Name: Masowa histologia w celu ilościowego określenia neurodegeneracji u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Poznaj metodę masowej histologii do ilościowego określania neurodegeneracji u Drosophila bez barwienia specyficznego. Technika minimalizuje błędy systematyczne, traktując muchy kontrolne i eksperymentalne jako jedną próbkę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty dla D.K. z Fundacji Badań Medycznych w Oregonie oraz z NIH/NINDS (NS047663). E.S. był wspierany przez grant szkoleniowy z NIH (T32AG023477).

1. Mocowanie głowy na kołnierzach i zatapianie w parafinie
Uwaga: Wszystkie etapy procesu mocowania należy wykonywać w dygestorium. Benzoesan metylu, choć nie stanowi zagrożenia dla zdrowia, ma bardzo wyraźny zapach, który może być przytłaczający, jeśli nie jest obsługiwany pod wyciągiem.
<ol>
	<li>Przed znieczuleniem muszek należy uzupełnić 50 ml roztworu Carnoya, dodając 15 ml chloroformu i 5 ml lodowatego kwasu octowego do 30 ml 99% etanolu (nie mieszać chloroformu i kwasu octowego). Wlej go do szklanego pojemnika z płaskim dnem, takiego jak naczynie krystalizujące, aby upewnić się, że kołnierze mogą leżeć płasko i są całkowicie pokryte roztworem.</li>
	<li>Znieczulić muchy CO2 lub eterem.</li>
	<li>Nawlecz muchy (do 20 w przypadku większości obroży) za szyję do obroży za pomocą kleszczy. Pamiętaj, aby ustawić wszystkie głowy w tej samej orientacji, jak pokazano na rysunku 1A, i być delikatnym, aby upewnić się, że nie dojdzie do uszkodzenia głowy lub oczu.</li>
	<li>Uwzględnij muchy sinus oculis (strzałki, ryc. 1A) w losowych pozycjach, aby kolejność much można było łatwo zidentyfikować w sekcjach. Ponadto, jeśli eksperymentalne muchy mają jasny lub biały kolor oczu, nawlecz między nimi kilka much o czerwonych oczach, takich jak dzikie, aby upewnić się, że obecna jest wystarczająca ilość pigmentu do zabarwienia szkiełka. Zapisz kolejność much na karcie protokołu wraz z numerem obroży, jeśli używasz więcej niż jednej obroży.</li>
	<li>Po wykonaniu obroży umieść ją w przygotowanym roztworze Carnoya na 3,5 - 4 godziny.</li>
	<li>Wylej roztwór Carnoya do odpowiedniego kanistra do utylizacji i rozpocznij płukanie etanolem. Upewnij się, że nalewasz powoli, aby nie przeszkadzać w umieszczeniu kołnierzy w pojemniku.</li>
	<li>Pierz obroże przez 30 minut w 99% etanolu dwukrotnie.</li>
	<li>Pierz obroże w 100% etanolu przez 1 godzinę. Pamiętaj, aby zmienić pranie na czas, aby zapobiec nadmiernemu odwodnieniu.</li>
	<li>Umieścić kołnierze w benzoesanie metylu O/N w temperaturze pokojowej. Uszczelnić pojemnik parafilmem, aby zapobiec parowaniu benzoesanu metylu.</li>
	<li>Wlać metylobenozian do odpowiedniego pojemnika jednorazowego użytku w dygestorium. Dodać wcześniej przygotowaną mieszaninę wosku parafinowego o niskiej temperaturze topnienia (56 - 57 °C) i benzoesanu metylu w stosunku 1:1 na 1h. Od tego momentu obroże muszą być przechowywane w inkubatorze w temperaturze 65 °C, aby mieć pewność, że parafina nie stwardnieje.</li>
	<li>Wylać mieszaninę metylobenzozynianu i parafiny do odpowiedniego pojemnika jednorazowego użytku, a następnie wlać stopiony czysty wosk parafinowy, przechowywany w temperaturze 65 °C, na kołnierze.</li>
	<li>Zmień parafinę po 30 minutach i powtórz to co najmniej 5 razy. Należy wykonać co najmniej 6 - 8 prań.</li>
