Sunlab Instruments</td><td>SU 1000</td><td></td></tr><tr><td>Kalkulator potencjału złącza cieczowego</td><td>Urządzenia molekularne lub bezpośrednio od Petera H. Barry'ego</td><td></td><td>Program jest zawarty w oprogramowaniu akwizycyjnym Clampex lub można go uzyskać z&nbsp; p.barry@unsw.edu.au Oprogramowanie</td></tr> do <tr><td>akwizycji danych</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Clampex 10.X</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do oceny danych</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Clampfit 10.X</td><td></td></tr><tr><td>PsACR1</td><td>GenBank lub Addgene</td><td>KF992074.1 lub plazmid Addgene #85465</td><td>Kodowanie genów dla PsACR1</td></tr><tr><td>Przewodnik po</td><td>wzmacniaczu Urządzenia molekularne</td><td>Przewodnik</td><td></td> po firmie Axon</tr></tbody></table>

zapisy całokomórkowe patch-clamp do elektrofizjologicznego oznaczania selektywności jonowej w rodopsynach kanałowych

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

W ciągu ostatniej dekady, rodopsyny kanałowe stały się niezbędne w badaniach neuronaukowych, gdzie są używane jako narzędzia do nieinwazyjnego manipulowania procesami elektrycznymi w komórkach docelowych. W tym kontekście szczególne znaczenie ma selektywność jonowa rodopsyny kanałowej. W artykule opisano badanie selektywności chlorkowej dla niedawno zidentyfikowanej rodopsyny kanałowej przewodzącej aniony Proteomonas sulcata za pomocą elektrofizjologicznych zapisów patch-clamp na komórkach HEK293. Eksperymentalna procedura pomiaru fotoprądów bramkowanych światłem wymaga szybko przełączanego – najlepiej monochromatycznego – źródła światła sprzężonego z mikroskopem w konwencjonalnym układzie patch-clamp. Przedstawiono procedury przygotowawcze poprzedzające eksperyment, w tym przygotowanie roztworów buforowych, rozważania na temat potencjałów połączeń cieczy, wysiewanie i transfekcję komórek oraz wyciąganie pipet z plastrami. Właściwy zapis zależności prąd-napięcie w celu wyznaczenia potencjałów odwrócenia dla różnych stężeń chlorków odbywa się od 24 godzin do 48 godzin po transfekcji. Na koniec analizowane są dane elektrofizjologiczne pod kątem teoretycznych rozważań dotyczących przewodnictwa chlorków.

Rycina 2 przedstawia reprezentatywne wyniki uzyskane z pomiarów przeprowadzonych zgodnie z opisanym protokołem. Podczas naświetlania zielonym światłem PsACR1 wykazuje szybki prąd przejściowy, który gwałtownie zanika do poziomu prądu stacjonarnego. Po wyłączeniu światła prądy fotoprzewodzące zanikają do zera w ciągu milisekund (Rycina 2A). Zmiana zewnętrznego stężenia chlorków powoduje przesunięcie potencjału odwrócenia, co można bezpośrednio zaob...

Ten artykuł opisuje, jak selektywność jonowa rodopsyny kanałowej jest określana za pomocą elektrofizjologicznych zapisów całokomórkowych z użyciem komórek HEK293. W tym miejscu przedstawiono eksperymentalną procedurę badania selektywności chlorkowej selektywnej dla anionów rodopsyny kanałowej. Procedura ta może być jednak przenoszona na inne rodopsyny kanałowe o wyraźnej selektywności.

Zapisy całokomórkowe patch-clamp do elektrofizjologicznego oznaczania selektywności jonowej w rodopsynach kanałowych

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest określenie selektywności chlorkowej nowych kanałów jonowych bramkowanych światłem. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w biofizyce rodopsyn kanałowych, takie jak amplitudy fotoprądów, kinetyka i selektywność jonowa. Główną zaletą tej techniki jest bezpośredni odczyt aktywności kanału biofizycznego, który jest szybki i łatwy do odtworzenia.Ogólnie rzecz biorąc, osoby początkujące w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ każdy etap procedury eksperymentalnej, od przygotowania komórek HEK do rejestracji fotoprądów, musi być zoptymalizowany. Wysiew i transsekcja komórek HEK zostanie zademonstrowana przez Altinę Klein. Aby rozpocząć tę procedurę, zważ składniki stałe na 100 mililitrów roztworów wewnątrzkomórkowych i 500 mililitrów zewnątrzkomórkowych roztworów buforowych w oddzielnych zlewkach.A następnie dodaj odpowiednią ilość przygotowanych roztworów podstawowych. Następnie dodaj ultraczystą wodę i ostrożnie dostosuj pH za pomocą kwasów i zasad. Następnie dostosuj osmolarność z glukozą do 290 miliosmoli i 320 miliosmoli odpowiednio dla roztworów wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych.W tej procedurze umieść do trzech szkiełek p

whole-cell-patch-clamp-recordings-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy materiał stanowi wprowadzenie do rejestracji metodą patch clamp z oocytów Xenopus laevis. Obejmuje on usuwanie błony witelinowej, tworzenie uszczelnienia gigaomowego (gigaseal) oraz opcjonalną konwersję patcha do topologii outside-out.

