Name: Połączenie nerwowo-mięśniowe: pomiar wielkości synaps, fragmentacji i zmian gęstości białek synaptycznych za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Poznaj metodę ilościowej oceny parametrów synaptycznych w złączeniach nerwowo-mięśniowych myszy za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta umożliwia badanie zmian strukturalnych w chorobach nerwowo-mięśniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Radę Zdrowia i Badań Medycznych [570930]. Obrazowanie przeprowadzono w Zakładzie Mikroskopii Zaawansowanej Instytutu Bosch. Byłym członkom laboratorium, których prace są cytowane, dziękuje się za ich wkład w rozwój tych metod.

<ol><li>Schmidt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin%2FErbB+regulate+neuromuscular+junction+development+by+phosphorylation+of+%CE%B1-dystrobrevin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuregulin/ErbB regulate neuromuscular junction development by phosphorylation of α-dystrobrevin.</a> J Cell Biol. 195, 1171-1184 (2011).</li>
<li>Amenta, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biglycan+is+an+extracellular+MuSK+binding+protein+important+for+synapse+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Biglycan is an extracellular MuSK binding protein important for synapse stability.</a> J Neurosci. 32, 2324-2334 (2012).</li>
<li>Samuel, M. A., Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrin+and+Synaptic+Laminin+Are+Required+to+Maintain+Adult+Neuromuscular+Junctions%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Agrin and Synaptic Laminin Are Required to Maintain Adult Neuromuscular Junctions.</a> PLOS ONE. 7, e46663(2012).</li>
<li>Valdez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+age-related+changes+in+mouse+neuromuscular+synapses+by+caloric+restriction+and+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+%28USA%29%22%5BJournal%5D)">Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise.</a> Proc Natl Acad Sci (USA). 107, 14863-14868 (2010).</li>
<li>Yampolsky, P., Pacifici, P. G., Witzemann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+muscle-driven+synaptic+remodeling+in+the+neuromuscular+junction+after+denervation%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential muscle-driven synaptic remodeling in the neuromuscular junction after denervation).</a> Eur J Neurosci. 31, 646-658 (2010).</li>
<li>Li, Y., Lee, Y., Thompson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+Aging+Mouse+Neuromuscular+Junctions+Are+Explained+by+Degeneration+and+Regeneration+of+Muscle+Fiber+Segments+at+the+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Changes in Aging Mouse Neuromuscular Junctions Are Explained by Degeneration and Regeneration of Muscle Fiber Segments at the Synapse.</a> J Neurosci. 31, 14910-14919 (2011).</li>
<li>Zhu, H., Bhattacharyya, B. J., Lin, H., Gomez, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+IP3R1+receptors+amplify+physiological+and+pathological+synaptic+calcium+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle IP3R1 receptors amplify physiological and pathological synaptic calcium signals.</a> J Neurosci. 31, 15269-15283 (2011).</li>
<li>Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+resistance+to+aging+and+ALS+in+neuromuscular+junctions+of+specific+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles.</a> PLoS ONE. 7, e34640(2012).</li>
<li>Perez-Garcia, M. J., Burden, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+MuSK+Activity+Delays+Denervation+and+Improves+Motor+Function+in+ALS+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Increasing MuSK Activity Delays Denervation and Improves Motor Function in ALS Mice.</a> Cell reports. 2, 1-6 (2012).</li>
<li>Klooster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+kinase+myasthenia+gravis+IgG4+autoantibodies+cause+severe+neuromuscular+junction+dysfunction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice.</a> Brain. 135, 1081-1101 (2012).</li>
<li>Pratt, S. J., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+in+vivo+injury+on+the+neuromuscular+junction+in+healthy+and+dystrophic+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles.</a> J Physiol. 591, 559-570 (2013).</li>
<li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490, 187-191 (2012).</li>
<li>Gervásio, O. L., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+ratio+of+rapsyn+to+ACh+receptor+stabilizes+postsynaptic+receptors+at+the+mouse+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Increased ratio of rapsyn to ACh receptor stabilizes postsynaptic receptors at the mouse neuromuscular synapse.</a> J Physiol. 562, 673-685 (2005).</li>
<li>Gervásio, O. L., Armson, P. F., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+increase+in+the+amount+of+rapsyn+per+acetylcholine+receptor+promotes+postsynaptic+receptor+packing+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental increase in the amount of rapsyn per acetylcholine receptor promotes postsynaptic receptor packing and stability.</a> Dev Biol. 305, 262-275 (2007).</li>
<li>Brockhausen, J., Cole, R. N., Gervásio, O. L., Ngo, S. T., Noakes, P. G., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+agrin+increases+postsynaptic+ACh+receptor+packing+by+elevating+rapsyn+protein+at+the+mouse+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neural agrin increases postsynaptic ACh receptor packing by elevating rapsyn protein at the mouse neuromuscular synapse.</a> Dev Neurobiol. 68, 1153-1169 (2008).</li>
<li>Cole, R. N., Reddel, S. W., Gervásio, O. L., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-MuSK+patient+antibodies+disrupt+the+mouse+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-MuSK patient antibodies disrupt the mouse neuromuscular junction.</a> Ann Neurol. 63, 782-789 (2008).</li>
<li>Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Specific+Kinase+autoantibodies+cause+synaptic+failure+through+progressive+wastage+of+postsynaptic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Muscle Specific Kinase autoantibodies cause synaptic failure through progressive wastage of postsynaptic acetylcholine receptors.</a> Exp Neurol. 237, 237-286 (2012).</li>
<li>Cole, R. N., Ghazanfari, N., Ngo, S. T., Gervasio, O. L., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient+autoantibodies+deplete+postsynaptic+Muscle+Specific+Kinase+leading+to+disassembly+of+the+ACh+receptor+scaffold+and+myasthenia+gravis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patient autoantibodies deplete postsynaptic Muscle Specific Kinase leading to disassembly of the ACh receptor scaffold and myasthenia gravis in mice.</a> J Physiol. 588, 3217-3229 (2010).</li>