	<li>Po zakończeniu prania umieść obroże w gumowej tacce na kostki lodu z otworami mniej więcej wielkości obroży. Wlej na nie stopioną parafinę, aż do całkowitego przykrycia i pozwól jej stwardnieć (staraj się unikać pęcherzyków powietrza).</li>
	<li>Wyjmij bloki parafiny zawierające kołnierze z tacki na kostki lodu. Oddziel blok parafiny od obroży za pomocą żyletki, delikatnie odrywając kołnierz. Głowy będą znajdować się w bloku parafinowym, podczas gdy ciała pozostaną w kołnierzu. Bloki można przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Aby wyczyścić obroże, namocz je w środku do deparafinizacji w temperaturze 65 °C w celu usunięcia parafiny, wyczyść lekkim szorowaniem i umyj w etanolu przed ponownym użyciem.</li>
</ol>
2. Sekcja i montaż
<ol>
	<li>Podgrzej płytę grzewczą do 50 °C. Umieść uchwyty na przedmioty (lub metalowe klocki montażowe) i żyletki na talerzu i pozwól im się rozgrzać.</li>
	<li>W zależności od pożądanej orientacji cięcia, blok parafinowy należy przymocować głowicami z boku (w przypadku sekcji poziomych) lub skierowanymi do góry (w przypadku sekcji czołowych) do podgrzewanego bloku montażowego (na krótko topiąc blok po stronie styku). Zdejmij blok z płyty grzewczej i pozwól mu ostygnąć przez co najmniej 10 minut, aby upewnić się, że parafina jest wystarczająco stwardniała, aby zapewnić prawidłowe uszczelnienie na bloku montażowym. Utrzymuj rząd głowic ustawiony równolegle do powierzchni bloku tak bardzo, jak to możliwe, aby zapobiec nierównym sekcjom.</li>
	<li>Weź żyletkę i odetnij nadmiar parafiny od główek much, aby pozostał tylko mały rząd z osadzonymi głowicami (żyletkę można rozgrzać dla łatwiejszego przycinania). Upewnij się, że nie przycinasz zbyt mocno, aby parafina nie pękła podczas krojenia (podczas krojenia można wykonać więcej przycinania).</li>
	<li>Umieść blok montażowy w uchwycie przedmiotu mikrotomu i upewnij się, że rząd głowic jest ustawiony jak najbardziej równolegle do krawędzi ostrza.</li>
	<li>Preparaty mikroskopowe należy przykryć cienką warstwą roztworu poli-L-lizyny (PLL) i pozostawić do wyschnięcia na 5 minut. Na krótko przed użyciem zalać je wodą.</li>
	<li>Wytnij odcinki 7 μm i przenieś wstęgę sekcji na zjeżdżalnię unoszącą się na wodzie. 
	UWAGA: Aby uzyskać cały mózg dla odcinków poziomych, zbieramy wstążkę od momentu rozpoczęcia nacinania oka, aż głowa zostanie całkowicie przecięta (cięcie od trąbki do mózgu). Może być potrzebny więcej niż jeden slajd na całą głowę.</li>
	<li>Umieść szkiełko na płycie grzewczej w temperaturze 37 °C i pozwól taśmie rozszerzyć się przez około 1 minutę.</li>
	<li>Usuń nadmiar wody (wylewając ją lub używając chusteczki) i osusz szkiełka O/N.</li>
	<li>Usuń wosk parafinowy ze szkiełka, umieszczając szkiełka w wysokim, pionowym słoiku do barwienia szkiełek wypełnionym środkiem deparafinizacyjnym (całkowicie zakrywającym sekcje). Wykonaj 3 prania po 30 min - 60 min każde.</li>
	<li>Wyjmij szkiełko z końcowego prania. Umieść 2 krople podłoża do zatapiania na szkiełku podstawowym i przykryj je dużym szkiełkiem nakrywkowym.</li>
</ol>
3. Fotografowanie i analizowanie sekcji
<ol>
	<li>Pozostaw przygotowane szkiełka do wyschnięcia na 1 - 2 dni. Następnie zbadaj je pod mikroskopem fluorescencyjnym w niebieskim świetle.</li>
	<li>Użyj mniejszego powiększenia, aby określić orientację much i znaleźć obszar zainteresowania, jeśli skupiasz się na określonym obszarze. 
