Name: Pomiar funkcjonalności połączenia nerwowo-mięśniowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Poznaj metodę oceny funkcjonalności złącza nerwowo-mięśniowego przy użyciu preparatów nerwowo-mięśniowych ex vivo. Protokół obejmuje stymulację bezpośrednią i przez nerw w celu analizy odpowiedzi skurczowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca w laboratorium autorów była wspierana przez Fondazione Roma i Telethon (grant nr. GGP14066).

<ol><li>Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%26%2334%3Bdying-back%26%2334%3B+phenomenon+of+motor+neurons+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The &#34;dying-back&#34; phenomenon of motor neurons in ALS.</a> J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).</li>
<li>Dobrowolny, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+Muscle+Is+a+Primary+Target+of+SOD1G93A-Mediated+Toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity.</a> Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).</li>
<li>Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+improve+neuromuscular+transmission+in+the+adult+rat+diaphragm%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm.</a> Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).</li>
<li>Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivity-induced+remodeling+of+neuromuscular+junctions+in+rat+diaphragmatic+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle.</a> Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).</li>
<li>Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relationships+in+rodent+diaphragm+muscle+fibers+vs.+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions.</a> Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).</li>
<li>Van Lunteren, E., Moyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+DAP+on+diaphragm+force+and+fatigue%2C+including+fatigue+due+to+neurotransmission+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure.</a> J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).</li>
<li>Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adverse+effects+of+myasthenia+gravis+on+rat+phrenic+diaphragm+contractile+performance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance.</a> J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).</li>
<li>Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscles+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy+show+profound+defects+in+neuromuscular+development+even+in+the+absence+of+failure+in+neuromuscular+transmission+or+loss+of+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons.</a> Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).</li>
<li>Personius, K. E., Sawyer, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+and+failure+of+neurotransmission+in+the+diaphragm+of+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disord%22%5BJournal%5D)">Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice.</a> Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).</li>
<li>Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+myosin+Va+in+the+plasticity+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo.</a> PLoS ONE. 3 (12), e3871(2008).</li>
<li>Chevessier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+congenital+myasthenic+syndrome+due+to+MuSK+mutations+reveals+defects+in+structure+and+function+of+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions.</a> Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).</li>
<li>Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+acetylcholinesterase+overexpression+induces+multilevelled+aberrations+in+mouse+neuromuscular+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology.</a> J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).</li>
<li>Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+contribution+of+neurotransmission+failure+to+diaphragm+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%28Bethesda%2C+Md%3A+1985%29%22%5BJournal%5D)">Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue.</a> J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).</li>
<li>Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mechanical+properties%2C+including+isotonic+fatigue%2C+of+fast+and+slow+MLC%2FmIgf-1+transgenic+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle.</a> Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).</li>
<li>Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+power+output+of+fast+and+slow+skeletal+muscles+from+mdx+mice+6-28+months+old%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old.</a> J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).</li>
<li>Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+skeletal+muscles+from+young%2C+adult+and+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice.</a> J Physiol. 404, 71-82 (1988).</li>
<li>Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+power+output+of+diaphragm+muscle+strips+from+mdx+and+control+mice+after+clenbuterol+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment.</a> Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).</li>
<li>Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Neuromuscular+Junction+Functionality+in+the+SOD1+G93A+Animal+Model+of+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng+%22%5BJournal%5D)">Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Ann Biomed Eng . 43, (2015).</li>
<li>Soliani, L. <a target="_blank" href="http://www.dsa.unipr.it/soliani/soliani.html">Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche</a>. , (2004).</li>
<li>Gurney, M. E., Pu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu%2CZn+superoxide+dismutase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany powyżej protokół eksperymentalny zapewnia idealny sposób pomiaru i rozróżniania wszelkich zmian funkcjonalnych, które wystąpiły bezpośrednio w mięśniu lub pośrednio na poziomie połączenia nerwowo-mięśniowego. Ponieważ technika ta opiera się na pośrednim pomiarze funkcjonalności NMJ, nie można jej wykorzystać do ustalenia, czy jakakolwiek wada jest związana ze zmianami morfologicznymi czy zmianami biochemicznymi. W przeciwieństwie do tego, zapewnia skuteczny sposób określenia, czy jakiekolwiek zmiany morfologiczne...