<li>Viegas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+and+active+immunization+models+of+MuSK-Ab+positive+myasthenia%3A+Electrophysiological+evidence+for+pre+and+postsynaptic+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Passive and active immunization models of MuSK-Ab positive myasthenia: Electrophysiological evidence for pre and postsynaptic defects.</a> Exp Neurol. 234, 506-512 (2012).</li>
<li>Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyridostigmine+but+not+3%2C4-diaminopyridine+exacerbates+ACh+receptor+loss+and+myasthenia+induced+in+mice+by+Muscle+Specific+Kinase+autoantibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pyridostigmine but not 3,4-diaminopyridine exacerbates ACh receptor loss and myasthenia induced in mice by Muscle Specific Kinase autoantibody.</a> J Physiol. 591, 2747-2762 (2013).</li>
<li>Ghazanfari, N., Morsch, M., Reddel, S. W., Liang, S. X., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Specific+Kinase+autoantibodies+suppress+the+MuSK+pathway+and+ACh+receptor+retention+at+the+mouse+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscle Specific Kinase autoantibodies suppress the MuSK pathway and ACh receptor retention at the mouse neuromuscular junction.</a> J Physiol. 592, 2881-2897 (2014).</li>
<li>Cheng, A., Morsch, M., Murata, Y., Ghazanfari, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+age-associated+changes+to+the+mouse+neuromuscular+junction+and+the+protective+effects+of+voluntary+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sequence of age-associated changes to the mouse neuromuscular junction and the protective effects of voluntary exercise.</a> PLoS One. 8, e67970(2013).</li>
<li>Schaefer, A. M., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compensatory+subpopulation+of+motor+neurons+in+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A compensatory subpopulation of motor neurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Comp Neurol. 490, 209-219 (2005).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+bioscience+research+reporting%3A+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLos Biol. 8, e1000412(2010).</li>
<li>Shimizu, S. Routes of Administration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShimizu%2C+S+%22The+Laboratory+Mouse%22">The Laboratory Mouse</a>. Hedrich, H. J., Bullock, G. , Elsevier. (2004).</li>
<li>Chiasson, R. B. Laboratory anatomy of the white rat. , Brown. Dubuque, Iowa. (1988).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Mitra, A. K., Stroud McCarthy, M. P., M, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+the+nicotinic+acetylcholine+receptor+and+location+of+the+major+associated+43-kD+cytoskeletal+protein%2C+determined+at+22A+by+low+dose+electron+microscopy+and+x-ray+diffraction+to+12.5A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of the nicotinic acetylcholine receptor and location of the major associated 43-kD cytoskeletal protein, determined at 22A by low dose electron microscopy and x-ray diffraction to 12.5A.</a> J Cell Biol. 109, 755-774 (1989).</li>
<li>Paas, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+evidence+for+nucleation+and+growth+of+3D+acetylcholine+receptor+microcrystals+in+structured+lipid-detergent+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl+Acad.+Sci.+%28USA%29%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic evidence for nucleation and growth of 3D acetylcholine receptor microcrystals in structured lipid-detergent matrices.</a> Proc. Natl Acad. Sci. (USA). 100, 11309-11314 (2003).</li>
<li>Samson, A. O., Scherf, T., Eisenstein, M., Chill, J. H., Anglister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+for+acetylhcoline+receptor+inhibition+by+%CE%B1-neurotoxins+and+species-specific+resistance+to+%CE%B1-bungarotoxin+revealed+by+NMR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mechanism for acetylhcoline receptor inhibition by α-neurotoxins and species-specific resistance to α-bungarotoxin revealed by NMR).</a> Neuron. 35, 319-332 (2002).</li>
<li>Ghazanfari, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Specific+Kinase%3A+Organiser+of+synaptic+membrane+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle Specific Kinase: Organiser of synaptic membrane domains.</a> Int J Biochem Cell Biol. 43, 295-298 (2011).</li>
<li>Ghazanfari, N., Morsch, M., Tse, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+%CE%B22-adrenoceptor+agonist%2C+albuterol%2C+in+a+mouse+model+of+anti-MuSK+myasthenia+gravis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Effects of the β2-adrenoceptor agonist, albuterol, in a mouse model of anti-MuSK myasthenia gravis.</a> PLoS ONE. 9, e87840(2014).</li>
<li>Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+diaphragm+neuromuscular+junctions+on+different+fibre+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types.</a> J Neurocytol. 25, 88-100 (1996).</li>
<li>Salpeter, M. M., Harris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+turnover+rate+of+acetylcholine+receptors+throughout+the+junction+folds+at+a+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Distribution and turnover rate of acetylcholine receptors throughout the junction folds at a vertebrate neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 96, 1781-1785 (1983).</li>
<li>Soper, S. A., Nutter, H. L., Keller, R. A., Davis, L. M., Shera, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photophysical+constants+of+several+fluorescent+dyes+pertaining+to+ultrasensitive+fluorescence+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">The photophysical constants of several fluorescent dyes pertaining to ultrasensitive fluorescence spectroscopy.</a> Photochem Photobiol. 57, 972-977 (1993).</li>
<li>Panchuk-Voloshina, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alexa+dyes%2C+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright%2C+photostable+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisane tutaj protokoły umożliwiły nam wiarygodny pomiar i ilościowe określenie zmian właściwości NMJ w różnych warunkach, w tym w normalnych stanach starzenia się i chorobowych. Metody opisane dla obrazów NMJ en face pozwolą naukowcom porównać obszar specjalizacji pre- i postsynaptycznych oraz obszar nakładania się/wyrównania synaptycznego. Aby porównać względną intensywność białek pre- i postsynaptycznych, preferowany jest drugi protokół, który wykorzystuje poprzeczne przekroje optyczne. Trzeci protokół w szczególności...

