Name: Inżynieria i charakterystyka modelu optogenetycznego ludzkiego połączenia nerwowo-mięśniowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Poznaj metodę inżynierii 3D ludzkich połączeń nerwowo-mięśniowych z wykorzystaniem optogenetycznej stymulacji i przetwarzania wideo. Technika umożliwia ilościową ocenę funkcji NMJ oraz wykrywanie zmian wywołanych neurotoksynami i surowicą chorych na miastenię.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie finansowe ze strony NIH [numery grantów EB025765 i EB027062], DOD [numer grantu W81XWH-18-1-0095] oraz UCSF Health Innovation via Engineering (HIVE Fellowship). Jesteśmy wdzięczni Columbia University Stem Cell Core za ich pomoc i wskazówki dotyczące przeprogramowywania komórek.

Wszystkie linie komórkowe do tej pracy zostały stworzone i użyte zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi Uniwersytetu Columbia, NY, USA.
1. Przygotowanie bioreaktora
<ol>
	<li>Wykonaj formy do bioreaktorów
	<ol>
		<li>Pobierz plik CAD bioreaktora z dodatkowego pliku CAD lub utwórz własny projekt.</li>
		<li>Wygeneruj ścieżkę narzędzia CNC z modelu 3D za pomocą oprogramowania CAM.</li>
		<li>Obróbka form acetalowych za pomocą frezarki CNC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Produkcja bioreaktorów
	<ol>
		<li>Wymieszaj mieszaninę bazy 10:1 z utwardzaczem polidimetylosiloksanu (PDMS, 77 g mieszaniny na 4 platformy/formy).</li>
		<li>Umieść mieszaninę w komorze próżniowej, zamknij wszystkie zawory, włącz podciśnienie i odgazowuj mieszaninę przez co najmniej 30 minut, aż nie pozostaną pęcherzyki powietrza. Wlej mieszaninę do foremek i odgazuj formy w komorze próżniowej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Zamknij foremki, tak aby górna połowa formy była we właściwej orientacji. Umieść stalowy sześciokątny pręt na środku i clamp po obu stronach.</li>
		<li>Napełnij górę PDMS.</li>
		<li>Utwardzać foremki w piekarniku o temperaturze 65 °C przez co najmniej 4 godziny.</li>
		<li>Wyjmij platformy z form po schłodzeniu do temperatury pokojowej.</li>
		<li>Wyczyść urządzenia w kąpieli ultradźwiękowej za pomocą 1-godzinnych cykli płynu do naczyń, 400 ml 100% izopropanolu i wody destylowanej.</li>
		<li>Suszyć przez noc w temperaturze 65 °C.</li>
		<li>Namocz szklane szkiełka nakrywkowe w 1% niejonowym poliolu powierzchniowo czynnym przez 30 minut i upewnij się, że szkiełka nakrywkowe nie układają się w stosy, aby wszystkie były odpowiednio pokryte.</li>
		<li>Dobrze spłukać wodą destylowaną i wysuszyć przez noc w temperaturze 65 °C.</li>
		<li>Użyj myjki plazmowej na wysokim poziomie z 6 l/min tlenu przez 1-2 minuty, aby usunąć szklane szkiełka nakrywkowe i platformę PDMS. Po zabiegu połącz je ze sobą, dociskając PDMS do szkiełka nakrywkowego przez co najmniej 30 sekund.</li>
		<li>Autoklawuj połączone urządzenia przed dodaniem komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Budowanie zestawu do stymulacji optycznej
<ol>
	<li>Używając systemu sześcianów klatkowych 30 mm, przymocuj pośrodku zwierciadło dichroiczne 573 nm. Połącz czerwoną diodę LED 627 nm z filtrem wzbudzenia długoprzepustowym 594 nm i przymocuj ją do górnej części sześcianu, tak aby dioda LED była skierowana w stronę lustra. Następnie przymocuj niebieską diodę LED 488 nm z filtrem wzbudzenia krótkoprzepustowym 546 nm po sąsiedniej stronie kostki, tak aby dioda LED była skierowana w stronę lustra, jak pokazano na schemacie w <silna klasa="xfig">Rysunek 3A.</li>
	<li>Przymocuj przysłonę tęczówki uruchamianą pierścieniowo do dolnej części kostki klatki, aby kontrolować rozmiar oświetlanego obszaru.</li>
	<li>Zasilaj każdą diodę LED za pomocą sterownika LED T-Cube i steruj nią za pomocą płytki Arduino Uno Rev3. Podłącz boczne wejście sterownika LED do wtyczki źródła zasilania, podłącz środkowe wyjście do Arduino i podłącz boczne wyjście bezpośrednio do diod LED.</li>
	<li>Podłącz Arduino Uno do komputera za pomocą USB.</li>
	<li>Pobierz pliki z linku GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).</li>
	<li>Otwórz plik "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" z folderu GitHub.</li>
	<li>Ustaw parametry początkowe: Steps = 30; startFrequency = 0,5; endFrequency = 3; pulseLength = 100.</li>
	<li>Upewnij się, że wyjście pin 4 jest przypisane do sterownika niebieskiej diody LED, a wyjście pinu 2 jest przypisane do sterownika czerwonej diody LED. Sprawdź, czy środkowe przewody sterownika LED są podłączone do masy i do odpowiedniego wyjścia pinowego.</li>
	<li>Skompiluj i załaduj program "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" do Arduino.</li>
	<li>Podłącz każdy sterownik LED do odpowiedniego kanału.</li>
</ol>
3. Konfiguracja hodowli komórkowej (dzień -21-0)
<ol>
	<li>Pierwotne komórki mięśni szkieletowych
	<ol>
		<li>Rozmrażaj i rozszerzaj pierwotne mioblasty szkieletowe (uzyskane z miozytu Cooka) przez maksymalnie sześć pasaży przy użyciu miotonicznej pożywki wzrostowej (+ suplement). Utrzymuj komórki w inkubatorze w inkubatorze ustawionym na 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Zmieniaj nośnik co 2 dni.</li>
		<li>Gdy komórki zlewają się w około 60%, przechodź je za pomocą 0,05% Trypsyny-EDTA (1x, przez 5 minut w temperaturze 37 °C). Zbierz zdysocjowane komórki i dodaj świeże podłoże, aby zneutralizować trypsynę.</li>
		<li>Odwirować komórki przy 300 x g i zassać supernatant powyżej osadu komórkowego.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki za pomocą MGM i wysiewać nasiona w stosunku 1:3 z 60 ml na kolbę trójwarstwową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ChR2-hiPSC 
	UWAGA: Wszystkie linie komórkowe do tej pracy zostały stworzone i wykorzystane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi Columbia University, NY, USA. W tym protokole hiPSC z ekspresją ChR2 zostały wygenerowane poprzez edycję genomu CRISPR-Cas9 przy użyciu wcześniej opisanych metod18, ale w ten sam sposób można użyć dowolnych stabilnych optogenetycznych linii komórkowych (lentiviral, piggyBac itp.). Wybrano konstytutywne promotory ulegające ekspresji zarówno w iPSC, jak i w neuronach ruchowych (CAG). Stwierdzono, że komórki mają zdrowy kariotyp, jak zauważono w poprzednich publikacjach18, 19.
	<ol>
		<li>Pokryć płytki 6-dołkowe 1 ml/basenik rozpuszczonej matrycy błony podstawnej rozcieńczonej w DMEM/F12 (1:80) i inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Wysiewaj iPSC na powlekanych płytkach 6-dołkowych z 2 ml pożywki do hodowli komórkowych bez podajnika (pożywki iPSC), wymieniając 2 ml pożywki co drugi dzień i pasażując co 5-7 dni. Utrzymuj komórki w inkubatorze ustawionym na 37°C i 5% CO2 .</li>
		<li>Przejście
		<ol>
			<li>Dysocjację komórek macierzystych należy przeprowadzić przez inkubację z 1 ml bezenzymatycznego odczynnika uwalniającego komórki macierzyste przez 4 minuty i mechaniczne ścinanie pipetą P1000 z szeroką końcówką.</li>
			<li>Komórki nasienne w stosunku 1:24 lub 1:48 w pożywce iPSC z 2 μM dichlorowodorku Y-27632 w 2 ml / basenie na powlekane płytki 6-dołkowe.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wysiewanie tkanki mięśni szkieletowych (dzień -3)
<ol>
	<li>Wyizoluj i policz 30 x 106 mioblastów za pomocą automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Ponownie zawiesić mioblasty w mieszaninie 4:1 3 mg/ml kolagenu I i rozpuszczonej macierzy błony podstawnej (800 μl mieszaniny kolagenu + 200 μl matrycy błony podstawnej, aby osiągnąć końcową objętość 1 ml). W przypadku składnika kolagenowego dodać dołączony środek neutralizujący (mieszanina kolagenu z neutralizacją w stosunku 9:1) i rozcieńczyć mieszaninę 1x PBS, aby uzyskać objętość 800 μL.</li>
	<li>Dodaj 15 μl zawiesiny kolagenu komórkowego do każdej komory mięśniowej bioreaktora, upewniając się, że zawiesinę rozprowadzisz na obu filarach za pomocą końcówki pipety (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Pozostawić mieszaninę komórkowo-żelową do polimeryzacji w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie napełnić każdy bioreaktor 450 μl miotonicznej pożywki wzrostowej.</li>