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) to synapsa chemiczna utworzona przez połączenie między motoryczną płytką końcową włókna mięśniowego a zakończeniem aksonu neuronu ruchowego. Wykazano, że NMJ odgrywa kluczową rolę, gdy komunikacja między mięśniami a nerwami jest upośledzona, jak ma to miejsce w starzeniu się lub stwardnieniu zanikowym bocznym (ALS). Ponieważ mięśnie i nerwy komunikują się w sposób dwukierunkowy1,2, możliwość pomiaru wad NMJ oddzielnie od wad mięśniowych może dostarczyć nowych informacji na temat ich fizjologicznych wzajemnych oddziaływań. Rzeczywiście, ta ocena funkcjonalna może pomóc w ocenie, czy zmiany morfologiczne lub biochemiczne zmniejszają funkcjonalność sygnalizacji neurotransmisyjnej.
Porównanie reakcji skurczowej mięśni wywołanej przez stymulację nerwów i reakcji tego samego mięśnia wywołanej bezpośrednią stymulacją jego błony zostało zaproponowane jako pośredni pomiar funkcjonalności NMJ. Rzeczywiście, ponieważ stymulacja błony omija sygnalizację neurotransmisyjną, wszelkie różnice w dwóch reakcjach skurczowych można przypisać zmianom w NMJ. To podejście zostało szeroko zaproponowane dla rats3,4,5,6,7, a także używane do zbierania informacji o modelach myszy8,9,10,11,12.
Tutaj szczegółowo opisujemy procedurę wycinania i testowania dwóch preparatów mięśniowo-nerwowych, tj. preparatów płaszczkowato-kulszowych i przeponowo-przeponowych. Korzystając z niestandardowego oprogramowania, zaprojektowaliśmy protokół ciągłego testowania, który łączy pomiar kilku parametrów charakteryzujących zarówno NMJ, jak i funkcjonalność mięśni, uzyskując w ten sposób kompleksową ocenę uszkodzenia NMJ oddzielnie od uszkodzenia mięśni. W szczególności protokół mierzy siłę skurczu, kinetykę mięśni, krzywą siła-częstotliwość dla stymulacji bezpośredniej i nerwowej, awarię neurotransmisji13 zarówno dla częstotliwości odpalania, jak i tężcowej, oraz zmęczenie śródtężcowe7.

<table><tbody><tr><td>System dźwigni dwutrybowych&nbsp;</td><td>Aurora Scientific Inc.</td><td>Siłownik/przetwornik</td> <td>300B</td></tr><tr><td>Stymulator dwufazowy dużej mocy&nbsp;</td><td>Aurora Scientific Inc.</td><td>701B</td><td>Stymulator impulsów (nerw)</td></tr><tr><td>Stymulator dwufazowy o dużej mocy&nbsp;</td><td>Aurora Scientific Inc.</td>Stymulator impulsów <td>701C</td><td>(mięsień)</td></tr><tr><td>Aparat mięśniowy in vitro&nbsp;</td><td>Aurora Scientific Inc.</td><td>800A Przygotowawcza</td><td></td></tr><tr><td>kąpiel tkankowa</td><td>Radnoti</td><td>158400</td><td></td></tr><tr><td>Monopolarna elektroda ssąca</td><td>A-M Systems</td><td>573000</td><td>z domowym odniesieniem&nbsp;</td></tr><tr><td>Oscyloskop&nbsp;</td><td>Tektronix</td><td>TDS2014</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ 800</td><td></td></tr><tr><td>Oświetlacz zimnego światła&nbsp;</td><td>Photonic Optics</td><td>PL 3000</td><td></td></tr><tr><td>Płytka akwizycyjna</td><td>National Instruments</td><td>NI PCIe-6353</td><td></td></tr><tr><td>Blok złączy</td><td>National Instruments</td><td>NI 2110</td><td></td></tr><tr><td>Komputer osobisty</td><td>AMD Phenom II x4 970</td><td></td><td>Procesor 3,50 Ghz z oprogramowaniem Windows 7</td></tr><tr><td>LabView 2012</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Krebs-Ringer Wodorowęglan Bufor&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4002&nbsp;</td><td>bufor fizjologiczny</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td>bezwodny, proszek, &ge; 97%</td></tr><tr><td>Bufor HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>&ge; 99,5% (miareczkowanie)</td></tr><tr><td>Naczynia 60mm x 15mm</td><td>Falcon</td><td>353004</td><td>Polistyren</td></tr><tr><td>Silikon</td><td>Sylgard&nbsp;</td><td>184 Silikon&nbsp;</td><td>Zestaw elastomerów&nbsp; 0,5 kg.</td></tr><tr><td>Termostat</td><td>Dennerle</td><td>DigitalDuomat 1200</td><td></td></tr><tr><td>Pompa</td><td>Newa Mini</td><td>MN 606</td><td>do akwarium</td></tr><tr><td>Odporność na ciepło Thermocable</td><td>Lucky Reptile</td><td>61403-1</td><td>50/60Hz 50W</td></tr><tr><td>Wiadro</td><td>dowolne 10 litrów</td><td></td><td>Polipropylen</td></tr><tr><td>O2 + 5%CO2</td><td>siad</td><td></td><td>Mix gas</td></tr><tr><td>#5 Kleszcze&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>2 items</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe - ostrza 8 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td>wycinanie nerwów</td></tr><tr><td>Ostre nożyczki&nbsp;</td><td>Narzędzia naukowe&nbsp;</td><td>14059-11</td><td>usuwanie mięśni</td></tr><tr><td>Delikatne nożyczki</td><td>Wagner</td><td>02.06.32</td><td>zewnętrzna</td></tr><tr><td>rękojeść skalpela studenckiego #3</td><td>Narzędzia do nauki pięknej&nbsp;</td><td>91003-12&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza skalpela #10</td><td>Narzędzia do nauki pięknej&nbsp;</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza skalpela #11</td><td>Narzędzia do nauki pięknej&nbsp;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>drut nylonowy i Oslash; 0,16 mm</td><td>dowolna</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar funkcjonalności połączenia nerwowo-mięśniowego