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest krytyczną synapsą przekaźnikową, która pośredniczy w komunikacji między układem nerwowym a mięśniami szkieletowymi. Jest ona wymagana dla każdego dobrowolnego przemieszczania się. Mikroskopia fluorescencyjna jest od dawna stosowana do badania wpływu transgenów na mysz NMJ 1-3 lub do porównywania wpływu wieku, diety, ćwiczeń i choroby na NMJ 4-11 gryzoni. Takie badania nauczyły nas wiele o fizjologii i patofizjologii NMJ, ale różnorodne zgłaszane parametry (np. obszar AChR, obszar płytki końcowej, długość obwodu, wskaźniki fragmentacji) często utrudniają porównanie wyników tych badań. Coraz częściej oczekuje się, że badacze przedkliniczni będą w stanie wykazać odtwarzalność, szczególnie w badaniach z wykorzystaniem modeli choroby u gryzoni 12. Opisane tutaj protokoły zostały udoskonalone poprzez serię badań, które badały rozwojowe, fizjologiczne i patofizjologiczne zmiany w NMJ. Takie badania wymagają pomiaru obszaru specjalizacji synaptycznych na końcówce motorycznej myszy oraz względnej gęstości upakowania białek synaptycznych w obrębie specjalizacji postsynaptycznych13-15.
Użyteczność tych metod jest zilustrowana ostatnimi badaniami na mysim modelu miastenii anty-MuSK. Codzienne wstrzykiwania IgG od pacjentów z miastenią anty-MuSK-dodatnią dorosłym myszom powodowały ich osłabienie w ciągu 2 tygodni. Konfokalne obrazy maksymalnej projekcji odcinków mięśni, które zostały podwójnie znakowane pod kątem synaptofizyny (w zakończeniach nerwowych) i postsynaptycznych AChR, ujawniły postępujący spadek w obszarze barwienia AChR jako pierwotną zmianę. Co ważne, tempo spadku było wystarczające do wyjaśnienia porównywalnych spadków amplitudy potencjałów synaptycznych, niewydolności transmisji synaptycznej i osłabienia mięśni 17,18. Jakościowo podobne wyniki zostały zgłoszone przez inne grupy badawcze 10,19. Od tego czasu te same metody pomiaru NMJ zostały wykorzystane do oceny wpływu trzech leków w leczeniu miastenii anty-MuSK w tym modelu mysim 20,21.
Siedzący tryb starzenia się może prowadzić do utraty połączeń nerwowo-mięśniowych. Opisane tutaj protokoły ujawniły związany z wiekiem spadek w obszarze synaptofizyny zakończeń nerwowych na końcach motorycznych w miarę postępu myszy w starszym wieku. Te same metody ujawniły, że dobrowolne ćwiczenia mogą w dużej mierze zapobiec zmniejszeniu obszaru zakończenia nerwu presynaptycznego 22, co jest zgodne z wcześniejszymi pracami innych grup 4. Utrata połączeń nerwowo-mięśniowych występuje również w SOD1G93A mysim modelu stwardnienia zanikowego bocznego 9,23.
Badania wspomniane powyżej pokazują, że różnorodność schorzeń może prowadzić do zmniejszenia w obszarze specjalizacji pre- lub postsynaptycznych w NMJ. Może to prowadzić do upośledzenia funkcji synaps lub może zwiastować całkowitą utratę połączenia nerwowo-mięśniowego. Opisano trzy protokoły, które pozwalają na ilościowe określenie obszaru i gęstości specjalizacji synaptycznych. Celem pierwszego protokołu jest zapewnienie praktycznego i powtarzalnego pomiaru obszarów specjalizacji pre- i postsynaptycznych oraz ich wyrównania w NMJ ssaków, przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Dwuwymiarowe obrazy konfokalne z maksymalną projekcją i analiza obrazu za pomocą NIH ImageJ służą do wykrywania zmian w obszarze barwienia synaptofizyny (pęcherzyki synaptyczne), postsynaptycznych AChR i obszaru nakładania się synaptycznego. Parametry obrazowania konfokalnego (wzmocnienie i poziom przesunięcia) są optymalizowane dla każdego NMJ tak, aby zmaksymalizować informacje wizualne wykorzystywane do rozpoznania obszaru specjalizacji synaptycznej. Niewydolność nerwowo-mięśniowa może również wynikać ze zmian gęstości postsynaptycznego AChR i/lub innych białek synaptycznych. Drugi protokół można zastosować do wykrywania zmian we względnej gęstości białek postsynaptycznych, takich jak MuSK, rapsyn, dystroglikan, fosforylowana kinaza Src i fosforylowana AChR 18,21.
W miastenii, zmniejszona gęstość AChR w błonie postsynaptycznej jest bezpośrednią przyczyną niewydolności synaptycznej i osłabienia mięśni. Trzeci protokół opisuje metodę transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) do oceny zmian w pobliżu sąsiednich AChR w błonach postsynaptycznych 14,15. Ta metoda wykrywa transfer energii między sąsiednimi AChR znakowanymi fluorescencyjną α-bungarotoksyną (BGT). FRET występuje tylko wtedy, gdy fluorescencyjne sondy donorowe i akceptorowe są oddalone od siebie o mniej niż 10 nm. Może to ujawnić (submikroskopijne) zmiany w szczelności upakowania AChR, które mogą bezpośrednio odnosić się do amplitudy potencjałów synaptycznych.
Te trzy protokoły, udoskonalone w ciągu ostatniej dekady, dostarczają komplementarnych miar integralności NMJ w spójny i powtarzalny sposób. Stosowanie znormalizowanych protokołów i parametrów powinno ułatwić porównanie wpływu genów i interwencji środowiskowych na NMJ ssaków.

