Zapisy całokomórkowe patch-clamp do elektrofizjologicznego oznaczania selektywności jonowej w rodopsynach kanałowych

Ogólnym celem tego eksperymentu jest określenie selektywności chlorkowej nowych kanałów jonowych bramkowanych światłem. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w biofizyce rodopsyn kanałowych, takie jak amplitudy fotoprądów, kinetyka i selektywność jonowa. Główną zaletą tej techniki jest bezpośredni odczyt aktywności kanału biofizycznego, który jest szybki i łatwy do odtworzenia.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby początkujące w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ każdy etap procedury eksperymentalnej, od przygotowania komórek HEK do rejestracji fotoprądów, musi być zoptymalizowany. Wysiew i transsekcja komórek HEK zostanie zademonstrowana przez Altinę Klein. Aby rozpocząć tę procedurę, zważ składniki stałe na 100 mililitrów roztworów wewnątrzkomórkowych i 500 mililitrów zewnątrzkomórkowych roztworów buforowych w oddzielnych zlewkach.

A następnie dodaj odpowiednią ilość przygotowanych roztworów podstawowych. Następnie dodaj ultraczystą wodę i ostrożnie dostosuj pH za pomocą kwasów i zasad. Następnie dostosuj osmolarność z glukozą do 290 miliosmoli i 320 miliosmoli odpowiednio dla roztworów wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych.

W tej procedurze umieść do trzech szkiełek pokrywowych pokrytych lizyną obok siebie na 35-milimetrowej szalce Petriego. Następnie wysiewaj 1,5 razy 10 do piątych komórek HEK w dwóch mililitrach standardowego DMEM uzupełnionego 10% FBS i jednym mikromolowym retinolem w każdym naczyniu. Aby transfekować komórki dla każdej potrawy, przygotuj roztwór dwóch mikrogramów plazmidowego DNA w 250 mikrolitrach DMEM bez FBS i sześciu mikrolitrach odczynnika do transfekcji.

Po 15 minutach inkubacji delikatnie dodaj roztwór do komórek. Przed pomiarem wyciągnij kilka pipet krosowych o niskiej rezystancji za pomocą ściągacza do mikropipet i wypoleruj je ogniowo. Pipety należy przechowywać w pojemniku bezpyłowym na dzień pomiaru.

Na 30 minut przed nagraniami włącz wszystkie elementy konfiguracji, aby nagrzały się do temperatury roboczej. Upewnij się, że mają temperaturę pokojową. Na początek uszczelnij komorę pomiarową silikonem, aby zapobiec wyciekowi zewnętrznego bufora.

Następnie umieść jedno szkiełko nakrywkowe w komorze i zamknij je. Ostrożnie napełnij komorę buforem zewnątrzkomórkowym, aby zapobiec oderwaniu się komórek. Przechowywać szalkę Petriego wraz z innymi szkiełkami nakrywkowymi w inkubatorze do następnego zestawu doświadczeń.

Następnie umieść komorę pomiarową pod mikroskopem za pomocą obiektywu 40X do wizualizacji komórek. Następnie umieść mostek ślimakowy na elektrodzie kąpieli i umieść go w komorze razem z czujnikiem poziomu płynu i wylotem perfuzyjnym manipulatora wanny. Roztwór zewnątrzkomórkowy należy wymienić dwukrotnie na jeden mililitr świeżego roztworu zewnętrznego, aby usunąć pozostałą pożywkę hodowlaną i oderwane komórki.

Ustaw ostrość komórek i poszukaj transfekowanej komórki, którą należy odizolować od innych komórek. Następnie użyj trójpasmowego zestawu filtrów i pomarańczowego światła, aby wzbudzić i zobrazować mCherry. Następnie napełnij jedną z wyciągniętych pipet roztworem wewnątrzkomórkowym.

I usuń pęcherzyki powietrza, obracając pipetę kilka razy. Następnie zamontuj pipetę na uchwycie pipety i zastosuj pewne nadciśnienie, aby zapobiec zatkaniu końcówki. Umieść końcówkę pipety do plastrów pod mikroskopem i przesuń ją w pobliże celi za pomocą mikromanipulatora.

