JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 1:58 min • July 8th, 2025
Weź hodowlę komórkową zawierającą neuronalne komórki rakowe przyczepione do szkiełka nakrywkowego i utrzymuj ją w niskich temperaturach.
Usunąć pożywkę hodowlaną i kilkakrotnie przemyć komórki zimnym buforem fosforanowym w celu wyeliminowania pozostałej pożywki.
Dodać bufor do lizy zawierający niskie stężenie niejonowego detergentu i inhibitorów proteazy.
Niejonowy detergent przerywa błonę komórkową, inicjując lizę.
Tymczasem inhibitory proteazy blokują komórkowe enzymy proteolityczne, chroniąc białka przed degradacją enzymatyczną.
Następnie użyj skrobaka do komórek, aby usunąć częściowo zlizowane komórki ze szkiełka nakrywkowego.
Przenieść zawartość do probówki zawierającej bufor do lizy.
W niskich temperaturach użyj homogenizatora do mechanicznej lizy komórek, zapewniając całkowitą lizę komórek i uwolnienie białka.
Odwirować lizat komórkowy.
Zebrać sklarowany osad do świeżej probówki.
Wyekstrahowane białka z neuronalnych komórek nowotworowych są teraz gotowe do dalszej analizy.
W celu walidacji ekspresji białka, 48 godzin po transfekcji umieść szalki hodowlane na lodzie i umyj komórki dwa razy PBS. Potraktuj komórki w każdym naczyniu 200 do 400 mikrolitrami buforu do lizy i użyj skrobaka do komórek, aby usunąć komórki z szkiełek nakrywkowych.
Przenieś oderwane komórki z każdej płytki do oddzielnych probówek mikrowirówek i dalej dysocjuj komórki za pomocą homogenizatora pod lodem. Po jednej minucie zdegranulowane kawałki komórek osadzają się przez odwirowanie.
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje protokół ekstrakcji białek z komórek raka neuronalnego hodowanych na szkiełkach nakrywkowych. Metoda ta polega na lizie komórek w warunkach chłodniczych w celu zachowania integralności białek do późniejszych analiz.
Ekstrakcja białek z nowotworowych komórek neuronalnych umożliwia wiarygodną analizę biochemiczną w celu walidacji celów terapeutycznych oraz badań mechanistycznych w procesie opracowywania leków w neuroonkologii. Protokół ten zapewnia powtarzalne przygotowanie próbek w kontrolowanych warunkach, co redukuje zmienność w dalszych analizach. Ułatwia to testowanie hipotez na wczesnym etapie oraz ocenę biomarkerów w modelach guzów neuronalnych.
Metoda ta wpisuje się w wczesny etap procesu odkrywania leków, wspierając walidację celu oraz rozwój testów przed etapami identyfikacji związków wiodących.
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ostatnia aktualizacja: 22 sierpnia 2026