Masowa histologia w celu ilościowego określenia neurodegeneracji u Drosophila
December 15th, 2016
Drosophila jest powszechnie używana jako system modelowy do badania neurodegeneracji. Protokół ten opisuje metodę, za pomocą której można określić ilościowo zwyrodnienie, określone przez tworzenie się wakuoli w mózgu. Minimalizuje również efekty wynikające z procedury eksperymentalnej poprzez przetwarzanie i dzielenie much kontrolnych i eksperymentalnych jako jednej próbki.
Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie neurodegeneracji w mózgu Drosophila, spowodowanej różnymi czynnikami, w tym wiekiem, modyfikacjami genetycznymi lub wpływami środowiska, bez potrzeby specjalnego barwienia. Metoda ta jest bardzo przydatna w analizie kluczowych pytań z zakresu chorób neurodegeneracyjnych. Na przykład, jakie geny lub czynniki środowiskowe powodują lub przyczyniają się do tych chorób?
Główną zaletą tej metody jest to, że pozwala uniknąć lub zminimalizować błędy systematyczne, ponieważ muchy kontrolne i muchy doświadczalne są traktowane jako jedna próbka. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie mogą mieć problemy, ponieważ wymaga to praktyki, aby upewnić się, że właściwy obszar mózgu znajduje się na szkiełku i zapobiec uszkodzeniom, które mogą wystąpić podczas cięcia. Na początek najpierw użyj kleszczy, aby nawlec muchy przedmiotowe za szyję do obroży.
Ustaw wszystkie głowice w tej samej orientacji i upewnij się, że nie dojdzie do uszkodzenia głowy lub oczu. Uwzględnij bezokie muchy Senoculus w losowych, znanych pozycjach, aby kolejność much można było łatwo zidentyfikować w sekcjach. Dodatkowo, jeśli interesujący szczep muchy ma jasne lub białe oczy, nawlecz muchy o czerwonych oczach w odstępach wzdłuż paska, aby zapewnić wystarczającą ilość pigmentu do zabarwienia szkiełka.
Zapisz kolejność much wraz z numerem obroży, jeśli używana jest więcej niż jedna. Gdy obroża jest gotowa, umieść ją w roztworze Carnoya na trzy punkty, pięć do czterech godzin. Wykonaj serię płukań etanolem, benzoesanem metylu i parafiną, aby przygotować tkankę muchy do zatopienia.
Następnie umieść obroże w gumowej tacce na kostki lodu, na każdej sekcji. Delikatnie wlej stopioną parafinę na kołnierze, unikając pęcherzyków powietrza i pozwól jej stwardnieć przez noc. Wyjmij bloki parafiny zawierające kołnierze z tacy.
Oddziel blok parafiny od kołnierza za pomocą żyletki. Delikatnie odrywa kołnierz. Ciała pozostaną w kołnierzu, natomiast głowy pozostaną w bloku parafinowym.
Aby podzielić tkankę, najpierw podgrzej płytę grzewczą do 50 stopni Celsjusza. Umieść na talerzu wszelkie narzędzia, które będą miały kontakt z woskiem, takie jak żyletki lub metalowe klocki montażowe, aby się rozgrzały. Określ żądaną orientację cięcia, a następnie przymocuj segment parafiny do bloku montażowego, krótko topiąc go po stronie styku.
Za pomocą żyletki odetnij nadmiar parafiny od główek much, tak aby pozostał tylko mały rząd zawierający osadzone głowice. Umieść blok montażowy w uchwycie na przedmioty Microtome, wyrównując głowice równolegle do krawędzi ostrza. Wytnij siedem odcinków mikrometrycznych i przenieś wstęgę sekcji na szkiełka mikroskopowe.
Umieść szkiełka na rozgrzanej płycie w temperaturze 37 stopni Celsjusza na około minutę, aby wstążka mogła się rozszerzyć. Usuń nadmiar wody, a następnie pozostaw szkiełka do dalszego wyschnięcia przez noc. Po wyschnięciu usuń wosk parafinowy, umieszczając szkiełka pionowo w wysokim słoiku do barwienia szkiełek, wypełnionym środkiem deparafinowającym na 30 minut do jednej godziny.
