Ocena integralności strukturalnej połączeń nerwowo-mięśniowych mięśni grzbietowych podłużnych u Drosophila

Zacznij od chemicznie utrwalonych torów Drosophila typu dzikiego i transgenicznego w buforze.

W transgenicznych klatkach piersiowych połączenia nerwowo-mięśniowe mięśni podłużnych grzbietu zawierają neurony, które wyrażają zmutowane białko indukujące neurodegenerację.

Usuń bufor i błyskawicznie zamroź klatkę piersiową, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek podczas bisekcji.

Dodaj świeży bufor i przenieś klatkę piersiową do naczyń preparacyjnych.

Ustaw klatkę piersiową brzuszną stroną do góry i usuń skupiska komórek nerwowych, aby odsłonić linię środkową.

Przetnij na pół wzdłuż linii środkowej, aby uzyskać półkrwi.

Usuń nadmiar tkanki.

Inkubuj półkrwi w buforze blokującym, aby przepuszczalnie błony i zapobiec wiązaniu się niespecyficznych przeciwciał.

Dodaj przeciwciała sprzężone z fluoroforem skierowane przeciwko glikoproteinie ulegającej ekspresji w neuronach NMJ i włóknach aktyny mięśniowej.

Usuń niezwiązane przeciwciała.

Ułóż półwody na szkiełku mostkowym, dodaj podłoże montażowe i zamontuj tkanki.

Wizualizacja pod mikroskopem.

W porównaniu z typem dzikim, mutanty wykazują zmniejszone zabarwienie neuronów, co wskazuje na neurodegenerację, podczas gdy mięśnie wykazują nienaruszoną fluorescencję.

Przed rozpoczęciem bisekcji załóż rękawice krioochronne i okulary ochronne oraz napełnij kolbę Dewara ciekłym azotem. Użyj łamacza ostrzy, aby chwycić ostrze piór pod kątem i zegnij ostrze, aby odłamać mały kawałek. Użyj łamacza ostrzy, aby zablokować ostrze na miejscu i użyj szklanej pipety Pasteura, aby usunąć cały PBS z probówek do próbek.

Użyj pęsety kriogenicznej, aby zanurzyć probówki w kolbie z ciekłym azotem. Po 10 sekundach za pomocą pipety Pasteura dodaj około 300 mikrolitrów lodowatego PBS do każdej probówki na lodzie i umieść jedną klatkę piersiową brzuszną stroną do góry w 10-centymetrowym naczyniu preparacyjnym pokrytym elastomerem silikonowym zawierającym lodowaty PBS. Użyj pary kleszczy, aby ustawić klatkę piersiową i cienkiej pary kleszczy, aby usunąć część zwojów piersiowych, aby odsłonić linię środkową klatki piersiowej.

Używając linii środkowej klatki piersiowej jako przewodnika, użyj ostrza, aby wykonać płytkie cięcie przez jedną trzecią klatki piersiowej i użyj kleszczy, aby ustawić klatkę piersiową pod kątem 45 stopni. Użyj ostrza, aby przeciąć prosto w dół linii środkowej klatki piersiowej, aby uzyskać dwie krwioraki i ostrożnie wykonaj jedno lub dwa cięcia, aby usunąć nadmiar tkanki bez uszkadzania mięśni podłużnych grzbietu. Następnie umieść próbki tkanki mięśniowej w odpowiednio oznakowanej probówce PBS.

Gdy wszystkie próbki klatki piersiowej zostaną przecięte na pół, należy przepuścić tkanki w buforze blokującym przez co najmniej godzinę w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji należy odwirować świeżo przygotowany roztwór barwienia strukturalnego i dodać 150 mikrolitrów barwnika do każdej próbki na dwugodzinną inkubację na rotatorze w temperaturze pokojowej w ciemności. Po zabarwieniu umyj próbki w PBST i umieść pięć etykiet wzmacniających ułożonych w stos i przeciętych na pół, w odległości 15 mililitrów od siebie, na jednym szklanym szkiełku mikroskopowym.

Użyj zmodyfikowanej końcówki mikropipety, aby przenieść klatkę piersiową na każde szkiełko i użyj chusteczki laboratoryjnej, aby usunąć nadmiar PBST. Użyj kleszczy, aby ułożyć próbki w taki sposób, aby klatka piersiowa była skierowana mięśniowo do góry. Gdy próbki są prawidłowo zorientowane, użyj końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby nałożyć 70 mikrolitrów podłoża montażowego na każde szkiełko i przykryj każde szkiełko szkiełkiem nakrywkowym. Następnie użyj lakieru do paznokci, aby obficie pokryć zewnętrzne krawędzie szkiełek nakrywkowych, aby uzyskać pełne uszczelnienie wokół każdej tkanki.