	UWAGA: W przypadku much sws (patrz rysunek 2) znajdujemy sekcję, która zawiera świetne spoidło i robimy zdjęcie (zwykle w powiększeniu 40x). Analizując cały mózg (jak na rycinie 3), przewijamy wszystkie sekcje z głowy i albo fotografujemy sekcję z najcięższym fenotypem, albo wszystkie sekcje, które pokazują wakuole.</li>
	<li>W przypadku podwójnie ślepej próby należy wykonać i ponumerować zdjęcia bez znajomości genotypu, a następnie zapisać numer obroży i pozycję głowy w rzędzie, aby później je zidentyfikować.</li>
	<li>Po wykonaniu zdjęć przeanalizuj je za pomocą oprogramowania do obrazowania.</li>
	<li>Policz liczbę wakuoli na sekcję lub na głowę. Aby zmierzyć rozmiar wakuoli, otwórz obrazy w programie i wybierz wakuole za pomocą narzędzia do zaznaczania. Określ liczbę pikseli w wybranych wakuolach.</li>
	<li>W celu konwersji na μm2 należy zrobić zdjęcie szkiełka kalibracyjnego mikrometru stolikowego w powiększeniu używanym do robienia zdjęć. Określ liczbę pikseli w 100μm2, aby obliczyć współczynnik konwersji.</li>
	<li>Przelicz całkowitą liczbę pikseli na μm2, dzieląc liczbę pikseli przez współczynnik konwersji obliczony w powyższym kroku.</li>
</ol>

<ol><li>Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Caenorhabditis+elegans+as+a+model+to+study+Alzheimer%27s+disease+and+other+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Use of Caenorhabditis elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases.</a> Front Genet. 5, 279(2014).</li>
<li>Bonini, N. M., Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neurodegenerative+disease+modeling+using+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila.</a> Annu Rev Neurosci. 26, 627-656 (2003).</li>
<li>Calahorro, F., Ruiz-Rubio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+an+experimental+tool+for+the+study+of+complex+neurological+diseases%3A+Parkinson%27s+disease%2C+Alzheimer%27s+disease+and+autism+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Invert+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as an experimental tool for the study of complex neurological diseases: Parkinson's disease, Alzheimer's disease and autism spectrum disorder.</a> Invert Neurosci. 11, 73-83 (2011).</li>
<li>Chen, X., Barclay, J. W., Burgoyne, R. D., Morgan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+C.+elegans+to+discover+therapeutic+compounds+for+ageing-associated+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+Central+Journal%22%5BJournal%5D)">Using C. elegans to discover therapeutic compounds for ageing-associated neurodegenerative diseases.</a> Chemistry Central Journal. 9, 65(2015).</li>
<li>Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+neurodegenerative+diseases+in+transgenic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Modeling human neurodegenerative diseases in transgenic systems.</a> Hum Genet. 131, 535-563 (2012).</li>
<li>Jaiswal, M., Sandoval, H., Zhang, K., Bayat, V., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+mechanisms+that+underlie+human+neurodegenerative+diseases+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Probing mechanisms that underlie human neurodegenerative diseases in Drosophila.</a> Annu Rev Genet. 46, 371-396 (2012).</li>
<li>Konsolaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruitful+research%3A+drug+target+discovery+for+neurodegenerative+diseases+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Fruitful research: drug target discovery for neurodegenerative diseases in Drosophila.</a> Expert Opin Drug Discov. 8, 1503-1513 (2013).</li>
<li>Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+mutants+in+Drosophila%3A+a+means+to+identify+genes+and+mechanisms+involved+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Invert+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative mutants in Drosophila: a means to identify genes and mechanisms involved in human diseases.</a> Invert Neurosci. 5, 97-109 (2005).</li>