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Funkcjonalność połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) odgrywa kluczową rolę podczas badania chorób, w których komunikacja między neuronem ruchowym a mięśniami jest zaburzona, takich jak starzenie się i stwardnienie zanikowe boczne (ALS). Tutaj opisujemy protokół eksperymentalny, który można wykorzystać do pomiaru funkcjonalności NMJ poprzez połączenie dwóch rodzajów stymulacji elektrycznej: bezpośredniej stymulacji błony mięśniowej i stymulacji przez nerw. Porównanie reakcji mięśni na te dwie różne stymulacje może pomóc w zdefiniowaniu, na poziomie funkcjonalnym, potencjalnych zmian w NMJ, które prowadzą do funkcjonalnego pogorszenia stanu mięśni.
Ex vivo preparaty są odpowiednie do dobrze kontrolowanych badań. Tutaj opisujemy intensywny protokół pomiaru kilku parametrów funkcjonalności mięśni i NMJ dla przygotowania nerwu płaszczkowato-kulszowego oraz dla przygotowania nerwu przeponowo-przeponowego. Protokół trwa około 60 minut i jest prowadzony w sposób nieprzerwany za pomocą specjalnie przygotowanego oprogramowania, które mierzy właściwości kinetyki drgań, stosunek siły do częstotliwości zarówno dla stymulacji mięśni, jak i nerwów oraz dwa parametry specyficzne dla funkcjonalności NMJ, tj. awarię neurotransmisji i zmęczenie śródtężcowe. Metodologia ta została wykorzystana do wykrycia uszkodzeń w preparatach mięśniowo-nerwowych płaszczkowatych i przeponowych przy użyciu transgenicznej myszy SOD1G93A, eksperymentalnego modelu ALS, który wszechobecnie wykazuje nadekspresję zmutowanego enzymu przeciwutleniającego dysmutazy ponadtlenkowej 1 (SOD1).

Opisany protokół dostarcza informacji na temat funkcjonalnej denervacji w przypadku różnych chorób neuromięśniowych lub sarkopenii związanej z wiekiem. Protokół ten może być wykorzystany do ustalenia, czy (i jeśli tak, na jakim poziomie) zmiany mięśniowe wynikają z wybiórczych zmian zachodzących w samym mięśniu czy w przekazywaniu sygnału nerwowo-mięśniowego. Dane przedstawione poniżej są wynikami wcześniejszej pracy naszego zespołu18, przeprowadzonej na transgenic...