	<li>Po 3 dniach (po zagęszczeniu żelu) rozpocznij różnicowanie rurki mięśniowej.</li>
</ol>
5. Różnicowanie Myotube (dni 0-14)
<ol>
	<li>Infuzję rurki należy rozpocząć od zmiany tkanek na 450 μl pożywki indukującej fuzję (FS, Tabela 1) przez 7 dni, zmieniając pożywkę co drugi dzień. 
	UWAGA: Spróbuj rozpocząć różnicowanie miotubówki w tym samym dniu, w którym różnicowanie neuronów ruchowych od hiPSC, aby zasiać motoneurony na końcu harmonogramów różnicowania obu typów komórek.</li>
	<li>W 7 dniu zmienić pożywkę na 450 μl pożywki dojrzewającej Ia (MMIa, Tabela 1).</li>
	<li>W dniu 9 należy zmienić na 450 μl pożywki dojrzewającej Ib (MMIb, Tabela 1).</li>
	<li>W 11 dniu zmień pożywkę na 450 μl NbActiv4. Zmieniaj pożywkę co 2 dni, aż neurony ruchowe zostaną wysiane (krok 7).</li>
</ol>
6. Różnicowanie motoneuronów (dni 0-14)
UWAGA: Nasz protokół różnicowania motoneuronów został zaadaptowany z Maury et al8.
<ol>
	<li>W dniu 0 przenieś 4 x 106 ChR2- hiPSC na szalkę Petriego o bardzo niskim przyczepie z 15 ml pożywki do hodowli zawiesiny neuronów ruchowych (MSCM, Tabela 1). Uzupełnij MSCM 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hydratu i 5 μM dichlorowodorku Y-27632.</li>
	<li>W dniu 2 wyizoluj neurosfery (NS) za pomocą odwracalnego sitka 37 μM i ponownie plateruj w 15 ml MSCM z 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hydratem i 0,1 μM kwasu retinowego. NS powinien być widoczny na szalce Petriego bez użycia mikroskopu po 2 dniu.</li>
	<li>W 4 dniu przenieś komórki i pożywkę do probówki o pojemności 50 ml i pozwól neurosferom osiąść na dnie (5 min). Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 15 ml MSCM uzupełnionym 0,5 μM SAG, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 i 0,1 μM kwasu retinowego.</li>
	<li>W dniu 7 powtórz krok 6.3, ale ponownie zawieś komórki w 15 ml MSCM uzupełnionym 0,5 μM SAG i 0,1 μM kwasu retinowego.</li>
	<li>W dniu 9 powtórz krok 6.3, ale ponownie zawieś komórki w 15 ml MSCM uzupełnionym 10 μM DAPT.</li>
	<li>W dniu 11 powtórz krok 6.3, ale ponownie zawieś komórki w 15 ml MSCM uzupełnionym 20 ng/ml BDNF i 10 ng/ml GDNF.</li>
	<li>W dniu 14 umieść motoneurony na platformie.</li>
</ol>
7. Wywoływanie agregatów motoneuronów w bioreaktorze (dzień 14)
<ol>
	<li>Przygotuj żelową mieszaninę 4:1 2 mg/ml kolagenu I i Matrigelu (800 μl mieszanki kolagenu + 200 μL Matrigel, aby osiągnąć końcową objętość 1 ml). W przypadku składnika kolagenowego dodać towarzyszący środek neutralizujący (mieszanina kolagenu z neutralizatorem w proporcji 9:1) i rozcieńczyć mieszaninę 1x PBS, aby uzyskać końcową objętość 800 μL.</li>
	<li>Użyj sitka komórkowego o długości fali 400 nm, aby wybrać duże neurosfery i ponownie zawiesić je w mieszaninie żelu.</li>
	<li>Odessać pożywkę ze zbiornika i ostrożnie z neurosfery dobrze (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Dodać 15 μl mieszaniny żelu do kanału neurosfery.</li>
	<li>Załaduj pipetę o pojemności 10 μl z 10 μl żelu, a następnie wybierz jedną neurosferę.</li>
	<li>Umieść NS w kanale neurosfery i upewnij się, że NS znajduje się w komorze. Powoli podnieś pipetę, jednocześnie uwalniając pozostały żel po nałożeniu NS. Jeśli nie masz pewności, czy NS został prawidłowo zdeponowany, sprawdź jego lokalizację za pomocą mikroskopu.</li>
	<li>Pozostawić żel do polimeryzacji przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać do zbiorników 450 μl NbActiv4 uzupełnionego 20 ng/ml BDNF i 10 ng/mL GDNF.</li>
	<li>Zmieniaj podłoże co drugi dzień, aby umożliwić wzrost aksonów od NS do tkanki mięśniowej.</li>
</ol>
8. Jednoczesna stymulacja optyczna i nagrywanie wideo z funkcją NMJ (dzień 24+)
<ol>
	<li>Do obrazowania należy użyć odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z naukową kamerą typu sCMOS (Complementary metal-oxide-semiconductor).</li>
	<li>Ustaw grupowanie oprogramowania aparatu na 2x2, ekspozycję na 20 ms, włączoną migawkę typu rolling shutter, częstotliwość odczytu na 540 MHz, zakres dynamiki: 12-bit i wzmocnienie 1 oraz tryb czujnika: nakładanie się.</li>
	<li>Użyj obiektywu 2x na mikroskopie, aby zobrazować mikrotkanki.</li>
	<li>Podłączyć komorę z żywymi komórkami (37 °C, 5% CO2 ) do stolika mikroskopu.</li>
	<li>Wybierz obszar zainteresowania (ROI), który zawiera unerwioną tkankę tkanek szkieletowych, aby zminimalizować rozmiar pliku i czas przetwarzania.</li>
	<li>Umieść długoprzepustowy filtr emisyjny 594 nm między próbką a obiektywem obrazowania, aby odfiltrować impulsy światła niebieskiego z kamery.</li>
	<li>Umieść prostokątną 4-dołkową płytkę zawierającą 4 bioreaktory (24 tkanki) w komorze na żywe komórki.</li>
	<li>Kliknij opcję Live View (Podgląd na żywo). Wyśrodkuj i ustaw ostrość obrazu z żądanym zwrotem akcji.</li>
	<li>Przekaż niestandardowy kod makra z folderu GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis), aby sterować pozycją stołu montażowego, płytą Arduino i akwizycją wideo.</li>
	<li>Ustaw film wyjściowy jako: day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.</li>
	<li>Uruchom kod makra z żądanymi współrzędnymi X,Y ustawionymi na stole montażowym i uzyskaj szybki upływ czasu z 1700 klatkami przy 50 klatkach / s.</li>
	<li>Po obrazowaniu należy wymienić pożywkę i umieścić próbki z powrotem w inkubatorze. Odczekaj co najmniej 24 godziny między sesjami pozyskiwania obrazu, aby uniknąć zmęczenia tkanek.</li>
</ol>
9. Przetwarzanie i analiza wsadowa (dzień 24+)
<ol>
	<li>Przetwarzanie filmów
	<ol>
		<li>Użyj niestandardowego kodu MATLAB, aby przetworzyć filmy w analizie wsadowej. Pliki można pobrać z folderu GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis). Funkcje są wymienione i wyjaśnione w tabeli 2. 
		UWAGA: Kod jest kompatybilny z formatami .nd2 i .czi. Wymaga przetwarzania równoległego do aktywacji w MATLAB i potrzebuje pakietu bioformatów.</li>
		<li>Uruchom skrypt recursiveOSAnalysis, aby przeanalizować filmy za pomocą przetwarzania równoległego. Umieść wszystkie pobrane filmy w tym samym folderze i wybierz ten folder podczas uruchamiania kodu.</li>
		<li>W razie potrzeby dostosuj parametry po analizie.
		<ol>
			<li>Zmień baselineTime (opcja 1), jeśli spontaniczny skurcz zostanie wychwycony na początku nagrywania. Spowoduje to pokazanie początkowego odczytu znacznie powyżej 0 i będzie wymagało przesunięcia ramki, aby to skompensować.</li>
			<li>Zmień peakThreshold (opcja 2), jeśli skurcze nie są rejestrowane. Kod domyślnie wykryje skurcze, które są powyżej 25% najwyższego szczytu, aby można było zmienić tę wartość.</li>
			<li>Zmień wartości minMinProminence i minMinWidth, aby dostosować czułość podczas wykrywania początku każdego szczytu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Generuj dane wyjściowe wideo i wykresów.
		<ol>
			<li>Uruchom recursiveOSMovie, aby wygenerować plik wideo dla każdej tkanki z odpowiednim śladem kurczliwości.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. Perturbacja funkcji NMJ (dzień 24+)
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę zabiegową, dodając efektor zewnętrzny do pożywki podstawowej NbActiv4 uzupełnionej 20 ng/ml BDNF i 10 ng/ml GDNF.
	<ol>
		<li>W eksperymencie z surowicą MG należy użyć 20% surowicy pacjenta MG w NbActiv4 + BDNF + GDNF.</li>
		<li>Do eksperymentu BTX użyj 5 μg/ml BTX w NbActiv4 + BDNF + GDNF.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stymuluj/obraz, wykonując krok 3.2, aby zarejestrować linię bazową.</li>
	<li>Zastąp pożywkę w tkankach pożywką zabiegową (450 μl/tkankę).</li>
	<li>Inkubować przez żądany czas (48 godzin dla surowic pacjenta, 20 minut dla BTX).</li>
	<li>Ponownie stymuluj/obraz, korzystając z kroku 3.2., aby zarejestrować funkcję po zabiegu.</li>
	<li>Usunąć pożywkę zabiegową i pozostawić tkankom na odpoczynek przez żądany czas (48 godzin po usunięciu surowicy) 
	UWAGA: Odczekaj co najmniej 24 godziny między stymulacją a obrazowaniem, aby uniknąć zmęczenia tkanek</li>
</ol>

