Pomiar funkcjonalności połączenia nerwowo-mięśniowego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest badanie funkcjonalności złącza nerwowo-mięśniowego z wykorzystaniem eksperymentalnego podejścia ex vivo. Jest to realizowane poprzez stymulację preparatu nerwu i mięśnia na dwa sposoby: bezpośrednio w błonie mięśniowej oraz poprzez nerw. Ponieważ stymulacja błony omija sygnalizację neurotransmisyjną, wszelkie różnice między dwiema odpowiedziami skurczowymi mogą być uznane za pośredni pomiar funkcjonalności złącza nerwowo-mięśniowego.

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy procedurę przeprowadzoną na preparacie mięśnia soleus wraz z nerwem kulszowym. Mięsień zostaje wypreparowany wraz z unerwieniem i umieszczony w perfuzjowanej kąpieli tkankowej. Jest on przymocowany do kontrolera siły i długości, a para elektrod platynowych zostaje umieszczona równolegle do mięśnia.

Następnie szklaną elektrodę ssącą zbliża się do przeciętego końca nerwu. W celu dokładnej oceny funkcjonalności zarówno złącza nerwowo-mięśniowego, jak i mięśnia, stosuje się kompleksowy protokół testowy. Funkcjonalne połączenie między mięśniem a nerwem jest konkluzją dla obu części i dwóch ocalałych frakcji.

W pierwszym obszarze poziomu każdej z dwóch tkanek komunikują się złącza nerwowo-mięśniowe, które zazwyczaj wykazują morfologię przypominającą nacisk. Niemniej jednak w kilku stanach patologicznych funkcjonalna interakcja między mięśniem a nerwem jest poważnie zaburzona, a złącza nerwowo-mięśniowe tracą swoją złożoną organizację morfologiczną. Ogólnym celem naszej procedury jest zbadanie funkcjonalności złącza nerwowo-mięśniowego z wykorzystaniem podejścia eksperymentalnego ex vivo.

Osiąga się to poprzez stymulację preparatu nerwu i mięśnia na dwa sposoby. Pierwszy polega na bezpośredniej stymulacji błony mięśniowej, a drugi na stymulacji nerwu w celu analizy właściwości mięśnia. Włącz cyrkulacyjną kąpiel wodną i ustaw temperaturę na 30 °C.

Napełnij kąpiel roztworem Krebsa-Ringera. Pozwól, aby mieszanina gazów pod ciśnieniem 0,4 bar przepływała przez oxitube do kąpieli. Włącz przetwornik siłownika oraz dwa stymulatory impulsowe.

Ustaw wartości prądu na 300 milionów par dla stymulacji błony oraz na pięć milionów par dla stymulacji nerwu. Po uśmierceniu myszy poprzez zwichnięcie stawów szyjnych, usuń skórę z kończyn dolnych. Następnie przetnij ścięgno Achillesa i, mocno zaciskając ścięgno, pociągnij mięsień brzuchaty łydki oraz mięsień płaszczowaty wspólnie w górę.

Po odsłonięciu bliższego odcinka ścięgna mięśnia płaszczowatego należy odciąć całą łydkę powyżej niego i szybko umieścić próbkę w kąpieli tkankowej do preparacji znajdującej się pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą pęsety należy mocno zacisnąć bliższy odcinek ścięgna mięśnia płaszczowatego i delikatnie go pociągnąć, aby odsłonić unerwienie nerwem kulszowym. Po odsłonięciu unerwienia należy usunąć otaczające tkanki, aby odsłonić około pięciu milimetrów nerwu.

Następnie za pomocą precyzyjnych nożyczek ostrożnie przetnij nerw. Zakończ wycięcie mięśnia i nerwu, przecinając ścięgno Achillesa, aby oddzielić mięsień płaszczkowaty od mięśnia brzuchatego. Teraz preparat mięśnia i nerwu jest gotowy do zamontowania w aparaturze testowej.

Wykonaj pętlę poślizgową na końcu nylonowej nici i zaciśnij ją wokół ścięgna Achillesa. Zamocuj proksymalny koniec ścięgna w stałym zacisku, a nylonową nić przywiąż do ramienia dźwigni przetwornika siły. Pozostaw mięsień do czasu osiągnięcia stanu równowagi w roztworze.

Aby wyznaczyć początkową długość optymalną, stymuluj mięsień serią pojedynczych impulsów, stopniowo zmieniając wartość obciążenia pełzającego. Długość optymalna zostaje osiągnięta, gdy siła skurczu pojedynczego jest maksymalna. Umieść elektrody ssące w pobliżu mięśnia i wciągnij nerw.

Następnie, delikatnie zmieniając wartość prądu impulsowego, stymuluj mięsień serią pojedynczych impulsów. Siła skurczu generowana przez mięsień podczas stymulacji poprzez nerw powinna być równa wartościom zmierzonym podczas stymulacji błony. Po ustaleniu optymalnej wartości prądu, wysuń nerw z elektrody i podaj kilka impulsów prądu.