Ocena funkcjonalna połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) może dostarczyć istotnych informacji na temat komunikacji między mięśniem a nerwem. W tym miejscu opisujemy protokół kompleksowej oceny zarówno NMJ, jak i funkcjonalności mięśni przy użyciu dwóch różnych preparatów mięśniowo-nerwowych, tj. płaszczkowato-kulszowego i przeponowo-przeponowego.

Pomiar funkcjonalności połączenia nerwowo-mięśniowego

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest badanie funkcjonalności złącza nerwowo-mięśniowego z wykorzystaniem eksperymentalnego podejścia ex vivo. Jest to realizowane poprzez stymulację preparatu nerwu i mięśnia na dwa sposoby: bezpośrednio w błonie mięśniowej oraz poprzez nerw. Ponieważ stymulacja błony omija sygnalizację neurotransmisyjną, wszelkie różnice między dwiema odpowiedziami skurczowymi mogą być uznane za pośredni pomiar funkcjonalności złącza nerwowo-mięśniowego.W niniejszym opracowaniu przedstawiamy procedurę przeprowadzoną na preparacie mięśnia soleus wraz z nerwem kulszowym. Mięsień zostaje wypreparowany wraz z unerwieniem i umieszczony w perfuzjowanej kąpieli tkankowej. Jest on przymocowany do kontrolera siły i długości, a para elektrod platynowych zostaje umieszczona równolegle do mięśnia.Następnie szklaną elektrodę ssącą zbliża się do przeciętego końca nerwu. W celu dokładnej oceny funkcjonalności zarówno złącza nerwowo-mięśniowego, jak i mięśnia, stosuje się kompleksowy protokół testowy. Funkcjonalne połączenie między mięśniem a nerwem jest konkluzją dla obu części i dwóch ocalałych frakcji.W pierwszym obszarze poziomu każdej z dwóch tkanek komunikują się złącza nerwowo-mięśniowe, które zazwyczaj wykazują morfologię przypominającą nacisk. Niemniej jednak w kilku stanach patologicznych funkcjonalna interakcja między mięśniem a nerwem jest poważnie zaburzona, a złącza nerwowo-mięśniowe tracą swoją złożoną organizację morfologiczną. Ogólnym celem naszej procedury jest zbadanie funkcjonalności złącza nerwowo-mięśniowego z wykorzystaniem podejścia eksperymentalnego ex vivo.Osiąga się to poprzez stymulację preparatu nerwu i mięśnia na dwa sposoby. Pierwszy polega na bezpośredniej stymulacji błony mięśniowej, a drugi na stymulacji nerwu w celu analizy właściwości mięśnia. Włącz cyrkulacyjną kąpiel wodną i ustaw temperaturę na 30 °C.Napełnij kąpiel roztworem Krebsa-Ringera. Pozwól, aby mieszanina gazów pod ciśnieniem 0,4 bar przepływała przez oxitube do kąpieli. Włącz przetwornik siłownika oraz dwa stymulatory impulsowe.Ustaw wartości prądu na 300 milionów par dla stymulacji błony oraz na pięć milionów par dla stymulacji nerwu. Po uśmierceniu myszy poprzez zwichnięcie stawów szyjnych, usuń skórę z kończyn dolnych. Następnie przetnij ścięgno Achillesa i, mocno zaciskając ścięgno, pociągnij mięsień brzuchaty łydki oraz mięsień płaszczowaty wspólnie w górę.Po odsłonięciu bliższego odcinka ścięgna mięśnia płaszczowatego należy odciąć całą łydkę powyżej niego i szybko umieścić próbkę w kąpieli tkankowej do preparacji znajdującej się pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą pęsety należy mocno zacisnąć bliższy odcinek ścięgna mięśnia płaszczowatego i delikatnie go pociągnąć, aby odsłonić unerwienie nerwem kulszowym. Po odsłonięciu unerwienia należy usunąć otaczające tkanki, aby odsłonić około pięciu milimetrów nerwu.Następnie za pomocą precyzyjnych nożyczek ostrożnie przetnij nerw. Zakończ wycięcie mięśnia i nerwu, przecinając ścięgno Achillesa, aby oddzielić mięsień płaszczkowaty od mięśnia brzuchatego. Teraz preparat mięśnia i nerwu jest gotowy do zamontowania w aparaturze testowej.Wykonaj pętlę poślizgową na końcu nylonowej nici i zaciśnij ją wokół ścięgna Achillesa. Zamocuj proksymalny koniec ścięgna w stałym zacisku, a nylonową nić przywiąż do ramienia dźwigni przetwornika siły. Pozostaw mięsień do czasu osiągnięcia stanu równowagi w roztworze.Aby wyznaczyć początkową długość optymalną, stymuluj mięsień serią pojedynczych impulsów, stopniowo zmieniając wartość obciążenia pełzającego. Długość optymalna zostaje osiągnięta, gdy siła skurczu pojedynczego jest maksymalna. Umieść elektrody ssące w pobliżu mięśnia i wciągnij nerw.Następnie, delikatnie zmieniając wartość prądu impulsowego, stymuluj mięsień serią pojedynczych impulsów. Siła skurczu generowana przez mięsień podczas stymulacji poprzez nerw powinna być równa wartościom zmierzonym podczas stymulacji błony. Po ustaleniu