<ol><li>Al-bassam, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics%2C+incidence%2C+and+outcome+of+patients+admitted+to+the+intensive+care+unit+with+myasthenia+gravis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Characteristics, incidence, and outcome of patients admitted to the intensive care unit with myasthenia gravis.</a> Journal of Critical Care. 45, 90-94 (2018).</li>
<li>Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+neuromuscular+junctions+and+their+potential+for+novel+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">In vitro models of neuromuscular junctions and their potential for novel drug discovery and development.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (3), 307-317 (2020).</li>
<li>Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+the+neuromuscular+junction%2C+vitally+informative+for+understanding+function+and+the+molecular+mechanisms+of+congenital+myasthenic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326(2018).</li>
<li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+anatomy+of+the+human+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction.</a> Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+human+pluripotent+stem+cells+into+a+functional+skeletal+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue.</a> Nature Communications. 9 (1), 126(2018).</li>
<li>Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+human+myobundles+mimic+clinical+responses+of+skeletal+muscle+to+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs.</a> eLife. 4, 04885(2015).</li>
<li>Maury, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+analysis+of+developmental+cues+efficiently+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+multiple+neuronal+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).</li>
<li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+differentiation+of+functional+motor+neurons+from+human+iPSC+for+neural+injury+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient differentiation of functional motor neurons from human iPSC for neural injury modelling.</a> Stem Cell Research. 32, 126-134 (2018).</li>
<li>Turan, S., Farruggio, A. P., Srifa, W., Day, J. W., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+correction+of+disease+mutations+in+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+patients+with+limb+girdle+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Precise correction of disease mutations in induced pluripotent stem cells derived from patients with limb girdle muscular dystrophy.</a> Molecular Therapy. 24 (4), 685-696 (2016).</li>
<li>Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+as+a+disease+modeling+and+drug+screening+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).</li>
<li>Lin, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-derived+functional+human+neuromuscular+junctions+model+the+pathophysiology+of+neuromuscular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases.</a> JCI Insight. 4 (18), (2021).</li>
<li>Centeno, E. G. Z., Cimarosti, H., Bithell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+versus+3D+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cultures+for+neurodegenerative+disease+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">2D versus 3D human induced pluripotent stem cell-derived cultures for neurodegenerative disease modelling.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 27(2018).</li>
<li>Okano, T., Matsuda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineered+skeletal+muscle%3A+preparation+of+highly+dense%2C+highly+oriented+hybrid+muscular+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Tissue engineered skeletal muscle: preparation of highly dense, highly oriented hybrid muscular tissues.</a> Cell Transplantation. 7 (1), 71-82 (1998).</li>
<li>Powell, C. A., Smiley, B. L., Mills, J., Vandenburgh, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+improves+tissue-engineered+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation improves tissue-engineered human skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (5), 1557-1565 (2002).</li>
<li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li>
<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human-based+functional+NMJ+system+for+personalized+ALS+modeling+and+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">A human-based functional NMJ system for personalized ALS modeling and drug testing.</a> Advanced Therapeutics. 3 (11), 2000133(2020).</li>
<li>Vila, O. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+optogenetic+model+of+human+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bioengineered optogenetic model of human neuromuscular junction.</a> Biomaterials. 276, 121033(2021).</li>
<li>Vila, O. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+human+neuromuscular+function+through+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Quantification of human neuromuscular function through optogenetics.</a> Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li>
<li>Steinbeck, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+connectivity+under+optogenetic+control+allows+modeling+of+human+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional connectivity under optogenetic control allows modeling of human neuromuscular disease.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).</li>
<li>Santhanam, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+derived+phenotypic+human+neuromuscular+junction+model+for+dose+response+evaluation+of+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics.</a> Biomaterials. 166, 64-78 (2018).</li>
<li>Phillips Ii, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+myasthenia+gravis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of myasthenia gravis.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 998 (1), 407-412 (2003).</li>
<li>Sanders, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+change+in+acetylcholine+receptor+antibody+level+correlate+with+clinical+change+in+myasthenia+gravis%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+%26+Nerve%22%5BJournal%5D)">Does change in acetylcholine receptor antibody level correlate with clinical change in myasthenia gravis.</a> Muscle & Nerve. 49 (4), 483-486 (2014).</li>
<li>Vernino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+enigma+of+seronegative+myasthenia+gravis%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Neurology%22%5BJournal%5D)">Unraveling the enigma of seronegative myasthenia gravis.</a> JAMA Neurology. 72 (6), 630-631 (2015).</li>
<li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. , (2018).</li>
<li>Paredes-Redondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+modeling+of+human+neuromuscular+circuits+in+Duchenne+muscular+dystrophy+with+CRISPR+and+pharmacological+corrections%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Optogenetic modeling of human neuromuscular circuits in Duchenne muscular dystrophy with CRISPR and pharmacological corrections.</a> Science Advances. 7 (37), (2021).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