<table><tbody><tr><td>Skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td>DM 2000 z&nbsp; System TCS SP2</td><td>Większość skaningowych mikroskopów konfokalnych powinna być odpowiednia.&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>SPE-II</td><td></td></tr><tr><td>Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT)</td><td>Life technologies</td><td>B35451</td><td>Używany do oznaczania AChRs</td></tr><tr><td>Alexa647-&alpha;-bungarotoxin (far-red-BGT)</td><td>Life technologies</td><td>B35450</td><td>Daleka czerwona fluorescencja: ledwo widoczna przez okular&nbsp;</td></tr><tr><td>królicza antysynaptofizyna</td><td>Technologie życiowe</td><td>18-0130</td><td>Różne partie przeciwciała pierwszorzędowego różnią się skutecznym rozcieńczeniem roboczym</td></tr><tr><td>FITC-anty-rapsyn mab1234</td><td>Milipore</td><td>FCMAB134F</td><td>Przeciwciało monoklonalne sprzężone z FITC</td></tr><tr><td>FITC-osioł anty-królik IgG</td><td>Jackson</td><td>711-095-152</td><td>Poliklonalne przeciwciała drugorzędowe mogą różnić się jakością w zależności od źródła i partii</td></tr><tr><td>Mieszanka o optymalnej temperaturze skrawania (O.T.C.)</td><td>ProSciTech</td><td>IA018</td><td>Matryca do zatapiania kriostatu do zamrażania&nbsp; mięśni</td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma</td><td>10981</td><td>Pożywka montażowa, która spowalnia fotowybielanie fluoroforów</td></tr></tbody></table>