optymalnej wartości prądu, wysuń nerw z elektrody i podaj kilka impulsów prądu.Jeśli wartość wcześniej wybranego natężenia prądu jest zbyt wysoka, impulsy prądowe dostarczane przez elektrodę ssącą wywołują skurcz mięśnia poprzez przewodzenie prądu przez kąpiel. Przy użyciu autorskiego oprogramowania opracowaliśmy zautomatyzowany protokół testowy do badania funkcjonalności złącza nerwowo-mięśniowego mięśnia płaszczowatego. Protokół trwa około 65 minut i składa się z czterech różnych części.W pierwszej części mięsień jest stymulowany czterema pojedynczymi impulsami. Dwa są podawane bezpośrednio, a dwa poprzez nerw. Następnie z odpowiedzi drgawkowych mierzy się czas do osiągnięcia szczytu, czas połowy rozkurczu, maksymalną wartość pochodnej siły oraz siłę skurczu pojedynczego.W drugiej części mięsień jest stymulowany serią pociągów impulsów o częstotliwości od 20 hertz do 80 hertz, która stanowi częstotliwość tężcową. Służy to do wyznaczenia krzywych zależność siły od częstotliwości zarówno dla stymulacji nerwu, jak i stymulacji bezpośredniej. W trzeciej i czwartej części protokołu mięsień poddawany jest dwóm paradygmatom zmęczeniowym w celu pomiaru niewydolności neurotransmisji oraz zmęczenia wewnątrz tężcowego.Podczas tych paradygmatów zmęczeniowych mięsień jest stymulowany w sposób ciągły za pomocą jednego pociągu impulsów podanego na błonę, po którym następują 14 pociągów impulsów podanych przez nerw. Cała sekwencja jest powtarzana 20 razy. Pierwszy paradygmat jest realizowany przy częstotliwości wyładowań 35 hertz.Drugie w częstotliwości tetanicznej wynoszącej 80 hertz. Uważa się, że niewydolność przekaźnictwa nerwowego odgrywa istotną rolę w rozwoju zmęczenia, ponieważ jest ona związana z zewnętrzną blokadą propagacji potencjału czynnościowego, zmniejszonym uwalnianiem neurotransmiterów oraz obniżoną pobudliwością płytki końcowej w kontekście zmęczenia złącza. Innym aspektem zmęczenia złącza nerwowo-mięśniowego jest wyraźnie zaznaczone zmęczenie wewnątrztetaniczne, które stanowi miarę zdolności mięśnia do utrzymania siły podczas pojedynczego skurczu tetanicznego i odzwierciedla zmęczenie wysokoczęstotliwościowe.Na koniec protokołu, przy użyciu suwmiarki analogowej i wagi precyzyjnej, mierzy się wypadkową długość i masę mięśnia w celu obliczenia pola przekroju poprzecznego mięśnia. Badania przeprowadzone na transgenicznym modelu mysim SOD1 w stwardnieniu zanikowym bocznym podkreśliły potencjał tej metodologii. W rzeczywistości transgeniczne mięśnie płaszczowate wykazują zmniejszoną odpowiedź skurczową zarówno w odniesieniu do pochodnej siły, jak i siły tetanicznej podczas bezpośredniej stymulacji, a jeszcze większy spadek obserwuje się przy stymulacji poprzez nerw.W odniesieniu na przykład do siły tężcowej, eksperymenty te wykazały, że kurczliwość mięśni odpowiada za 25% uszkodzeń, podczas gdy kolejne 45% wiąże się z zaburzeniami neurotransmisji. Kolejnym interesującym spostrzeżeniem jest brak jakichkolwiek różnic w mięśniach kontrolnych przy stymulacji bezpośredniej lub pośredniej. Wynik ten dowodzi, że zastosowana metodologia nie wywołuje artefaktów technicznych, ponieważ w zwierzętach kontrolnych połączenia nerwowo-mięśniowe powinny być w pełni funkcjonalne.W odniesieniu do zmęczenia wewnątrztetanicznego, wyniki wykazały znacznie niższe wartości w transgenicznych mięśniach płaszczkowatych niż w ich kontrolnych odpowiednikach. Co ciekawe, transgeniczny mięsień płaszczkowaty ulega znacznemu uszkodzeniu w wyniku stymulacji powtarzalnej, co oznacza, że funkcjonalność złącza nerwowo-mięśniowego można oceniać przez maksymalny czas stymulacji wynoszący osiem minut. Po ośmiu minutach, w odpowiedzi na stymulację, transgeniczny mięsień powraca do wartości siły bliskiej zeru.Po obejrzeniu filmu powinni Państwo zrozumieć, jak mierzyć funkcjonalność złącza nerwowo-mięśniowego i mięśnia płaszczowatego myszy. Biorąc pod uwagę, że technika ta opiera się na pośrednim pomiarze funkcjonalności złącza nerwowo-mięśniowego, nie pozwala ona na ustalenie, czy zgłaszane defekty są związane ze zmianami morfologicznymi czy biochemicznymi. Z drugiej strony, podejście to stanowi kluczowy sposób oceny, czy agresje te wpływają na końcową funkcjonalność sygnału neurotransmisji.Wreszcie, proponowany protokół można łatwo dostosować do pomiaru funkcjonalności złącza nerwowo-mięśniowego przepony, innego mięśnia często zajmowanego w procesach chorobowych.

