Inżynieria i charakterystyka modelu optogenetycznego ludzkiego połączenia nerwowo-mięśniowego

Protokół ten opisuje, w jaki sposób zaprojektować funkcjonalne 3D ludzkie połączenia nerwowo-mięśniowe in vitro, które można wykorzystać do badania patologii nerwowo-mięśniowych i testowania potencjalnych środków terapeutycznych. Technika ta wykorzystuje jednoczesną stymulację optogenetyczną i przetwarzanie wideo. Jest to ilościowo określone zmiany w funkcji połączeń nerwowo-mięśniowych podczas rozwoju i spowodowane czynnikami zewnętrznymi, takimi jak neurotoksyny i surowica pacjentów z miastenią.

Etapy związane z wprowadzaniem komórek mięśniowych i neuronów ruchowych do bioreaktora mogą być na początku trudne. Utrzymywanie mieszanki żelu kolagenowego na lodzie może pomóc wydłużyć czas dostępny na zasianie wszystkich komórek, zanim żel zestala się. Zacznij od zmieszania mieszaniny 10 do 1 zasady z utwardzaczem polidimetylosiloksanu lub PDMS i umieść mieszaninę w komorze próżniowej.

Zamknij wszystkie zawory i włącz podciśnienie, aby odgazować mieszaninę przez co najmniej 30 minut, aż nie pozostaną pęcherzyki powietrza. Wlej mieszaninę do foremek i odgazuj foremki w komorze próżniowej przez 1 godzinę, a następnie zamknij foremki górną połową formy we właściwej orientacji. Umieść sześciokątny pręt stalowy na środku i clamp po obu stronach.

Następnie napełnij wierzch PDMS i utwardź foremki w piekarniku o temperaturze 65 stopni Celsjusza przez co najmniej 4 godziny. Po ostygnięciu form do temperatury pokojowej wyjmij platformy z form. W międzyczasie szkiełka nakrywkowe zanurza się w 1% niejonowym poliolu środka powierzchniowo czynnego przez 30 minut, upewniając się, że szkiełka nakrywkowe nie układają się w stosy i są odpowiednio pokryte, a następnie dobrze spłucz je wodą destylowaną i wysusz przez noc w temperaturze 65 stopni Celsjusza.

Szkiełka nakrywkowe szklanej pokrywy i platformę PDMS należy traktować za pomocą myjki plazmowej na wysokim poziomie z 6 litrami tlenu na minutę przez 1 do 2 minut. Po poddaniu działaniu należy je ze sobą połączyć, dociskając PDMS do szkiełka nakrywkowego przez co najmniej 30 sekund. Przygotuj mieszankę 4 do 1 3 miligramów na mililitr kolagenu 1 i rozpuszczoną macierz błony podstawnej, a następnie ponownie zawieś mioblasty w tej świeżo przygotowanej mieszance kolagenu.

Następnie dodaj 15 mikrolitrów tej zawiesiny kolagenu komórkowego do każdej komory mięśniowej bioreaktora, upewniając się, że zawiesina została rozprowadzona na obu filarach za pomocą końcówki pipety. Pozwól mieszaninie żelu komórkowego polimeryzować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, a następnie napełnij każdy bioreaktor 450 mikrolitrami miotonicznej pożywki wzrostowej. W 11 dniu różnicowania neuronów ruchowych przenieś komórki i pożywki do 50-mililitrowej rurki i pozwól neurosferom osiąść na dnie przez 5 minut.

Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 15 mililitrach pożywki do hodowli zawiesiny neuronów ruchowych uzupełnionej 20 nanogramami na mililitr neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego i 10 nanogramów na mililitr neurotroficznego czynnika pochodzącego z komórek glejowych. W 14 dniu protokołów różnicowania umieść motoneurony w platformie. Przygotuj mieszaninę żelu 4 do 1 zawierającą 2 miligramy na mililitr kolagenu 1 i rozpuszczoną macierz błony podstawnej.

Użyj 400-nanometrowego sitka komórkowego, aby wybrać duże neurosfery i ponownie zawiesić je w przygotowanej mieszaninie żelu. Ostrożnie odessać pożywkę ze zbiornika i dobrze neurosfery, a następnie dodać 15 mikrolitrów mieszaniny żelu do kanału neurosfery. Załaduj pipetę o pojemności 10 mikrolitrów z 10 mikrolitrami żelu i wybierz jedną neurosferę.

Umieść neurosferę w kanale neurosfery, upewniając się, że znajduje się w komorze, a następnie powoli podnieś pipetę, uwalniając pozostały żel, gdy neurosfera zostanie zdeponowana. Pozostaw żel do polimeryzacji przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie dodaj do zbiorników 450 mikrolitrów NbActiv4 uzupełnionych 20 nanogramami na mililitr czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego i 10 nanogramów na mililitr neurotroficznego czynnika pochodzącego z komórek glejowych. Do obrazowania należy użyć odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z naukowym komplementarnym oprogramowaniem kamery półprzewodnikowej metalowo-tlenkowej.