połączenie nerwowo-mięśniowe: pomiar wielkości synaps, fragmentacji i zmian gęstości białek synaptycznych za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest dużą, cholinergiczną synapsą przekaźnikową, za pomocą której neurony ruchowe ssaków kontrolują dobrowolne skurcze mięśni. Zmiany strukturalne w NMJ mogą prowadzić do niewydolności neuroprzekaźnictwa, skutkującej osłabieniem, atrofią, a nawet śmiercią włókna mięśniowego. W wielu badaniach analizowano, w jaki sposób modyfikacje genetyczne lub choroba mogą zmienić strukturę myszy NMJ. Niestety, bezpośrednie porównanie wyników tych badań może być trudne, ponieważ często stosowano w nich różne parametry i metody analityczne. Opisano tutaj trzy protokoły. Pierwszy wykorzystuje obrazy konfokalne z projekcją o maksymalnej intensywności do pomiaru obszaru domen błony postsynaptycznej bogatych w receptor acetylocholiny (AChR) na płycie końcowej oraz obszaru barwienia pęcherzyków synaptycznych w leżącym nad nim presynaptycznym zakończeniu nerwowym. Drugi protokół porównuje względną intensywność barwienia immunologicznego białek synaptycznych w błonie postsynaptycznej. Trzeci protokół wykorzystuje transfer energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) do wykrywania zmian w upakowaniu postsynaptycznych AChR na płytce końcowej. Protokoły zostały opracowane i dopracowane w ciągu szeregu badań. Omówiono czynniki wpływające na jakość i spójność wyników oraz przedstawiono dane normatywne dotyczące NMJ u zdrowych młodych dorosłych myszy.

Pomiar powierzchni synaptycznej w NMJ
Każda ocena powierzchni opiera się na wyznaczeniu granicy definiującej zasięg specjalizacji synaptycznych. W obrazach NMJ z mięśni zdrowych młodych osobników dorosłych powinny być widoczne wyraźne granice barwienia zarówno dla AChR, jak i synaptofizyny (Ryc. 2A i B). Intensywność fluorescencji dla AChR i synaptofizyny gwałtownie rośnie na granicy między częścią perysynaptyczną a synaptyczną płytki końcowej...

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest zmienione w różnych stanach, które czasami mogą prowadzić do niewydolności synaptycznej. W niniejszym raporcie opisano metody oparte na mikroskopie fluorescencyjnym do ilościowego określania takich zmian strukturalnych.