System ten jest zaprojektowanym modelem 3D tkanki ludzkiej, który łączy optogenetykę i przetwarzanie wideo, aby umożliwić zautomatyzowaną i bezstronną ocenę funkcji NMJ. Korzystając ze znormalizowanego protokołu, wykazaliśmy zdolność do pomiaru zmian w funkcji NMJ podczas rozwoju fizjologicznego i scharakteryzowania szkodliwych skutków patologii, takich jak ekspozycja na neurotoksyny i surowice pacjenta z miastenią.
Wcześniejsze badania wykazały możliwość modelowania MG za pomocą optogenetyczn...

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) to chemiczna synapsa między neuronami ruchowymi (MN) a komórkami mięśni szkieletowych (SkM), która umożliwia skurcz mięśni. Toksyny, takie jak neurotoksyna α-bungarotoksyna (BTX) lub choroby nerwowo-mięśniowe (NMD), takie jak miastenia (MG) mogą prowadzić do zwyrodnienia NMJ i zmniejszenia kontroli mięśni1. Bioinżynieryjne modele tkanek ludzkich lepiej odwzorowują funkcjonalne i fizjologiczne mechanizmy ludzkich NMJ i oferują większy potencjał translacyjny niż modele zwierzęce.
Podczas gdy modele zwierzęce pogłębiły zrozumienie powstawania i funkcji NMJ, istnieją znaczące różnice między ludzkimi i zwierzęcymi synapsami, które ograniczają tłumaczenie wyników na ludzi i sprawiają, że charakterystyka NMJ in vivo jest trudna2,3,4. Badania wykazały wyraźne różnice fizjologiczne między mysim i ludzkim NMJ. Myszy mają większe NMJ i mniejsze zagęszczenie stref aktywnych w porównaniu z ludzkimi NMJs4. Ponadto badania leków prowadzone na modelach zwierzęcych nie zawsze odzwierciedlają efekty stwierdzone w badaniach klinicznych na ludziach. Zmodyfikowane modele tkanek ludzkich dają możliwość badania zdrowego rozwoju NMJ i patologii chorób nerwowo-mięśniowych oraz pozwalają na badania przesiewowe leków. Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSCs)5 można różnicować na różne typy komórek, w tym komórki mięśni szkieletowych6,7 i motoneurons8,9. hiPSC można łatwo generować z komórek pacjenta, co pozwala na lepsze modelowanie choroby10 i badanie przesiewowe leków11,12 za pomocą modeli tkanek specyficznych dla pacjenta.
Dwuwymiarowe (2D) jednowarstwowe kokultury SkMs i MN nie mają morfologii, fenotypu, organizacji i funkcjonalnego zachowania fizjologicznych NMJ. NMJ losowo tworzą się w hodowli 2D, co hamuje izolację jednostek motorycznych do analizy, ogranicza dokładne pomiary funkcjonalne i uniemożliwia ich użycie do powtarzalnych, systematycznych eksperymentów13. Trójwymiarowe (3D) modele tkankowe NMJ przezwyciężają wiele z tych ograniczeń, rekapitulując morfologiczne i funkcjonalne cechy fizjologicznych NMJs7,14,15,16,17. Korzystając z tego modelu, oba typy tkanek są opracowywane oddzielnie, a następnie integrowane poprzez kierowanie wzrostem aksonów, co pozwala na rozwój bardziej zorganizowanych NMJ w porównaniu z systemami hodowli 2D.
Nasze poprzednie badanie wykazało, że połączenie optogenetyki z inżynierią tkankową pozwala na dokładną, nieinwazyjną stymulację i ocenę funkcji NMJ18,19. Dzięki inżynierii genetycznej białka wrażliwe na światło mogą zostać zintegrowane z genomem hiPSC. Integracja rodopsyny kanałowej-2 (ChR2), kanału jonowego, który otwiera się w odpowiedzi na niebieskie światło, z błoną pobudliwych komórek, takich jak neurony, pozwala na bezkontaktową kontrolę czasoprzestrzenną nad aktywacją komórek20,21,22. hiPSC przenoszące ChR2 mogą być zróżnicowane na optogenetyczne neurony ruchowe wrażliwe na niebieskie światło, eliminując potrzebę typowych inwazyjnych elektrod, które stymulują neurony i unikając niepożądanej stymulacji komórek mięśniowych przez elektrody23. System ten wykorzystuje optogenetyczne neurony ruchowe do stymulowania skurczów w nieoptogenetycznych komórkach mięśni szkieletowych. Połączenie akwizycji wideo i kontrolowanego oświetlenia światłem niebieskim pozwala na jednoczesną stymulację i rejestrację współhodowanych tkanek pod kątem funkcji NMJ.
MG jest wywoływane przez autoprzeciwciała skierowane przeciwko nikotynowym receptorom acetylocholiny (AChR), co skutkuje zmniejszeniem funkcji NMJ i osłabieniem mięśni24. Rozpoznaje się ją na podstawie przedstawionych objawów, elektrodiagnostyki i wykrywania autoprzeciwciał za pomocą serologicznych badań krwi. Jednak nie wszystkie autoprzeciwciała zaangażowane w MG zostały zidentyfikowane, a u niektórych pacjentów seronegatywnych diagnozuje się MG, ale bez rozpoznanych przeciwciał25,26. Nasz system pozwala na ponowną ocenę funkcjonalną NMJ przed i po dodaniu surowicy od pacjentów z MG, dostarczając bezcennego wglądu w funkcjonalne i biochemiczne zmiany spowodowane przez przeciwciała MG18. Nasz protokół ilustruje, jak tworzyć modele 3D in vitro funkcjonalnego ludzkiego NMJ, które można wykorzystać do diagnozowania i badania patologii NMJ oraz testowania potencjalnych środków terapeutycznych. Demonstrujemy wszechstronność systemu na dwóch platformach, urządzeniu mikroprzepływowym i większej platformie bioreaktora z otwartą studnią.

