Pomiar funkcjonalności połączenia nerwowo-mięśniowego

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie funkcjonalności połączeń nerwowo-mięśniowych za pomocą podejścia eksperymentalnego ex vivo. Osiąga się to poprzez stymulację przygotowania nerwu mięśniowego na dwa sposoby, bezpośrednio na błonie mięśniowej i przez nerw. Ponieważ stymulacja błony omija sygnalizację przekaźnictwa nerwowego, wszelkie różnice między dwiema reakcjami skurczowymi można uznać za pośredni pomiar funkcjonalności połączenia nerwowo-mięśniowego.

Tutaj przedstawiamy tę procedurę w przygotowaniu nerwu płaszczkowatego kulszowego. Mięsień jest wycinany razem z nerwem i umieszczany w perfundowanej kąpieli tkankowej. Jest przymocowany do kontrolera siły i długości, a platynowa para elektrod jest umieszczona równolegle do mięśnia.

Szklana elektroda ssąca jest następnie przesuwana w pobliże przeciętego końca nerwu. Następnie stosowany jest kompleksowy protokół testowy w celu dokładnej oceny zarówno połączenia nerwowo-mięśniowego, jak i funkcjonalności mięśni. Funkcjonalne połączenie między mięśniem a nerwem jest zakończeniem zarówno dla części, jak i dla dwóch ocalałych frakcji.

W pierwszym obszarze poziomu każdej z dwóch tkanek komunikują, że te połączenie nerwowo-mięśniowe, które normalnie wykazuje ciśnienie jak morfologia. Niemniej jednak w kilku stanach patologicznych funkcja wzajemnego oddziaływania mięśni i nerwów jest poważnie zagrożona, a połączenie nerwowo-mięśniowe traci złożoną organizację morfologiczną. Ogólnym celem naszej procedury jest zbadanie funkcjonalności połączeń nerwowo-mięśniowych przy użyciu podejścia eksperymentalnego ex vivo.

Osiąga się to poprzez stymulację przygotowania nerwów mięśniowych na dwa sposoby. Jeden poprzez bezpośrednią stymulację błony mięśniowej, a drugi poprzez stymulację nerwu i analizę właściwości mięśni. Włącz obiegową łaźnię wodną i ustaw temperaturę na 30 stopni Celsjusza.

Napełnij wannę roztworem Krebsa-Ringera. Pozwolić, aby punkt O mieszaniny gazów o czterech barach przepłynął przez oksyrurkę i trafił do kąpieli. Włącz przetwornik siłownika i dwa stymulatory impulsów.

Ustaw bieżące wartości na 300 milionów par dla stymulacji błony i na pięć milionów par dla stymulacji nerwów. Po poświęceniu myszy przez zwichnięcie szyjki macicy usuń skórę z nóg. Teraz przetnij ścięgno Achillesa i mocno zaciskając ścięgno, pociągnij mięsień brzuchaty łydki i płaszczkowaty do góry.

Po odsłonięciu ścięgna bliższego płaszczkowatego odetnij całą łydkę nad nim i szybko umieść próbkę w przygotowawczej kąpieli tkankowej znajdującej się pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą kleszczy mocno zaciśnij ścięgno bliższe płaszczkowatego i delikatnie pociągnij je, aby odsłonić unerwienie kulszowe. Po odsłonięciu unerwienia usuń otaczające tkanki, aby odsłonić około pięciu milimetrów nerwu.

Następnie użyj cienkich nożyczek, aby ostrożnie przeciąć nerw. Zakończ wycięcie mięśnia, nerwu, przecinając ścięgno Achillesa, aby oddzielić płaszczkowaty od brzuchatego łydki. Teraz preparat mięśniowy, nerwowy jest gotowy do zamontowania na aparaturze testowej.

Utwórz węzeł poślizgowy na końcu nylonowej nici i zaciśnij go wokół ścięgna Achillesa. Zacisnąć ścięgno proksymalne w stałym zacisku i zawiązać drut nylonowy wokół ramienia dźwigni przetwornika siły. Pozwól mięśniom zrównoważyć się w roztworze.

Aby określić początkową optymalną długość, stymuluj mięsień serią pojedynczych impulsów, delikatnie zmieniając wartość obciążenia pełzania. Optymalna długość uzyskuje się, gdy siła drgania jest maksymalna. Umieść elektrody ssące w pobliżu mięśnia i wciągnij nerw do środka.

Następnie, delikatnie zmieniając wartość prądu tętna, stymuluj mięsień serią pojedynczych impulsów. Siła skurczu generowana przez mięsień podczas stymulacji przez nerw powinna być równa wartościom mierzonym podczas stymulacji go na błonie. Po ustaleniu optymalnej wartości prądu wypchnij nerw z elektrody i dostarcz kilka impulsów prądu.