Ustaw binning na 2 na 2, ekspozycję na 20 milisekund, włączoną migawkę typu rolling shutter, częstotliwość odczytu na 540 megaherców, zakres dynamiczny na 12 bitów i wzmocnienie 1 oraz tryb czujnika na nakładanie się. Użyj obiektywu 2x na mikroskopie, aby zobrazować mikrotkanki i przymocuj komorę żywych komórek do stolika mikroskopu. Wybierz obszar zainteresowania, który zawiera unerwione tkanki szkieletowe, aby zminimalizować rozmiar pliku i czas przetwarzania, a następnie umieść filtr emisyjny o długości 594 nanometrów między próbką a obiektywem obrazowania, aby odfiltrować impulsy światła niebieskiego z kamery.

Następnie umieść prostokątną 4-dołkową płytkę zawierającą cztery bioreaktory w komorze żywych komórek, a następnie kliknij podgląd na żywo i wyśrodkuj, a następnie ustaw ostrość obrazu z żądanym zwrotem akcji. Pobierz niestandardowy kod makra z folderu GitHub, aby kontrolować pozycję stołu montażowego, płytę Arduino i akwizycję wideo, a następnie ustaw film wyjściowy jako dzień podkreślenie grupy tkanek podkreślenie nazwa tkanki podkreślenie eksperyment kropka ND2. Uruchom kod makra z żądanymi współrzędnymi X i Y ustawionymi na stole montażowym i uzyskaj szybki upływ czasu z 1700 klatkami przy 50 klatkach na sekundę.

Po zobrazowaniu należy wymienić pożywkę i umieścić próbki z powrotem w inkubatorze. Odczekaj co najmniej 24 godziny między sesjami pozyskiwania obrazu, aby uniknąć zmęczenia tkanek. W przypadku przetwarzania filmów pobierz pliki z folderu GitHub i użyj niestandardowego kodu MATLAB do przetworzenia filmów w analizie wsadowej.

Otwórz skrypt cyklicznej analizy systemu operacyjnego, aby wszystkie pobrane filmy wideo znajdowały się w tym samym folderze. Dostosuj parametry analizy wstępnej i uruchom skrypt recursiveOSAnalysis, aby przeanalizować filmy za pomocą przetwarzania równoległego. W razie potrzeby dostosuj parametry po analizie, takie jak czas linii bazowej, próg szczytu, widoczność min-min i minimalna szerokość.

Na koniec wygeneruj dane wyjściowe wideo i wykresu, uruchamiając recursiveOSMovie, aby wygenerować plik wideo dla każdej tkanki z odpowiednim śladem kurczliwości. Protokół ten został przetestowany przy użyciu dwóch systemów o różnej skali, urządzenia mikroprzepływowego dającego tkanki mięśni szkieletowych o długości 1 milimetra składającej się z około 20 000 mioblastów oraz systemu bioreaktora z otwartą studnią, w wyniku czego powstały 4-milimetrowe tkanki mięśniowe składające się z około 450 mioblastów. Konfiguracja optyczna została zbudowana, aby umożliwić kontrolowaną stymulację neuronów ruchowych za pomocą niebieskiego światła, a funkcja NMJ została podniesiona za pomocą niestandardowego skryptu makromikroskopu sparowanego z niestandardowym kodem Arduino.

Kod ten zawiera regulowane parametry i określa, czy skurcz jest wyzwalany na podstawie czasu między impulsem świetlnym a początkiem szczytu kurczliwości. System zarejestrował poprawę funkcji NMJ w tkankach, wykazując wzrost wyzwolonych odpowiedzi tydzień po wytworzeniu tkanki, a następnie stabilną funkcję przez dodatkowy tydzień. Alfa-bungarotoksyna zatrzymała wszystkie wywołane i spontaniczne skurcze, które doprowadziły do całkowitego zakłócenia funkcji NMJ, wykazując, że stymulacja światłem tkanek wymaga funkcjonalnego NMJ.

Analiza tkanek traktowanych surowicą 20% miastenii przez 48 godzin wykazała zmniejszoną funkcję w porównaniu z tkankami kontrolnymi leczonymi surowicą od zdrowych dawców. 48 godzin po usunięciu i wypłukaniu surowicy, zmodyfikowane NMJ wykazały odzyskanie funkcji. Upewnij się, że wszystkie bioreaktory są w piecu przez równy czas, aby uniknąć zmienności sztywności między partiami.

Pamiętaj również, aby zweryfikować wysiewanie neuronów ruchowych za pomocą mikroskopu. Po tej procedurze można przeprowadzić metabalomikę, proteomikę i badania przesiewowe CRISPR w celu zebrania dodatkowych informacji i lepszego zrozumienia zmian mechanistycznych spowodowanych chorą surowicą.