Powtórz to pranie trzy razy. Na koniec wyjmij szkiełka ze słoika i umieść dwie krople podłoża do zatapiania na każdej z nich. Przykryj sekcje dużym szkiełkiem nakrywkowym i pozostaw szkiełka do wyschnięcia na jeden do dwóch dni.
W małym powiększeniu pod mikroskopem fluorescencyjnym określ orientację mózgu i skup się na obszarze zainteresowania. Po zidentyfikowaniu tego obszaru wykonaj wymagane zdjęcia. Za pomocą oprogramowania do obrazowania policz liczbę wakuoli na głowę.
Zmierz rozmiar wakuoli, wybierając interesującą Cię wakuolę i określając liczbę pokrytych pikseli. Ten obraz pokazuje sekcje z różnych głowic muchowych zorientowanych od lewej do prawej. Od góry do dołu wizualizowane są sekcje szeregowe z tej samej głowicy muchowej.
Bezoka mucha kontrolna Senoculus jest oznaczona strzałką. Skrawki są barwione naturalnie występującym fluorescencyjnym pigmentem do oczu, który spływa na skrawki podczas cięcia. Skrawki głowy parafiny z siedmio-, 14- i 21-dniowego sera Swiss Cheese One flys, wykazują postępujący związany z wiekiem wzrost liczby i powierzchni wakuoli.
To zwyrodnienie można określić ilościowo, licząc wakuole i obliczając łączną powierzchnię, i okazuje się, że jest znaczące. Podobnie u much typu dzikiego wykazano, że neurodegeneracja zachodzi wraz z wiekiem. Podczas badania odcinków głowy 10, 30 i 60-dniowych much typu dzikiego zaobserwowano, aby w ciągu 10 dni powstało niewiele wakuoli lub nie utworzyły się żadne.
W mózgach 30-dniowych osobników zaczynały się formować wakuole. U osób 60-dniowych występowało znacznie więcej wakuoli o większej powierzchni. Po opanowaniu sekcje mogą być dostępne do analizy w ciągu tygodnia.
Podczas korzystania z tej procedury ważne jest, aby dokładnie zapisać kolejność much w obroży. Aby upewnić się, że możesz je zidentyfikować później, po analizie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować sekcje i określić ilościowo neurodegenerację znajdującą się w mózgu Drosophila.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę ilościowego określania neurodegeneracji w mózgu Drosophila, koncentrując się na formacji wakuol. Minimalizuje błędy eksperymentalne poprzez przetwarzanie much much i eksperymentalnych jako jednej próbki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Neurodegeneracja
- Organizmy modelowe
Tło
- Drosophila służy jako model do badania chorób neurodegeneracyjnych.
- Neurodegeneracja może być wpłynięta wiekiem, genetyką i środowiskiem.
- Formacja wakuoli jest kluczowym wskaźnikiem degeneracji mózgu.
- Ta metoda unika specyficznego barwienia, upraszczając analizę.
Cel badania
- Ilościowe określenie neurodegeneracji w Drosophila bez specyficznego barwienia.
- Analiza czynników przyczyniających się do chorób neurodegeneracyjnych.
- Dostarczenie niezawodnej metody dla badaczy w tej dziedzinie.
Zastosowanie metod
- Muchy są wstawiane do kołnierzy do przetwarzania.
- Muchy kontrolne i eksperymentalne są traktowane jako jedna próbka.
- Formacja wakuoli jest ilościowo określana jako wskaźnik degeneracji.
- Stosuje się ostrożność, aby zapobiec uszkodzeniom podczas przekrój.
Główne wyniki
- Metoda skutecznie ilościowo określa neurodegenerację.
- Minimalizowane systematyczne błędy poprawiają niezawodność.
- Ułatwia analizę czynników genetycznych i środowiskowych.
- Dostarcza praktycznego podejścia dla badaczy nowych w tej dziedzinie.
Wnioski
- Ten protokół jest cennym narzędziem do badania neurodegeneracji.
- Pozwalla na ocenę różnych czynników przyczyniających się do neurodegeneracji.
- Poprawia dokładność badań nad neurodegeneracją w Drosophila.