Jeśli ilość wcześniej wybranego prądu jest nadmierna, impulsy prądu dostarczane przez elektrodę ssącą wywołują skurcz mięśni poprzez przewodzenie prądu przez kąpiel. Korzystając z domowego oprogramowania, opracowaliśmy protokół automatycznego testowania do badania funkcjonalności połączenia płaszczkowatego nerwowo-mięśniowego. Protokół trwa około 65 minut i składa się z czterech różnych części.

W pierwszej części mięsień jest stymulowany czterema pojedynczymi impulsami. Dwa dostarczane bezpośrednio, a dwa przez nerw. Czas do szczytu, czas połowicznego relaksu, maksymalna wartość pochodnej siły i siła drgania są następnie mierzone na podstawie odpowiedzi drgania.

W drugiej części mięsień jest stymulowany serią ciągów impulsów w zakresie od 20 Hz do 80 Hz, co jest częstotliwością tężcową. Aby obliczyć siłę, należy zastosować krzywe częstotliwości zarówno dla stymulacji nerwowej, jak i bezpośredniej. W trzeciej i czwartej części protokołu mięsień jest poddawany dwóm paradygmatom zmęczenia w celu pomiaru niewydolności transmisji nerwowej i zmęczenia śródtężcowego.

Podczas tych paradygmatów zmęczenia mięsień jest stale stymulowany za pomocą jednego ciągu impulsów dostarczanego na błonę, a następnie 14 ciągów impulsów dostarczanych przez nerw. Cała sekwencja jest powtarzana 20 razy. Pierwszy paradygmat jest dostarczany z częstotliwością wyzwalania 35 herców.

Drugi o częstotliwości tężcowej 80 Hz. Uważa się, że niewydolność transmisji nerwowej odgrywa ważną rolę w rozwoju zmęczenia, ponieważ jest związana z zewnętrznym blokiem propagacji potencjału czynnościowego, zmniejszonym uwalnianiem nadajnika i zmniejszoną pobudliwością i płytką zdolności zmęczenia złączy. Innym aspektem zdolności do zmęczenia połączeń nerwowo-mięśniowych jest wyraźnie wyrażone zmęczenie śródtężcowe, które jest oszacowaniem zdolności mięśnia do utrzymania siły podczas pojedynczego skurczu tężcowego i odzwierciedla zmęczenie o wysokiej częstotliwości.

Na końcu protokołu długość i masa mięśni netto są mierzone za pomocą suwmiarki analogowej i precyzyjnej skali w celu obliczenia pola przekroju poprzecznego mięśnia. Badania nad transgenicznym mysim modelem stwardnienia zanikowego bocznego SOD1 podkreśliły potencjał tej metodologii. W rzeczywistości transgeniczne mięśnie płaszczkowate dają zmniejszoną odpowiedź kurczliwą zarówno na pochodną siły, jak i siłę tężcową, gdy są bezpośrednio stymulowane, a jeszcze większą redukcję, gdy są stymulowane przez nerw.

Na przykład, jeśli chodzi o siłę tężca, eksperymenty te wykazały, że kurczliwość mięśni odpowiada za 25% uszkodzeń, podczas gdy kolejne 45% jest związane z defektami w przekaźnictwie nerwowym. Inną interesującą kwestią jest brak jakiejkolwiek różnicy w mięśniach kontrolnych, gdy są stymulowane bezpośrednio lub pośrednio. Odkrycie to dowodzi, że metodologia nie indukuje żadnych artefaktów technicznych, ponieważ oczekuje się, że połączenie nerwowo-mięśniowe będzie w pełni funkcjonalne u zwierząt kontrolnych.

Jeśli chodzi o zmęczenie śródtężcowe, wyniki wykazały znacznie niższe wartości w transgenicznych mięśniach płaszczkowatych niż w ich kontrolnych odpowiednikach. Co ciekawe, transgeniczny mięsień płaszczkowaty jest znacznie uszkodzony przez powtarzającą się stymulację, co oznacza, że funkcjonalność połączenia nerwowo-mięśniowego może być oceniana przy maksymalnym czasie stymulacji wynoszącym osiem minut. Po ośmiu minutach mięsień transgeniczny powraca do prawie zerowej wartości siły po stymulacji.

Po obejrzeniu filmu powinieneś zrozumieć, jak mierzyć funkcjonalność połączenia nerwowo-mięśniowego i mięśnia płaszczkowatego myszy. Biorąc pod uwagę, że technika ta opiera się na pośrednim pomiarze funkcjonalności połączenia nerwowo-mięśniowego, nie pozwala na wykonanie tam, gdzie zgłaszane wady są związane ze zmianami morfologicznymi lub biochemicznymi. Z drugiej strony, podejście to stanowi istotny sposób oceny, czy te agresje wpływają na funkcjonalność sygnału transmisji nerwowej przez użytkownika.

Wreszcie, propozycja protokołu może być łatwo zaadaptowana do pomiaru funkcjonalności połączenia nerwowo-mięśniowego przepony, innego mięśnia często zaangażowanego w choroby patologiczne.