Jeśli wartość wcześniej wybranego natężenia prądu jest zbyt wysoka, impulsy prądowe dostarczane przez elektrodę ssącą wywołują skurcz mięśnia poprzez przewodzenie prądu przez kąpiel. Przy użyciu autorskiego oprogramowania opracowaliśmy zautomatyzowany protokół testowy do badania funkcjonalności złącza nerwowo-mięśniowego mięśnia płaszczowatego. Protokół trwa około 65 minut i składa się z czterech różnych części.

W pierwszej części mięsień jest stymulowany czterema pojedynczymi impulsami. Dwa są podawane bezpośrednio, a dwa poprzez nerw. Następnie z odpowiedzi drgawkowych mierzy się czas do osiągnięcia szczytu, czas połowy rozkurczu, maksymalną wartość pochodnej siły oraz siłę skurczu pojedynczego.

W drugiej części mięsień jest stymulowany serią pociągów impulsów o częstotliwości od 20 hertz do 80 hertz, która stanowi częstotliwość tężcową. Służy to do wyznaczenia krzywych zależność siły od częstotliwości zarówno dla stymulacji nerwu, jak i stymulacji bezpośredniej. W trzeciej i czwartej części protokołu mięsień poddawany jest dwóm paradygmatom zmęczeniowym w celu pomiaru niewydolności neurotransmisji oraz zmęczenia wewnątrz tężcowego.

Podczas tych paradygmatów zmęczeniowych mięsień jest stymulowany w sposób ciągły za pomocą jednego pociągu impulsów podanego na błonę, po którym następują 14 pociągów impulsów podanych przez nerw. Cała sekwencja jest powtarzana 20 razy. Pierwszy paradygmat jest realizowany przy częstotliwości wyładowań 35 hertz.

Drugie w częstotliwości tetanicznej wynoszącej 80 hertz. Uważa się, że niewydolność przekaźnictwa nerwowego odgrywa istotną rolę w rozwoju zmęczenia, ponieważ jest ona związana z zewnętrzną blokadą propagacji potencjału czynnościowego, zmniejszonym uwalnianiem neurotransmiterów oraz obniżoną pobudliwością płytki końcowej w kontekście zmęczenia złącza. Innym aspektem zmęczenia złącza nerwowo-mięśniowego jest wyraźnie zaznaczone zmęczenie wewnątrztetaniczne, które stanowi miarę zdolności mięśnia do utrzymania siły podczas pojedynczego skurczu tetanicznego i odzwierciedla zmęczenie wysokoczęstotliwościowe.

Na koniec protokołu, przy użyciu suwmiarki analogowej i wagi precyzyjnej, mierzy się wypadkową długość i masę mięśnia w celu obliczenia pola przekroju poprzecznego mięśnia. Badania przeprowadzone na transgenicznym modelu mysim SOD1 w stwardnieniu zanikowym bocznym podkreśliły potencjał tej metodologii. W rzeczywistości transgeniczne mięśnie płaszczowate wykazują zmniejszoną odpowiedź skurczową zarówno w odniesieniu do pochodnej siły, jak i siły tetanicznej podczas bezpośredniej stymulacji, a jeszcze większy spadek obserwuje się przy stymulacji poprzez nerw.

W odniesieniu na przykład do siły tężcowej, eksperymenty te wykazały, że kurczliwość mięśni odpowiada za 25% uszkodzeń, podczas gdy kolejne 45% wiąże się z zaburzeniami neurotransmisji. Kolejnym interesującym spostrzeżeniem jest brak jakichkolwiek różnic w mięśniach kontrolnych przy stymulacji bezpośredniej lub pośredniej. Wynik ten dowodzi, że zastosowana metodologia nie wywołuje artefaktów technicznych, ponieważ w zwierzętach kontrolnych połączenia nerwowo-mięśniowe powinny być w pełni funkcjonalne.

W odniesieniu do zmęczenia wewnątrztetanicznego, wyniki wykazały znacznie niższe wartości w transgenicznych mięśniach płaszczkowatych niż w ich kontrolnych odpowiednikach. Co ciekawe, transgeniczny mięsień płaszczkowaty ulega znacznemu uszkodzeniu w wyniku stymulacji powtarzalnej, co oznacza, że funkcjonalność złącza nerwowo-mięśniowego można oceniać przez maksymalny czas stymulacji wynoszący osiem minut. Po ośmiu minutach, w odpowiedzi na stymulację, transgeniczny mięsień powraca do wartości siły bliskiej zeru.

Po obejrzeniu filmu powinni Państwo zrozumieć, jak mierzyć funkcjonalność złącza nerwowo-mięśniowego i mięśnia płaszczowatego myszy. Biorąc pod uwagę, że technika ta opiera się na pośrednim pomiarze funkcjonalności złącza nerwowo-mięśniowego, nie pozwala ona na ustalenie, czy zgłaszane defekty są związane ze zmianami morfologicznymi czy biochemicznymi. Z drugiej strony, podejście to stanowi kluczowy sposób oceny, czy agresje te wpływają na końcową funkcjonalność sygnału neurotransmisji.

Wreszcie, proponowany protokół można łatwo dostosować do pomiaru funkcjonalności złącza nerwowo-mięśniowego przepony, innego mięśnia często zajmowanego w procesach chorobowych.