<table><tbody><tr><td>Cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SkMDC</td><td>Cook Myosite</td><td>P01059-14M</td><td></td></tr><tr><td>Pożywki i suplementy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12634-020</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór albuminy surowicy bydlęcej</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9576-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Suplement G-5 (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17503-012</td><td></td></tr><tr><td>Selektywny antybiotyk Geneticin (siarczan G418) (50 mg/ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10131-035</td><td></td></tr><tr><td>Insulina, rekombinowana</td><td>ludzka milipora Sigma</td><td>91077C-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>100-0276</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw pożywek MyoTonic Growth Kit</td><td>Cook Myosite</td><td>MK-4444</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Suplement</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>NbActiv4 500 ml</td><td>BrainBits LLC</td><td>Nb4-500</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże neuropodstawowe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A13710-01</td><td></td></tr>System sześcianów <tr><td>klatkowych Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR Stem</td><td>Cell Technologies</td><td>5872</td><td></td></tr><tr><td>Plasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 mm</td><td>ThorLabs</td><td>CM1-DCH, CP33, ER1-P4 i ER2-P4</td><td></td></tr><tr><td>37 &micro; m Odwracalny filtr siatkowy, duży</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>27250</td><td></td></tr><tr><td>546 nm krótkoprzepustowy filtr wzbudzenia</td><td>Semrock</td><td>FF01-546/SP-25</td><td></td></tr><tr><td>573 nm lustro dichroiczne</td><td>Semrock</td><td>FF573-Di01&ndash; Filtr spalinowy długoprzepustowy 25x36</td><td></td></tr><tr><td>594 nm Filtr wzbudzenia długoprzepustowy</td><td>Semrock</td><td>BLP01-594R-25</td><td></td></tr><tr><td>594 nm</td><td>Semrock</td><td>BLP01-594R-25</td><td></td></tr><tr><td>Niebieski (470nm) Rebel LED na podstawie kwadratowej SinkPAD-II 10mm - 65 lm @ 700mA</td><td>LuxeonStarLEDs</td><td>SP-05-B4</td><td></td></tr><tr><td>Carclo 29.8&deg; Matowa optyka 10 mm z okrągłą wiązką - zintegrowane nogi</td><td>LuxeonStarLEDs</td><td>10413</td><td></td></tr><tr><td>Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish</td><td>Corning</td><td>3261</td><td></td></tr><tr><td>Radiator</td><td>LuxeonStarLED</td><td>LPD-19-10B</td><td></td></tr><tr><td>Optics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pluriSitko 400 i mikro; m, 25 szt., sterylne</td><td>PluriSelect</td><td>43-50400-03</td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer 500 &micro; m, 25 szt., sterylne</td><td>PluriSelect</td><td>43-50500-03</td><td></td></tr><tr><td>Czerwona (627nm) Rebel LED na podstawie kwadratowej SinkPAD-II 10mm - 65 lm @ 700mA</td><td>LuxeonStarLEDs</td><td>SP-05-R5</td><td></td></tr><tr><td>pierścieniowa membrana tęczówki</td><td>ThorLabs</td><td>SM1D12D</td><td></td></tr><tr><td>T-Cube</td> LED <td>ThorLabs</td><td>LEDD1B, KPS101</td><td></td></tr><tr><td><mocne>Molds</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wsporniki sześciokątne z gwintem wewnętrznym,&nbsp; 3 1/2" 10-32, częściowo gwintowany 1/2"</td><td>McMaster</td><td>91920A046</td><td></td></tr><tr><td>niskoprofilowy&nbsp; C-Clamp</td><td>McMaster</td><td>1705A12</td><td></td></tr><tr><td>Czynniki wzrostu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenozyna 3&prime;,5&-cykliczny monofosforan</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9501-1G</td><td></td></tr><tr><td>CHIR 99021, 10 mg</td><td>Tocris</td><td>4423/10</td><td></td></tr><tr><td>DAPT 10 mg</td><td>R& D Systems</td><td>2634/10</td><td></td></tr><tr><td>Human CNTF, klasa badawcza, 5 i mikro; g</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-096-336</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie białko witronektyny, CF</td><td>R& D Systems</td><td>2349-VN-100</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie białko witronektyny, CF</td><td>R& D Systems</td><td>2349-VN-100</td><td></td></tr><tr><td>IGF1 Rekombinowane białko ludzkie</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PHG0078</td><td></td></tr><tr><td>Białko myszy Laminin, naturalne</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko grypsy</td><td>R& D Systems</td><td>6624-AG-050</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko GDNF, CF 50ug</td><td>R& D Systems</td><td>212-GD-050/CF</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka neurotrofina 3&nbsp; 100 ug</td><td>Nauki o komórkach</td><td>CRN500D</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka neurotrofina-4</td><td>Nauki o komórkach</td><td>CRN501B</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki jeż dźwiękowy / Shh (C24II) N-Endus</td><td>R& D Systems</td><td>1845-SH-100</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany człowiek/mys/szczur BDNF 50 ug</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>Kwas retinowy, 50 mg</td><td>Millipore Sigma</td><td>R2625-50</td><td></td></tr><tr><td>SAG Wygładzony agonista</td><td>Millipore Sigma</td><td>566660</td><td></td></tr><tr><td>SB431542 10 mg</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>72234</td><td></td></tr><tr><td>StemMACS LDN-193189</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-103-925</td><td></td></tr><tr><td>Witronektyna z ludzkiego osocza</td><td>Millipore Sigma</td><td>V8379-50UG</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorowodorek</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-aktynina mAb (mysia IgG1)</td><td>Abcam</td><td>ab9465</td><td></td></tr><tr><td>Acetylotransferaza choliny (ChAT) (koza)</td><td>Millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>Desmin mAb (mysz IgG1)</td><td>Dako</td><td>M076029-2</td><td></td></tr><tr><td>Ciężki łańcuch miozyny (MHC) (mysz IgG2b)</td><td>DSHB</td><td>MF20</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arduino Uno R3</td><td>Arduino</td><td>A000066</td><td></td></tr><tr><td>Etap zautomatyzowany</td><td>Stosowane oprzyrządowanie naukowe</td><td>MS-2000 XYZ</td><td></td></tr><tr><td>Rozszerzona myjka</td><td>plazmowa Harrick Plasma</td><td>PDC-001&nbsp;( 115V)</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Countess Automatyczny licznik komórek</td><td>Marshal Scientific</td><td>I-CACC</td><td></td></tr><tr><td>IX-81 Odwrócony mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td>IX-ILL100LH</td><td></td></tr><tr><td>Series Stage Top Incubator System</td><td>Tokai Hit STX</td><td>TOKAI-HIT-STXG</td><td></td></tr><tr><td>Zyla 4.2 sCOMS Kamera</td><td>Andor Technology</td><td>ZYLA-4.2P-CL10</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Arduino (IDE)</td><td>Arduino</td><td>IDE 1.8.19</td><td></td></tr><tr><td>Mastercam</td><td>Mastercam Mastercam</td><td>dla Solidworks</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Matlab</td><td>R2021b</td><td></td></tr><tr><td>Elementy NIS</td><td>Nikon</td><td>Badania podstawowe</td><td></td></tr><tr><td>Solidworks 3D CAD</td><td>Solidworks Solidworks</td><td>Standard</td><td></td></tr></tbody></table>