Rejestracja metodą patch clamp kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

W niniejszej pracy opisujemy procedurę przygotowywania adaptowanych do ciemności skrawków siatkówki mysiej do pomiarów elektrofizjologicznych.

Rejestracja metodą patch-clamp z neuronów siatkówki myszy w preparacie skrawka adaptowanego do ciemności

Prąd jonowy kanałów BK rejestruje się przy użyciu technik patch clamp. Kanały BK są eksprymowane w oocytach Xenopus poprzez wstrzykiwanie mRNA. Roztwór wewnątrzkomórkowy podczas pomiarów patch clamp jest kontrolowany przez system perfuzyjny.

Techniki patch clamp i perfuzji do badania kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

Ten protokół opisuje technikę zwaną elektrofizjologią klamer całokomórkowych, która jest metodą badania właściwości elektrycznych neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego.

Elektrofizjologia klamer krosowych całych komórek: metoda badania właściwości elektrycznych neuronów

Film demonstruje rejestrowanie aktywności elektrycznej w neuronach fotoreceptorowych ommatidium Drosophila poprzez ustanowienie konfiguracji całej komórki. Podkreśla on aktywację przejściowych kanałów potencjału receptora przez impulsy świetlne, co skutkuje mierzalnymi wstrząsami kwantowymi.

Zapisy cęgów napięcia całej komórki z fotoreceptorów Drosophila

W tym filmie, embrionalne hodowle komórek nerkowych wyrażające zależne od światła białka kanału jonowego połączone fluorescencyjnym reporterem demonstrują wpływ światła na ruch jonów. Zacisk krosowy na całe komórki służy do monitorowania ruchu jonów.

Zapis elektrofizjologii optogenetycznej komórek z kanałami jonowymi zależnymi od światła

Opisujemy przygotowanie cienkich wycinków siatkówki z wodnych salamander tygrysich (Ambystoma tigrinum) i wyjaśniamy, jak używamy tych wycinków do badania przetwarzania synaptycznego w siatkówce, uzyskując podwójne zapisy napięcia całego ogniwa z fotoreceptorów oraz komórek poziomych i dwubiegunowych drugiego rzędu.

Jednoczesne zapisy całych komórek z fotoreceptorów i neuronów drugiego rzędu w preparacie plastra siatkówki

Tutaj opisano procedurę uzyskiwania długich odcinków zapisu prądu z jednego kanału jonowego za pomocą techniki patch-clamp dołączonej do komórki. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wzorca konformacji kanałów otwórz-zamknij, które leżą u podstaw sygnału biologicznego. Dane te informują o właściwościach kanałów w niezakłóconych błonach biologicznych.

Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

Zapisy całokomórkowe z fotoreceptorów Drosophila melanogaster umożliwiają pomiar spontanicznych ciemnych guzków, wybrzuszeń kwantowych, makroskopowych reakcji na światło i zależności prąd-napięcie w różnych warunkach. W połączeniu z narzędziami manipulacji genetycznej D. melanogaster, metoda ta umożliwia badanie wszechobecnego szlaku sygnałowego inozytol-lipid i jego celu, czyli kanału TRP.

Metoda elektrofizjologiczna dla zapisów cęgów napięcia w całej komórce z fotoreceptorów Drosophila

Celem tego filmu jest zaprezentowanie procedur pozyskiwania zdrowych, nienaruszonych komórek rzęskowych z organów ucha wewnętrznego dorosłych danio pręgowanych, a następnie wykorzystania ich w badaniach metodą patch clamp w celu scharakteryzowania właściwości biofizycznych ich kanałów sterowanych napięciem.

Rejestracje metodą patch-clamp w komórkach rzęsatych ucha wewnętrznego wyizolowanych z ryby danio-ostrobramowej

Poznaj metodę zapisywania całokomórkowego patch-clamp do oznaczania selektywności jonowej chloru w rodopsynach kanałowych w komórkach HEK293. Technika ta umożliwia badanie biofizyki światłoczułych kanałów jonowych.

Zapisy całokomórkowe patch-clamp do elektrofizjologicznego oznaczania selektywności jonowej w rodopsynach kanałowych

Przeglądaj więcej filmów