Połączenie nerwowo-mięśniowe: pomiar wielkości synaps, fragmentacji i zmian gęstości białek synaptycznych za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Ogólnym celem tej procedury jest obiektywne ilościowe określenie parametrów synaptycznych, w tym wielkości synaps, fragmentacji i względnej gęstości białek w błonie postsynaptycznej. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie mięśnia, który jest przedmiotem zainteresowania zwierząt doświadczalnych. Następnie wycięty mięsień jest kriogeniczny, a skrawki są wybarwiane immunologicznie do mikroskopii fluorescencyjnej.Następnie na phos obiektywnie pobiera się próbki obrazów połączeń nerwowo-mięśniowych z różnych grup terapeutycznych i określa się ilościowo względną intensywność barwienia dla specjalizacji synaptycznych. Ostatecznie za pomocą mikroskopii konfokalnej uzyskuje się powtarzalne ilościowe pomiary wpływu leczenia lub modyfikacji genetycznej na organizację strukturalną połączenia nerwowo-mięśniowego. Cóż, metoda ta zapewnia ustandaryzowane obiektywne protokoły wykorzystujące mikroskopię konfokalną do oceny zmian w strukturze połączenia nerwowo-mięśniowego w mysich modelach zaburzeń, takich jak miastenia i choroba neuronu ruchowego.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które próbują tej metody, mogą mieć trudności, ponieważ pobieranie próbek NPLS pod mikroskopem konfokalnym w sposób bezstronny i obiektywny wymaga planowania Po pobraniu próbki analiza NPLS musi być przeprowadzana w spójny i powtarzalny sposób, podczas gdy zmienność parametrów nplate między zwierzętami może to utrudniać. Po wyizolowaniu kriosekcji i barwieniu immunofluorescencyjnym, mysie połączenia nerwowo-mięśniowe lub njs, zgodnie z protokołem tekstowym, zaślepiają szkiełka, oznaczając każdą z nich losową liczbą, która pozostaje znana tylko drugiemu badaczowi, dopóki kwantyfikacja parametrów NMJ nie zostanie zakończona. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i użyj zestawu filtrów trit C, aby wyświetlić je w oświetleniu o szerokim polu.Poruszaj się stopniowo po polach od lewej do prawej i z powrotem, aż w polu pojawi się płyta końcowa z konfokalnym otworkiem ustawionym na jednostkę przewiewną 1.0 i używając niskiej mocy lasera, zoptymalizuj poziomy wzmocnienia i przesunięcia dla czerwonego BGT trit C na płycie końcowej, która ma być zobrazowana. Następnie, za pomocą lasera o długości 488 nanometrów, zoptymalizuj fluorescencję dopasowania C, która reprezentuje synaptofyzynę, a następnie zbierz stos Z płytki końcowej z odstępem 0,7 mikrona między każdym wycinkiem optycznym. Zapisz obrazy z nazwą pliku, która zawiera datę sesji obrazowania, nazwę kodową szkiełka i numer płyty końcowej.Powtórzyć właśnie zademonstrowaną procedurę pobierania próbek i obrazowania, aż do momentu pobrania 20 płytek końcowych ze szkiełka lub próbki. A następnie powtórz ten proces dla pozostałych zakodowanych slajdów przy tych samych ustawieniach konfokalnych. Zrób kilka zdjęć ze slajdu kontrolnego.Użyj darmowego oprogramowania image J, aby otworzyć Zacka i w jednym kanale fluorescencyjnym przygotuj maksymalny obraz projekcyjny. Zapisz projekcje jako pliki TIF z nazwą pliku, w tym datą sesji obrazu, kodem próbki, numerem płyty końcowej i kanałem fluorescencyjnym. Teraz użyj obrazu J, aby otworzyć projekcję Z.Wybierz receptor acetylocholiny lub kanał obrazu A CHR i wybierz typ obrazu ośmiobitowy, aby przekonwertować 24-bitowy kolorowy obraz RGB na jeden ośmiobitowy obraz w skali szarości na ekranie za pomocą narzędzia wielokąta. W czerwonym kanale barwienia BGT narysuj przybliżony kontur wokół interesującej nas płyty końcowej, wykluczając wszelkie plamy, które nie pochodzą z interesującej nas płyty końcowej. Wybierz opcję Image adjust threshold (Próg dopasowania obrazu), aby zastosować minimalny próg intensywności do obrazu.Dostosuj poziom progowy, aby wyizolować poplamione części A CHR, wykluczając otaczający sygnał tła jako podpróg. Następnie otwórz drugie okno z oryginalnym obrazem w pełnym odcieniu dla porównania. Aby potwierdzić ustawienia progu przy nadal obecnym obrysie wielokąta, wybierz opcję Analizuj, Analizuj cząstki z menu kontekstowego.Określ zakres rozmiarów w liczbie pikseli od 50 do nieskończoności, co eliminuje wybór drobnych artefaktów wynikających z szumu elektrycznego. W mnożniku zdjęć kliknij analizuj cząstki, aby wygenerować okno z listą dyskretnych obszarów progowych supra i ich wartościami intensywności fluorescencji ponumerowanymi tak, jak pojawiają się na obrazie binarnym. Skopiuj te dane do arkusza kalkulacyjnego z etykietą, aby zmierzyć całkowitą powierzchnię blachy końcowej.W obrębie wielokąta wybierz opcję Analizuj miarę, skopiuj i wklej dane dla obszarów A CHR i intensywności do arkusza kalkulacyjnego z kolumnami oznaczonymi etykietami. Przełącz się na kanał synaptofizyny. Przygotuj maksymalny obraz