inżynieria i charakterystyka modelu optogenetycznego ludzkiego połączenia nerwowo-mięśniowego

Engineering and Characterization of an Optogenetic Model of the Human Neuromuscular Junction

Wiele chorób nerwowo-mięśniowych, takich jak miastenia (MG), wiąże się z dysfunkcją połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ), która jest trudna do scharakteryzowania w modelach zwierzęcych ze względu na fizjologiczne różnice między zwierzętami a ludźmi. Inżynieria tkankowa oferuje możliwości dostarczania modeli in vitro funkcjonalnych ludzkich NMJ, które można wykorzystać do diagnozowania i badania patologii NMJ oraz testowania potencjalnych środków terapeutycznych. Poprzez włączenie białek optogenetycznych do indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), wygenerowaliśmy neurony, które mogą być stymulowane za pomocą określonych długości fal świetlnych. Jeśli NMJ jest zdrowy i funkcjonalny, sygnał neurochemiczny z neuronu ruchowego powoduje skurcz mięśni. Dzięki integracji optogenetyki i mikrofabrykacji z inżynierią tkankową opracowaliśmy bezstronną i zautomatyzowaną metodologię charakteryzowania funkcji NMJ za pomocą analizy wideo. Opracowano ustandaryzowany protokół tworzenia NMJ, stymulacji optycznej z jednoczesnym zapisem wideo oraz wideoanalizy kurczliwości tkanek. Stymulacja optogenetycznych neuronów ruchowych za pomocą światła w celu wywołania skurczów mięśni szkieletowych podsumowuje ludzką fizjologię NMJ i pozwala na wielokrotne pomiary funkcjonalne NMJ w czasie i w odpowiedzi na różne dane wejściowe. Wykazujemy zdolność tej platformy do wykazywania funkcjonalnej poprawy łączności nerwowo-mięśniowej w czasie i charakteryzujemy szkodliwy wpływ przeciwciał MG lub neurotoksyn pacjenta na funkcję NMJ.

Złącza nerwowo-mięśniowe utworzono poprzez kokulturę optogenetycznych motoneuronów pochodzących z hiPSC z nieoptogenetyczną tkanką mięśni szkieletowych. Pierwotne ludzkie mioblasty szkieletowe (SkM) wysiano na platformy i zróżnicowano w wielojądrowe miotuby zgodnie z dwutygodniowym protokołem. Motoneurony optogenetyczne różnicowano oddzielnie, lecz równolegle do różnicowania miotub, a następnie wysiano je na platformę (Rysunek 1). Tkanki zaczęły kurczyć się w odpowiedzi na stymulację światłe...

Opisujemy powtarzalny, zautomatyzowany i bezstronny system obrazowania do charakteryzowania funkcji połączeń nerwowo-mięśniowych przy użyciu ludzkiej tkanki mięśniowej i optogenetycznych neuronów ruchowych. System ten pozwala na funkcjonalną kwantyfikację połączeń nerwowo-mięśniowych w czasie i wykrywa zmniejszone funkcje nerwowo-mięśniowe spowodowane przez neurotoksyny i surowicę pacjenta z miastenią.

Inżynieria i charakterystyka modelu optogenetycznego ludzkiego połączenia nerwowo-mięśniowego

Many neuromuscular diseases, such as myasthenia gravis (MG), are associated with dysfunction of the neuromuscular junction (NMJ), which is difficult to ...

