Połączenie nerwowo-mięśniowe: pomiar wielkości synaps, fragmentacji i zmian gęstości białek synaptycznych za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej

Ogólnym celem tej procedury jest obiektywne ilościowe określenie parametrów synaptycznych, w tym wielkości synaps, fragmentacji i względnej gęstości białek w błonie postsynaptycznej. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie mięśnia, który jest przedmiotem zainteresowania zwierząt doświadczalnych. Następnie wycięty mięsień jest kriogeniczny, a skrawki są wybarwiane immunologicznie do mikroskopii fluorescencyjnej.

Następnie na phos obiektywnie pobiera się próbki obrazów połączeń nerwowo-mięśniowych z różnych grup terapeutycznych i określa się ilościowo względną intensywność barwienia dla specjalizacji synaptycznych. Ostatecznie za pomocą mikroskopii konfokalnej uzyskuje się powtarzalne ilościowe pomiary wpływu leczenia lub modyfikacji genetycznej na organizację strukturalną połączenia nerwowo-mięśniowego. Cóż, metoda ta zapewnia ustandaryzowane obiektywne protokoły wykorzystujące mikroskopię konfokalną do oceny zmian w strukturze połączenia nerwowo-mięśniowego w mysich modelach zaburzeń, takich jak miastenia i choroba neuronu ruchowego.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które próbują tej metody, mogą mieć trudności, ponieważ pobieranie próbek NPLS pod mikroskopem konfokalnym w sposób bezstronny i obiektywny wymaga planowania Po pobraniu próbki analiza NPLS musi być przeprowadzana w spójny i powtarzalny sposób, podczas gdy zmienność parametrów nplate między zwierzętami może to utrudniać. Po wyizolowaniu kriosekcji i barwieniu immunofluorescencyjnym, mysie połączenia nerwowo-mięśniowe lub njs, zgodnie z protokołem tekstowym, zaślepiają szkiełka, oznaczając każdą z nich losową liczbą, która pozostaje znana tylko drugiemu badaczowi, dopóki kwantyfikacja parametrów NMJ nie zostanie zakończona. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i użyj zestawu filtrów trit C, aby wyświetlić je w oświetleniu o szerokim polu.

Poruszaj się stopniowo po polach od lewej do prawej i z powrotem, aż w polu pojawi się płyta końcowa z konfokalnym otworkiem ustawionym na jednostkę przewiewną 1.0 i używając niskiej mocy lasera, zoptymalizuj poziomy wzmocnienia i przesunięcia dla czerwonego BGT trit C na płycie końcowej, która ma być zobrazowana. Następnie, za pomocą lasera o długości 488 nanometrów, zoptymalizuj fluorescencję dopasowania C, która reprezentuje synaptofyzynę, a następnie zbierz stos Z płytki końcowej z odstępem 0,7 mikrona między każdym wycinkiem optycznym. Zapisz obrazy z nazwą pliku, która zawiera datę sesji obrazowania, nazwę kodową szkiełka i numer płyty końcowej.

Powtórzyć właśnie zademonstrowaną procedurę pobierania próbek i obrazowania, aż do momentu pobrania 20 płytek końcowych ze szkiełka lub próbki. A następnie powtórz ten proces dla pozostałych zakodowanych slajdów przy tych samych ustawieniach konfokalnych. Zrób kilka zdjęć ze slajdu kontrolnego.

Użyj darmowego oprogramowania image J, aby otworzyć Zacka i w jednym kanale fluorescencyjnym przygotuj maksymalny obraz projekcyjny. Zapisz projekcje jako pliki TIF z nazwą pliku, w tym datą sesji obrazu, kodem próbki, numerem płyty końcowej i kanałem fluorescencyjnym. Teraz użyj obrazu J, aby otworzyć projekcję Z.

Wybierz receptor acetylocholiny lub kanał obrazu A CHR i wybierz typ obrazu ośmiobitowy, aby przekonwertować 24-bitowy kolorowy obraz RGB na jeden ośmiobitowy obraz w skali szarości na ekranie za pomocą narzędzia wielokąta. W czerwonym kanale barwienia BGT narysuj przybliżony kontur wokół interesującej nas płyty końcowej, wykluczając wszelkie plamy, które nie pochodzą z interesującej nas płyty końcowej. Wybierz opcję Image adjust threshold (Próg dopasowania obrazu), aby zastosować minimalny próg intensywności do obrazu.

Dostosuj poziom progowy, aby wyizolować poplamione części A CHR, wykluczając otaczający sygnał tła jako podpróg. Następnie otwórz drugie okno z oryginalnym obrazem w pełnym odcieniu dla porównania. Aby potwierdzić ustawienia progu przy nadal obecnym obrysie wielokąta, wybierz opcję Analizuj, Analizuj cząstki z menu kontekstowego.

Określ zakres rozmiarów w liczbie pikseli od 50 do nieskończoności, co eliminuje wybór drobnych artefaktów wynikających z szumu elektrycznego. W mnożniku zdjęć kliknij analizuj cząstki, aby wygenerować okno z listą dyskretnych obszarów progowych supra i ich wartościami intensywności fluorescencji ponumerowanymi tak, jak pojawiają się na obrazie binarnym. Skopiuj te dane do arkusza kalkulacyjnego z etykietą, aby zmierzyć całkowitą powierzchnię blachy końcowej.

W obrębie wielokąta wybierz opcję Analizuj miarę, skopiuj i wklej dane dla obszarów A CHR i intensywności do arkusza kalkulacyjnego z kolumnami oznaczonymi etykietami. Przełącz się na kanał synaptofizyny. Przygotuj maksymalny obraz projekcyjny.

