Ekstrakcja białek z komórek neuronalnych

Weź hodowlę komórkową zawierającą neuronalne komórki rakowe przyczepione do szkiełka nakrywkowego i utrzymuj ją w niskich temperaturach.

Usunąć pożywkę hodowlaną i kilkakrotnie przemyć komórki zimnym buforem fosforanowym w celu wyeliminowania pozostałej pożywki.

Dodać bufor do lizy zawierający niskie stężenie niejonowego detergentu i inhibitorów proteazy.

Niejonowy detergent przerywa błonę komórkową, inicjując lizę.

Tymczasem inhibitory proteazy blokują komórkowe enzymy proteolityczne, chroniąc białka przed degradacją enzymatyczną.

Następnie użyj skrobaka do komórek, aby usunąć częściowo zlizowane komórki ze szkiełka nakrywkowego.

Przenieść zawartość do probówki zawierającej bufor do lizy.

W niskich temperaturach użyj homogenizatora do mechanicznej lizy komórek, zapewniając całkowitą lizę komórek i uwolnienie białka.

Odwirować lizat komórkowy.

Zebrać sklarowany osad do świeżej probówki.

Wyekstrahowane białka z neuronalnych komórek nowotworowych są teraz gotowe do dalszej analizy.

W celu walidacji ekspresji białka, 48 godzin po transfekcji umieść szalki hodowlane na lodzie i umyj komórki dwa razy PBS. Potraktuj komórki w każdym naczyniu 200 do 400 mikrolitrami buforu do lizy i użyj skrobaka do komórek, aby usunąć komórki z szkiełek nakrywkowych.

Przenieś oderwane komórki z każdej płytki do oddzielnych probówek mikrowirówek i dalej dysocjuj komórki za pomocą homogenizatora pod lodem. Po jednej minucie zdegranulowane kawałki komórek osadzają się przez odwirowanie.