Protokół ten opisuje, w jaki sposób zaprojektować funkcjonalne 3D ludzkie połączenia nerwowo-mięśniowe in vitro, które można wykorzystać do badania patologii nerwowo-mięśniowych i testowania potencjalnych środków terapeutycznych. Technika ta wykorzystuje jednoczesną stymulację optogenetyczną i przetwarzanie wideo. Jest to ilościowo określone zmiany w funkcji połączeń nerwowo-mięśniowych podczas rozwoju i spowodowane czynnikami zewnętrznymi, takimi jak neurotoksyny i surowica pacjentów z miastenią.Etapy związane z wprowadzaniem komórek mięśniowych i neuronów ruchowych do bioreaktora mogą być na początku trudne. Utrzymywanie mieszanki żelu kolagenowego na lodzie może pomóc wydłużyć czas dostępny na zasianie wszystkich komórek, zanim żel zestala się. Zacznij od zmieszania mieszaniny 10 do 1 zasady z utwardzaczem polidimetylosiloksanu lub PDMS i umieść mieszaninę w komorze próżniowej.Zamknij wszystkie zawory i włącz podciśnienie, aby odgazować mieszaninę przez co najmniej 30 minut, aż nie pozostaną pęcherzyki powietrza. Wlej mieszaninę do foremek i odgazuj foremki w komorze próżniowej przez 1 godzinę, a następnie zamknij foremki górną połową formy we właściwej orientacji. Umieść sześciokątny pręt stalowy na środku i clamp po obu stronach.Następnie napełnij wierzch PDMS i utwardź foremki w piekarniku o temperaturze 65 stopni Celsjusza przez co najmniej 4 godziny. Po ostygnięciu form do temperatury pokojowej wyjmij platformy z form. W międzyczasie szkiełka nakrywkowe zanurza się w 1% niejonowym poliolu środka powierzchniowo czynnego przez 30 minut, upewniając się, że szkiełka nakrywkowe nie układają się w stosy i są odpowiednio pokryte, a następnie dobrze spłucz je wodą destylowaną i wysusz przez noc w temperaturze 65 stopni Celsjusza.Szkiełka nakrywkowe szklanej pokrywy i platformę PDMS należy traktować za pomocą myjki plazmowej na wysokim poziomie z 6 litrami tlenu na minutę przez 1 do 2 minut. Po poddaniu działaniu należy je ze sobą połączyć, dociskając PDMS do szkiełka nakrywkowego przez co najmniej 30 sekund. Przygotuj mieszankę 4 do 1 3 miligramów na mililitr kolagenu 1 i rozpuszczoną macierz błony podstawnej, a następnie ponownie zawieś mioblasty w tej świeżo przygotowanej mieszance kolagenu.Następnie dodaj 15 mikrolitrów tej zawiesiny kolagenu komórkowego do każdej komory mięśniowej bioreaktora, upewniając się, że zawiesina została rozprowadzona na obu filarach za pomocą końcówki pipety. Pozwól mieszaninie żelu komórkowego polimeryzować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, a następnie napełnij każdy bioreaktor 450 mikrolitrami miotonicznej pożywki wzrostowej. W 11 dniu różnicowania neuronów ruchowych przenieś komórki i pożywki do 50-mililitrowej rurki i pozwól neurosferom osiąść na dnie przez 5 minut.Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 15 mililitrach pożywki do hodowli zawiesiny neuronów ruchowych uzupełnionej 20 nanogramami na mililitr neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego i 10 nanogramów na mililitr neurotroficznego czynnika pochodzącego z komórek glejowych. W 14 dniu protokołów różnicowania umieść motoneurony w platformie. Przygotuj mieszaninę żelu 4 do 1 zawierającą 2 miligramy na mililitr kolagenu 1 i rozpuszczoną macierz błony podstawnej.Użyj 400-nanometrowego sitka komórkowego, aby wybrać duże neurosfery i ponownie zawiesić je w przygotowanej mieszaninie żelu. Ostrożnie odessać pożywkę ze zbiornika i dobrze neurosfery, a następnie dodać 15 mikrolitrów mieszaniny żelu do kanału neurosfery. Załaduj pipetę o pojemności 10 mikrolitrów z 10 mikrolitrami żelu i wybierz jedną neurosferę.Umieść neurosferę w kanale neurosfery, upewniając się, że znajduje się w komorze, a następnie powoli podnieś pipetę, uwalniając pozostały żel, gdy neurosfera zostanie zdeponowana. Pozostaw żel do polimeryzacji przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie dodaj do zbiorników 450 mikrolitrów NbActiv4 uzupełnionych 20 nanogramami na mililitr czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego i 10 nanogramów na mililitr neurotroficznego czynnika pochodzącego z komórek glejowych. Do obrazowania należy użyć odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z naukowym komplementarnym oprogramowaniem kamery półprzewodnikowej metalowo-tlenkowej.Ustaw binning na 2 na 2, ekspozycję na 20 milisekund, włączoną migawkę typu rolling shutter, częstotliwość odczytu na 540 megaherców, zakres dynamiczny na 12 bitów i wzmocnienie 1 oraz tryb czujnika na nakładanie się. Użyj obiektywu 2x na mikroskopie, aby zobrazować mikrotkanki i przymocuj komorę żywych komórek do stolika mikroskopu. Wybierz obszar zainteresowania, który zawiera unerwione tkanki szkieletowe, aby zminimalizować rozmiar pliku i czas przetwarzania, a następnie umieść filtr emisyjny o długości 594 nanometrów między próbką a obiektywem obrazowania, aby odfiltrować impulsy światła niebieskiego z kamery.Następnie umieść prostokątną 4-dołkową płytkę zawierającą cztery bioreaktory w komorze żywych komórek, a następnie kliknij podgląd na żywo i wyśrodkuj, a następnie ustaw ostrość obrazu z żądanym zwrotem akcji. Pobierz niestandardowy kod makra z folderu GitHub, aby kontrolować pozycję stołu montażowego, płytę Arduino i akwizycję wideo, a następnie ustaw film wyjściowy jako dzień podkreślenie grupy tkanek podkreślenie nazwa tkanki podkreślenie eksperyment kropka ND2. Uruchom kod makra z żądanymi współrzędnymi X i Y ustawionymi na stole montażowym i uzyskaj szybki upływ czasu z 1700 klatkami przy 50 klatkach na sekundę.Po zobrazowaniu należy wymienić pożywkę i umieścić próbki z powrotem w inkubatorze. Odczekaj co najmniej 24 godziny między sesjami pozyskiwania obrazu, aby uniknąć zmęczenia tkanek. W przypadku przetwarzania filmów pobierz pliki z folderu GitHub i użyj niestandardowego kodu MATLAB do przetworzenia filmów w analizie wsadowej.Otwórz skrypt cyklicznej analizy systemu operacyjnego, aby wszystkie pobrane filmy wideo znajdowały się w tym samym folderze. Dostosuj parametry analizy wstępnej i uruchom skrypt recursiveOSAnalysis, aby przeanalizować filmy za pomocą przetwarzania równoległego. W razie potrzeby dostosuj parametry po analizie, takie jak czas linii bazowej, próg szczytu, widoczność min-min i minimalna szerokość.Na koniec wygeneruj dane wyjściowe wideo i wykresu, uruchamiając recursiveOSMovie, aby wygenerować plik wideo dla każdej tkanki z odpowiednim śladem kurczliwości. Protokół ten został przetestowany przy użyciu dwóch systemów o różnej skali, urządzenia mikroprzepływowego dającego tkanki mięśni szkieletowych o długości 1 milimetra składającej się z około 20 000 mioblastów oraz systemu bioreaktora z otwartą studnią, w wyniku czego powstały 4-milimetrowe tkanki mięśniowe składające się z około 450 mioblastów. Konfiguracja optyczna została zbudowana, aby umożliwić kontrolowaną stymulację neuronów ruchowych za pomocą niebieskiego światła, a funkcja NMJ została podniesiona za pomocą niestandardowego skryptu makromikroskopu sparowanego z niestandardowym kodem Arduino.Kod ten zawiera regulowane parametry i określa, czy skurcz jest wyzwalany na podstawie czasu między impulsem świetlnym a początkiem szczytu kurczliwości. System zarejestrował poprawę funkcji NMJ w tkankach, wykazując wzrost wyzwolonych odpowiedzi tydzień po wytworzeniu tkanki, a następnie stabilną funkcję przez dodatkowy tydzień. Alfa-bungarotoksyna zatrzymała wszystkie wywołane i spontaniczne skurcze, które doprowadziły do całkowitego zakłócenia funkcji NMJ, wykazując, że stymulacja światłem tkanek wymaga funkcjonalnego NMJ.Analiza tkanek traktowanych surowicą 20% miastenii przez 48 godzin wykazała zmniejszoną funkcję w porównaniu z tkankami kontrolnymi leczonymi surowicą od zdrowych dawców. 48 godzin po usunięciu i wypłukaniu surowicy, zmodyfikowane NMJ wykazały odzyskanie funkcji. Upewnij się, że wszystkie bioreaktory są w piecu przez równy czas, aby uniknąć zmienności sztywności między partiami.Pamiętaj również, aby zweryfikować wysiewanie neuronów ruchowych za pomocą mikroskopu. Po tej procedurze można przeprowadzić metabalomikę, proteomikę i badania przesiewowe CRISPR w celu zebrania dodatkowych informacji i lepszego zrozumienia zmian mechanistycznych spowodowanych chorą surowicą.