Wybierz obszar zainteresowania i ustaw minimalny próg intensywności, jak pokazano poniżej. Aby zmierzyć obszar nakładania się, wykonaj następujące czynności. Otwórz oryginalny plik zawierający dwa obrazy kanałów i wybierz stosy obrazów.

Ułóż w stos z obrazami, aby podzielić go na dwa osobne obrazy. Korzystając z wtyczki kolokalizacji obrazu J, wybierz kolokalizację wtyczki i wprowadź wartości progowe wcześniej zarejestrowane dla kanału A CHR i kanałów nerwowych w odpowiednim polu zapytania kanału. Rezultatem jest nakładający się obraz w białych pikselach.

Przekonwertuj nowo utworzony obraz nakładania się na format skali szarości i zastosuj próg do wartości maksymalnej, co spowoduje zaznaczenie tylko białych pikseli odpowiadających obszarowi nakładania się dwóch poprzednich kanałów. Zapisz w arkuszu kalkulacyjnym wynikową wartość obszaru kolokalizacji, która reprezentuje obszar nakładania się w pikselach, przygotuj arkusz kalkulacyjny z danymi. Przykładowe oznacza, obliczają i wykreślają odchylenia standardowe i błędy standardowe w postaci histogramów lub wykresów punktowych.

Wykreśl i zapisz obszary CHR A jako wykresy punktowe lub histogramy częstotliwości, aby określić, czy dane mają rozkład normalny przed testami statystycznymi. Po przygotowaniu barwienia immunofluorescencyjnego i zobrazowaniu poprzecznych odcinków włókien mięśniowych zgodnie z opisem w protokole tekstowym, otwórz oryginalny plik obrazu i podczas przeglądania kanału A CHR wybierz stosy obrazów stos do obrazów, aby podzielić kanały wybierz typ obrazu osiem bitów, aby przekonwertować ośmiobitowy format skali szarości na ekran. Zrób to dla obu kanałów fluorescencyjnych.

Wybierz obrazy w stosy, aby ułożyć je w stos i otworzyć nowy stos z dwóch wcześniej rozdzielonych ośmiobitowych obrazów, co umożliwia przełączanie między dwoma kanałami fluorescencji w jednym oknie za pomocą narzędzia wielokąta. Narysuj linię ściśle wokół granicy barwienia A CHR, wybierz miarę analizy, aby zmierzyć średnią intensywność A CHR w zamkniętym obszarze. Skopiuj tę wartość do arkusza kalkulacyjnego z etykietą, zachowując kontur wielokąta.

Przełącz się na drugi kanał fluorescencyjny i wybierz opcję analizuj miarę. W ten sposób uzyska się średnie barwienie białka będącego przedmiotem zainteresowania w obszarze synaptycznym zdefiniowanym przez barwienie A CHR. Wybierz obszar z dala od widocznych plam na płycie końcowej.

Następnie wybierz opcję Analizuj miarę, aby zmierzyć średnią intensywność fluorescencji tła. Powtórz pomiar dla pozostałych kanałów fluorescencyjnych i skopiuj wartości tła do arkusza kalkulacyjnego wartości fluorescencji. Odejmij średnie wartości tła od wartości płytki końcowej, aby uzyskać skorygowane intensywności dla A CHR i białka będącego przedmiotem zainteresowania na każdej płycie końcowej.

Na koniec podziel skorygowane wartości intensywności nplate dla białka będącego przedmiotem zainteresowania przez skorygowaną intensywność fluorescencji BGT, aby uzyskać współczynniki intensywności fluorescencji, jak pokazano tutaj. Intensywność fluorescencji zarówno dla A CHR, jak i synaptofizyny gwałtownie wzrasta na granicy między synaptyczną i synaptyczną częścią PERS płytki końcowej silnika. W przypadku takich obrazów minimalny próg z łatwością wyizoluje obszar płytki końcowej bogaty w A CHR lub synaptofizynę.

Jak wykazano na tym rysunku u starszych myszy i w niektórych stanach chorobowych, barwienie końcówki synaptofizyny może być mniej intensywne. Krawędzie klastra CHR mogą wydawać się rozmyte i mogą występować wyższe poziomy dodatkowych wykresów rozrzutu autofluorescencji synaptycznej ujawniają znaczny zakres w obszarze bogatym w A CHR wśród płytek końcowych mięśni piszczelowych przednich dowolnej pojedynczej myszy. Niemniej jednak średni obszar CHR A oparty na 15 do 20 obrazach płytki końcowej twarzy był podobny wśród siedmiu próbek myszy W przekrojach poprzecznych achr płytki końcowej zwykle wygląda jak kształt półksiężyca, ale ten kształt jest często nieregularny, jak pokazano tutaj.

Fluorescencja tła o niskiej intensywności, jak pokazano tutaj na kanale synaptofizyny, zwykle ujawnia, czy plama barwienia A CHR reprezentuje pojedynczą płytkę końcową, czy dwie oddzielne płytki końcowe znajdujące się na sąsiednich włóknach mięśniowych. Ponadto wiele białek synaptycznych, takich jak rapson, piżmo i glikan dystrybucji beta, jest współzlokalizowanych z CHR w nplate. Próbując tej procedury, ważne jest, aby eksperymentatorzy pozostali ślepi na grupy leczone i genotypowe podczas pobierania próbek i analizy obrazów nplate.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zbierać, pobierać próbki i analizować konfokalne obrazy fluorescencyjne połączeń nerwowo-mięśniowych. Ostatecznie naukowcy powinni być w stanie konsekwentnie i obiektywnie porównywać różne parametry strukturalne płytki w różnych grupach badanych i genotypach.