measuring-neuromuscular-junction-functionality

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Połączenie nerwowo-mięśniowe Drosophila (NMJ) jest używane jako model do badania morfologii i funkcji synaps. Ten film opisuje ważne cechy, które naukowcy określają ilościowo, aby scharakteryzować NMJ. Przykładowy protokół demonstruje oprogramowanie zdolne do automatycznego wykonywania kwantyfikacji.

Drosophila Kwantyfikacja połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ): metoda oceny morfologii i funkcji synaps

Ten film demonstruje technikę in vivo pomiaru złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) u myszy. Przedstawiono w nim kroki ustawiania elektrod, stymulacji neuronów kończyn przednich, które unerwiają włókna mięśniowe, oraz rejestrowania reakcji mięśni. Technika ta ocenia demielinizację neuronów i funkcjonalną utratę neuronów.

Pomiar złożonych potencjałów czynnościowych mięśni w mięśniach kończyn przednich myszy in vivo

Ten film demonstruje metodę oceny funkcjonalnych połączeń nerwowo-mięśniowych. Za pomocą bioreaktora zawierającego tkankę mięśniową i neurony ruchowe, wraz z mikroskopią fluorescencyjną, wrażliwe na światło kanały w neuronach są stymulowane do generowania sygnałów elektrycznych, powodując skurcze włókien mięśniowych.

Ocena funkcjonalnego połączenia nerwowo-mięśniowego za pomocą jednoczesnej stymulacji optycznej i nagrywania wideo

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest zmienione w różnych stanach, które czasami mogą prowadzić do niewydolności synaptycznej. W niniejszym raporcie opisano metody oparte na mikroskopie fluorescencyjnym do ilościowego określania takich zmian strukturalnych.