W oprogramowaniu do akwizycji danych uruchom test membrany w trybie kąpieli i zastosuj krok napięcia. Sprawdź, czy rezystancja pipety mieści się w żądanym zakresie od 1,3 do 3,0 megaomów. Następnie wyzeruj prądy przesunięcia i wyreguluj potencjał pipety, obracając pokrętło przesunięcia pipety na amplifier.

Aby utworzyć plaster w konfiguracji całej komórki, powoli podejdź do celi z pipetą z plastrem od góry i zwolnij nadciśnienie tuż przed dotknięciem celi. Czasami konfiguracja dołączona do komórki tworzy się po tym. Po zbliżeniu się do komórki zmień test membranowy z trybu kąpieli na tryb łatowy.

Skompensuj pojemność pipety, obracając pokrętło kompensacji pojemności pipety, aby uzyskać płaską odpowiedź impulsu testowego. Przełącz test membranowy w tryb komórkowy. Następnie rozerwij plaster bez niszczenia uszczelki, stosując krótkie impulsy podciśnienia lub podciśnienia o rosnącej sile, aby uzyskać potwierdzenie całej komórki.

Rozpocznij kompensację rezystancji szeregowej, ustawiając dwa parametry całego ogniwa, pojemność ogniwa i rezystancję szeregową. W szeregowym panelu kompensacji rezystancji włącz predykcję i korektę do 90%Następnie włącz przełącznik kompensacji całego ogniwa i dostosuj parametry całego ogniwa w sposób iteracyjny, aby uzyskać idealnie płaską odpowiedź testu uszczelnienia. Po ustaleniu konfiguracji całej komórki należy odczekać co najmniej dwie minuty przed zapisem, aby zapewnić wystarczającą wymianę roztworu wewnątrzkomórkowego przez pipetę z plastrem.

Rejestruj prądy indukowane światłem o różnych potencjałach utrzymywania. Następnie należy wymienić bufor zewnątrzkomórkowy na niski poziom chlorku w komorze co najmniej pięć razy bez niszczenia łaty i zapisać kolejną zależność napięcia prądu przy nowym stężeniu chlorku. Rysunek ten pokazuje, że podczas świecenia zielonym światłem, PsACR1 charakteryzuje się szybkim prądem przejściowym, który szybko zanika do stacjonarnego poziomu prądu.

Po wyłączeniu światła fotoprądy zanikają do zera w ciągu milisekund. Zmniejszenie stężenia chlorku zewnątrzkomórkowego całkowicie znosi prądy foto skierowane na zewnątrz. Zamiana zewnątrzkomórkowego stężenia chlorku powoduje przesunięcie potencjału odwrócenia, który można wywnioskować z wykresu napięcia prądu.

Ocena potencjałów odwrócenia na podstawie wielu pomiarów określa ilościowo dramatyczne przesunięcie potencjału odwrócenia spowodowane zmianą zewnętrznego stężenia chlorków. Uderzające jest to, że zmierzone potencjały odwrócenia bezpośrednio odpowiadają obliczonym potencjałom Nernst dla chlorków, co potwierdza wysoką selektywność chlorkową PsACR1. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać elektrofizjologiczne zapisy fotoprądów indukowanych światłem na komórkach HEK eksprymujących rodopsynę kanałową.

Po opanowaniu całej procedury można wykonać w ciągu czterech dni, podczas gdy rejestracja fotoprądów trwa kilka godzin. Uzupełnieniem tej procedury może być mutageneza ukierunkowana i metody spektroskopowe w celu dalszego wyjaśnienia cech strukturalnych i mechanizmów komórkowych rodopsyn kanałowych. Charakterystyka i inżynieria molekularna rodopsyny kanałowej utorowały drogę naukowcom z dziedziny neurobiologii do manipulowania pobudliwością wybranych neuronów za pomocą światła.