projekcyjny.Wybierz obszar zainteresowania i ustaw minimalny próg intensywności, jak pokazano poniżej. Aby zmierzyć obszar nakładania się, wykonaj następujące czynności. Otwórz oryginalny plik zawierający dwa obrazy kanałów i wybierz stosy obrazów.Ułóż w stos z obrazami, aby podzielić go na dwa osobne obrazy. Korzystając z wtyczki kolokalizacji obrazu J, wybierz kolokalizację wtyczki i wprowadź wartości progowe wcześniej zarejestrowane dla kanału A CHR i kanałów nerwowych w odpowiednim polu zapytania kanału. Rezultatem jest nakładający się obraz w białych pikselach.Przekonwertuj nowo utworzony obraz nakładania się na format skali szarości i zastosuj próg do wartości maksymalnej, co spowoduje zaznaczenie tylko białych pikseli odpowiadających obszarowi nakładania się dwóch poprzednich kanałów. Zapisz w arkuszu kalkulacyjnym wynikową wartość obszaru kolokalizacji, która reprezentuje obszar nakładania się w pikselach, przygotuj arkusz kalkulacyjny z danymi. Przykładowe oznacza, obliczają i wykreślają odchylenia standardowe i błędy standardowe w postaci histogramów lub wykresów punktowych.Wykreśl i zapisz obszary CHR A jako wykresy punktowe lub histogramy częstotliwości, aby określić, czy dane mają rozkład normalny przed testami statystycznymi. Po przygotowaniu barwienia immunofluorescencyjnego i zobrazowaniu poprzecznych odcinków włókien mięśniowych zgodnie z opisem w protokole tekstowym, otwórz oryginalny plik obrazu i podczas przeglądania kanału A CHR wybierz stosy obrazów stos do obrazów, aby podzielić kanały wybierz typ obrazu osiem bitów, aby przekonwertować ośmiobitowy format skali szarości na ekran. Zrób to dla obu kanałów fluorescencyjnych.Wybierz obrazy w stosy, aby ułożyć je w stos i otworzyć nowy stos z dwóch wcześniej rozdzielonych ośmiobitowych obrazów, co umożliwia przełączanie między dwoma kanałami fluorescencji w jednym oknie za pomocą narzędzia wielokąta. Narysuj linię ściśle wokół granicy barwienia A CHR, wybierz miarę analizy, aby zmierzyć średnią intensywność A CHR w zamkniętym obszarze. Skopiuj tę wartość do arkusza kalkulacyjnego z etykietą, zachowując kontur wielokąta.Przełącz się na drugi kanał fluorescencyjny i wybierz opcję analizuj miarę. W ten sposób uzyska się średnie barwienie białka będącego przedmiotem zainteresowania w obszarze synaptycznym zdefiniowanym przez barwienie A CHR. Wybierz obszar z dala od widocznych plam na płycie końcowej.Następnie wybierz opcję Analizuj miarę, aby zmierzyć średnią intensywność fluorescencji tła. Powtórz pomiar dla pozostałych kanałów fluorescencyjnych i skopiuj wartości tła do arkusza kalkulacyjnego wartości fluorescencji. Odejmij średnie wartości tła od wartości płytki końcowej, aby uzyskać skorygowane intensywności dla A CHR i białka będącego przedmiotem zainteresowania na każdej płycie końcowej.Na koniec podziel skorygowane wartości intensywności nplate dla białka będącego przedmiotem zainteresowania przez skorygowaną intensywność fluorescencji BGT, aby uzyskać współczynniki intensywności fluorescencji, jak pokazano tutaj. Intensywność fluorescencji zarówno dla A CHR, jak i synaptofizyny gwałtownie wzrasta na granicy między synaptyczną i synaptyczną częścią PERS płytki końcowej silnika. W przypadku takich obrazów minimalny próg z łatwością wyizoluje obszar płytki końcowej bogaty w A CHR lub synaptofizynę.Jak wykazano na tym rysunku u starszych myszy i w niektórych stanach chorobowych, barwienie końcówki synaptofizyny może być mniej intensywne. Krawędzie klastra CHR mogą wydawać się rozmyte i mogą występować wyższe poziomy dodatkowych wykresów rozrzutu autofluorescencji synaptycznej ujawniają znaczny zakres w obszarze bogatym w A CHR wśród płytek końcowych mięśni piszczelowych przednich dowolnej pojedynczej myszy. Niemniej jednak średni obszar CHR A oparty na 15 do 20 obrazach płytki końcowej twarzy był podobny wśród siedmiu próbek myszy W przekrojach poprzecznych achr płytki końcowej zwykle wygląda jak kształt półksiężyca, ale ten kształt jest często nieregularny, jak pokazano tutaj.Fluorescencja tła o niskiej intensywności, jak pokazano tutaj na kanale synaptofizyny, zwykle ujawnia, czy plama barwienia A CHR reprezentuje pojedynczą płytkę końcową, czy dwie oddzielne płytki końcowe znajdujące się na sąsiednich włóknach mięśniowych. Ponadto wiele białek synaptycznych, takich jak rapson, piżmo i glikan dystrybucji beta, jest współzlokalizowanych z CHR w nplate. Próbując tej procedury, ważne jest, aby eksperymentatorzy pozostali ślepi na grupy leczone i genotypowe podczas pobierania próbek i analizy obrazów nplate.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zbierać, pobierać próbki i analizować konfokalne obrazy fluorescencyjne połączeń nerwowo-mięśniowych. Ostatecznie naukowcy powinni być w stanie konsekwentnie i obiektywnie porównywać różne parametry strukturalne płytki w różnych grupach badanych i genotypach.