engineering-characterization-an-optogenetic-model-human-neuromuscular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Film pokazuje tworzenie połączeń nerwowo-mięśniowych za pomocą urządzenia mikroprzepływowego. Neuronalne komórki prekursorowe i komórki progenitorowe mięśni są umieszczane w różnych studzienkach w urządzeniu i pozostawiane do dojrzewania odpowiednio w neuronach ruchowych i miotubach. Stworzenie gradientu objętościowego i chemicznego prowadzi do rozwoju aktywnych połączeń nerwowo-mięśniowych.

Generowanie połączeń nerwowo-mięśniowych za pomocą urządzenia mikroprzepływowego

Ten film demonstruje metodę oceny funkcjonalnych połączeń nerwowo-mięśniowych. Za pomocą bioreaktora zawierającego tkankę mięśniową i neurony ruchowe, wraz z mikroskopią fluorescencyjną, wrażliwe na światło kanały w neuronach są stymulowane do generowania sygnałów elektrycznych, powodując skurcze włókien mięśniowych.

Ocena funkcjonalnego połączenia nerwowo-mięśniowego za pomocą jednoczesnej stymulacji optycznej i nagrywania wideo

Źródło: Marinello, M., et al. Charakterystyka połączeń nerwowo-mięśniowych u myszy za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej. J. Vis. Exp. (2021)Ten film przedstawia przygotowanie, barwienie immunologiczne i obrazowanie połączeń nerwowo-mięśniowych w tkance mięśniowej szczura przy użyciu mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej do wizualizacji i analizy struktur presynaptycznych i postsynaptycznych.

Charakterystyka połączeń nerwowo-mięśniowych u myszy za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej

Ocena funkcjonalna połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) może dostarczyć istotnych informacji na temat komunikacji między mięśniem a nerwem. W tym miejscu opisujemy protokół kompleksowej oceny zarówno NMJ, jak i funkcjonalności mięśni przy użyciu dwóch różnych preparatów mięśniowo-nerwowych, tj. płaszczkowato-kulszowego i przeponowo-przeponowego.

Pomiar funkcjonalności połączenia nerwowo-mięśniowego

Tutaj udostępniamy protokół do generowania in vitro NMJ z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Ta metoda może indukować NMJ o dojrzałej morfologii i funkcji w ciągu 1 miesiąca w jednym dołku. Powstałe w ten sposób NMJ mogą być potencjalnie wykorzystane do modelowania powiązanych chorób, badania mechanizmów patologicznych lub badań przesiewowych związków leczniczych do terapii.

Połączenie nerwowo-mięśniowe in vitro indukowane z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Zdolność do dokładnego wykrywania komponentów połączenia nerwowo-mięśniowego jest kluczowa w ocenie zmian w jego architekturze spowodowanych procesami patologicznymi lub rozwojowymi. Poniżej przedstawiamy pełny opis prostej metody uzyskiwania wysokiej jakości obrazów całych połączeń nerwowo-mięśniowych, które można wykorzystać do wykonywania pomiarów ilościowych.

Rozwarstwienie pojedynczych włókien mięśni szkieletowych do analiz immunofluorescencyjnych i morfometrycznych połączeń nerwowo-mięśniowych w całości

Opisujemy metodę generowania ludzkich jednostek motorycznych w komercyjnie dostępnych urządzeniach mikroprzepływowych poprzez kokulturację ludzkich indukowanych pluripotencjalnych neuronów ruchowych pochodzących z komórek macierzystych z ludzkimi pierwotnymi miotubami pochodzącymi z mezoangioblastów, co prowadzi do powstania funkcjonalnie aktywnych połączeń nerwowo-mięśniowych.

Generacja jednostek motorycznych człowieka z funkcjonalnymi połączeniami nerwowo-mięśniowymi w urządzeniach mikroprzepływowych

Ten protokół opisuje metodę analizy morfometrycznej połączeń nerwowo-mięśniowych za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i STED, która jest używana do ilościowego określania zmian patologicznych w mysich modelach SMA i CMS związanych z ColQ.

Protokół pokazuje metodę badania korelacji przestrzennej między zakończeniami presynaptycznymi, receptorami postsynaptycznymi i okołosynaptycznymi komórkami Schwanna w mięśniu brzuchatym łydki szczura przy użyciu immunohistochemii fluorescencyjnej z różnymi biomarkerami, a mianowicie: neurofilamentem 200, pęcherzykowym transporterem acetylocholiny, alfa-bungarotoksyną i S100.

Wizualizacja cech morfologicznych połączenia nerwowo-mięśniowego w mięśniu brzuchatym łydki przyśrodkowym szczura

W tym badaniu demonstrujemy wyrafinowany protokół elektromiografii pojedynczego włókna (SFEMG), który umożliwia pomiar in vivo transmisji połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) w modelach gryzoni. Opisano podejście krok po kroku do techniki SFEMG, aby umożliwić ilościowe określenie zmienności transmisji NMJ i niewydolności mięśnia brzuchatego łydki szczura.

Stymulowana elektromiografia pojedynczych włókien (SFEMG) do oceny transmisji połączeń nerwowo-mięśniowych w modelach gryzoni

Tutaj prezentujemy protokół, który łączy elektroporację in vivo i denerwację mięśnia dźwigacza długiego czaszki (LAL). Zabieg ten umożliwia badanie potencjalnej roli białek pochodzenia mięśniowego w regeneracji synapsy nerwowo-mięśniowej.

Połączona elektroporacja in vivo i krótkotrwałe unerwienie mięśnia szkieletowego dźwigacza bocznego zorza długiego czaszki

Poznaj metodę inżynierii 3D ludzkich połączeń nerwowo-mięśniowych z wykorzystaniem optogenetycznej stymulacji i przetwarzania wideo. Technika umożliwia ilościową ocenę funkcji NMJ oraz wykrywanie zmian wywołanych neurotoksynami i surowicą chorych na miastenię.

Inżynieria i charakterystyka modelu optogenetycznego ludzkiego połączenia nerwowo-mięśniowego

Przeglądaj więcej filmów