Połączenie nerwowo-mięśniowe: pomiar wielkości synaps, fragmentacji i zmian gęstości białek synaptycznych za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej

Protokół opisany w tym artykule wykorzystuje mięsień levator auris longus (LAL) myszy do rejestrowania spontanicznych i wywołanych przez nerwy potencjałów postsynaptycznych (zacisk prądowy) i prądów (zacisk napięcia) w złączu nerwowo-mięśniowym. Zastosowanie tej techniki może dostarczyć kluczowych informacji na temat mechanizmów transmisji synaptycznej w warunkach normalnych i chorobowych.

Dźwigacz Auris Longus Przygotowanie do badania przewodnictwa nerwowo-mięśniowego ssaków w warunkach cęgowania napięciowego

Zdolność do dokładnego wykrywania komponentów połączenia nerwowo-mięśniowego jest kluczowa w ocenie zmian w jego architekturze spowodowanych procesami patologicznymi lub rozwojowymi. Poniżej przedstawiamy pełny opis prostej metody uzyskiwania wysokiej jakości obrazów całych połączeń nerwowo-mięśniowych, które można wykorzystać do wykonywania pomiarów ilościowych.

Rozwarstwienie pojedynczych włókien mięśni szkieletowych do analiz immunofluorescencyjnych i morfometrycznych połączeń nerwowo-mięśniowych w całości

Opisujemy metodę generowania ludzkich jednostek motorycznych w komercyjnie dostępnych urządzeniach mikroprzepływowych poprzez kokulturację ludzkich indukowanych pluripotencjalnych neuronów ruchowych pochodzących z komórek macierzystych z ludzkimi pierwotnymi miotubami pochodzącymi z mezoangioblastów, co prowadzi do powstania funkcjonalnie aktywnych połączeń nerwowo-mięśniowych.

Generacja jednostek motorycznych człowieka z funkcjonalnymi połączeniami nerwowo-mięśniowymi w urządzeniach mikroprzepływowych

Ten protokół opisuje metodę analizy morfometrycznej połączeń nerwowo-mięśniowych za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i STED, która jest używana do ilościowego określania zmian patologicznych w mysich modelach SMA i CMS związanych z ColQ.

Charakterystyka połączeń nerwowo-mięśniowych u myszy za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej

Opisujemy powtarzalny, zautomatyzowany i bezstronny system obrazowania do charakteryzowania funkcji połączeń nerwowo-mięśniowych przy użyciu ludzkiej tkanki mięśniowej i optogenetycznych neuronów ruchowych. System ten pozwala na funkcjonalną kwantyfikację połączeń nerwowo-mięśniowych w czasie i wykrywa zmniejszone funkcje nerwowo-mięśniowe spowodowane przez neurotoksyny i surowicę pacjenta z miastenią.

Inżynieria i charakterystyka modelu optogenetycznego ludzkiego połączenia nerwowo-mięśniowego

Protokół pokazuje metodę badania korelacji przestrzennej między zakończeniami presynaptycznymi, receptorami postsynaptycznymi i okołosynaptycznymi komórkami Schwanna w mięśniu brzuchatym łydki szczura przy użyciu immunohistochemii fluorescencyjnej z różnymi biomarkerami, a mianowicie: neurofilamentem 200, pęcherzykowym transporterem acetylocholiny, alfa-bungarotoksyną i S100.

Wizualizacja cech morfologicznych połączenia nerwowo-mięśniowego w mięśniu brzuchatym łydki przyśrodkowym szczura

W tym badaniu demonstrujemy wyrafinowany protokół elektromiografii pojedynczego włókna (SFEMG), który umożliwia pomiar in vivo transmisji połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) w modelach gryzoni. Opisano podejście krok po kroku do techniki SFEMG, aby umożliwić ilościowe określenie zmienności transmisji NMJ i niewydolności mięśnia brzuchatego łydki szczura.

Stymulowana elektromiografia pojedynczych włókien (SFEMG) do oceny transmisji połączeń nerwowo-mięśniowych w modelach gryzoni

Poznaj metodę oceny funkcjonalności złącza nerwowo-mięśniowego przy użyciu preparatów nerwowo-mięśniowych ex vivo. Protokół obejmuje stymulację bezpośrednią i przez nerw w celu analizy odpowiedzi skurczowych.

Pomiar funkcjonalności połączenia nerwowo-mięśniowego

Przeglądaj więcej filmów