the-neuromuscular-junction-measuring-synapse-size-fragmentation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje sposób ilościowego oznaczania liczby synaps zarówno w dysocjowanych kulturach neuronowych, jak i w przekrojach mózgu z wykorzystaniem immunocytochemii. Przy użyciu przeciwciał specyficznych dla poszczególnych przedziałów komórkowych znakujemy terminale presynaptyczne oraz miejsca specjalizacji postsynaptycznej. Synapsy definiujemy jako punkty kolokalizacji sygnałów generowanych przez te markery.

Ilościowe oznaczanie synaps: test oparty na immunocytochemii do ilościowego oznaczania liczby synaps

Obfitość receptorów neurotransmiterów zgromadzonych w synapsach silnie wpływa na siłę synaptyczną. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie liczby znakowanych fluorescencyjnie receptorów neurotransmiterów w trzech wymiarach z rozdzielczością pojedynczej synapsy u C. elegans, co umożliwia szybką charakterystykę setek synaps w obrębie jednej próbki bez zniekształceń wynikających z projekcji płaszczyzny z.

Automatyczna kwantyfikacja fluorescencji synaptycznej u C. elegans

Połączenie nerwowo-mięśniowe Drosophila (NMJ) jest używane jako model do badania morfologii i funkcji synaps. Ten film opisuje ważne cechy, które naukowcy określają ilościowo, aby scharakteryzować NMJ. Przykładowy protokół demonstruje oprogramowanie zdolne do automatycznego wykonywania kwantyfikacji.

Drosophila Kwantyfikacja połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ): metoda oceny morfologii i funkcji synaps

Źródło: Marinello, M., et al. Charakterystyka połączeń nerwowo-mięśniowych u myszy za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej. J. Vis. Exp. (2021)Ten film przedstawia przygotowanie, barwienie immunologiczne i obrazowanie połączeń nerwowo-mięśniowych w tkance mięśniowej szczura przy użyciu mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej do wizualizacji i analizy struktur presynaptycznych i postsynaptycznych.

Charakterystyka połączeń nerwowo-mięśniowych u myszy za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej

Protokół do dokładnej identyfikacji i analizy synaps w wycinkach hipokampa za pomocą immunofluorescencji jest opisany w tym artykule.

Ocena gęstości synaps w wycinkach mózgu gryzoni w hipokampie

Ten protokół pokazuje, jak wykorzystać mikroskopię superrozdzielczą do badania kolokalizacji białek w pierwotnych kulturach neuronalnych.

Obrazowanie superrozdzielcze w celu zbadania kolokalizacji białek i markerów synaptycznych w neuronach pierwotnych

Zdolność do dokładnego wykrywania komponentów połączenia nerwowo-mięśniowego jest kluczowa w ocenie zmian w jego architekturze spowodowanych procesami patologicznymi lub rozwojowymi. Poniżej przedstawiamy pełny opis prostej metody uzyskiwania wysokiej jakości obrazów całych połączeń nerwowo-mięśniowych, które można wykorzystać do wykonywania pomiarów ilościowych.

Rozwarstwienie pojedynczych włókien mięśni szkieletowych do analiz immunofluorescencyjnych i morfometrycznych połączeń nerwowo-mięśniowych w całości

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Ten protokół opisuje metodę analizy morfometrycznej połączeń nerwowo-mięśniowych za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i STED, która jest używana do ilościowego określania zmian patologicznych w mysich modelach SMA i CMS związanych z ColQ.

DetectSyn to bezstronny, szybki test fluorescencyjny, który mierzy zmiany we względnej liczbie synaps (zaangażowanie pre- i postsynaptyczne) w różnych terapiach lub stanach chorobowych. Technika ta wykorzystuje technikę ligacji zbliżeniowej, która może być stosowana zarówno w hodowanych neuronach, jak i w tkance stałej.

DetectSyn: szybka, bezstronna metoda fluorescencyjna do wykrywania zmian w gęstości synaps

Protokół opisuje metodę ładowania fluorescencyjnego barwnika wapniowego przez przecięty nerw do zakończeń nerwu ruchowego myszy. Ponadto przedstawiono unikalną metodę rejestracji szybkich stanów przejściowych wapnia w zakończeniach nerwów obwodowych za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Rejestracja stanów przejściowych wapnia w mysim połączeniu nerwowo-mięśniowym z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Poznaj metodę ilościowej oceny parametrów synaptycznych w złączeniach nerwowo-mięśniowych myszy za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta umożliwia badanie zmian strukturalnych w chorobach nerwowo-mięśniowych.

Połączenie nerwowo-mięśniowe: pomiar wielkości synaps, fragmentacji i zmian gęstości białek synaptycznych za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal

Połączenie nerwowo-mięśniowe: pomiar wielkości synaps, fragmentacji i zmian gęstości białek synaptycznych za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej

Przeglądaj więcej filmów