<li>Kretzschmar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swiss+cheese+et+allii%2C+some+of+the+first+neurodegenerative+mutants+isolated+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Swiss cheese et allii, some of the first neurodegenerative mutants isolated in Drosophila.</a> J Neurogenet. 23, 34-41 (2009).</li>
<li>Li, J., Le, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+neurodegenerative+diseases+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Neurol. 250, 94-103 (2013).</li>
<li>Prussing, K., Voigt, A., Schulz, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+as+a+model+organism+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster as a model organism for Alzheimer's disease.</a> Mol Neurodegener. 8, (2013).</li>
<li>Wentzell, J., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease+and+tauopathy+studies+in+flies+and+worms%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease and tauopathy studies in flies and worms.</a> Neurobiol Dis. 40, 21-28 (2010).</li>
<li>Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+locomotor%2C+learning%2C+and+memory+deficits+in+Drosophila+models+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Barone, M. C., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+neurodegenerative+phenotypes+in+Drosophila+dopaminergic+neurons+by+climbing+assays+and+whole+brain+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessing neurodegenerative phenotypes in Drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining.</a> J Vis Exp. , e50339(2013).</li>
<li>Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+expression+of+Swiss-cheese+%28SWS%29%2C+the+Drosophila+orthologue+of+Neuropathy+Target+Esterase%2C+is+required+for+neuronal+ensheathment+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Glial expression of Swiss-cheese (SWS), the Drosophila orthologue of Neuropathy Target Esterase, is required for neuronal ensheathment and function.</a> Dis Model Mech. , (2015).</li>
<li>Iijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abeta42+mutants+with+different+aggregation+profiles+induce+distinct+pathologies+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Abeta42 mutants with different aggregation profiles induce distinct pathologies in Drosophila.</a> PLoS One. 3, e1703(2008).</li>
<li>Krishnan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+circadian+clock+accelerates+aging+in+neurodegeneration-prone+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Loss of circadian clock accelerates aging in neurodegeneration-prone mutants.</a> Neurobiol Dis. 45, 1129-1135 (2012).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+rapid+iterative+negative+geotaxis+assay+and+its+use+in+a+genetic+screen+for+modifiers+of+Abeta%2842%29-induced+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila.</a> Neurosci Bull. 31, 541-549 (2015).</li>
<li>Papanikolopoulou, K., Skoulakis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+distinct+phosphorylations+differentiate+Tau-dependent+learning+deficits+and+premature+mortality+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Temporally distinct phosphorylations differentiate Tau-dependent learning deficits and premature mortality in Drosophila.</a> Hum Mol Genet. 24, 2065-2077 (2015).</li>
<li>Ping, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+abeta42-induced+hyperexcitability+to+neurodegeneration%2C+learning+and+motor+deficits%2C+and+a+shorter+lifespan+in+an+Alzheimer%27s+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Linking abeta42-induced hyperexcitability to neurodegeneration, learning and motor deficits, and a shorter lifespan in an Alzheimer's model.</a> PLoS Genet. 11, e1005025(2015).</li>
<li>Sujkowski, A., Rainier, S., Fink, J. K., Wessells, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+Induction+of+Human+NTE+%28PNPLA6%29+Rescues+Neurodegeneration+and+Mobility+Defects+of+Drosophila+swiss+cheese+%28sws%29+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Delayed Induction of Human NTE (PNPLA6) Rescues Neurodegeneration and Mobility Defects of Drosophila swiss cheese (sws) Mutants.</a> PLoS One. 10, e0145356(2015).</li>
<li>Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+activation+of+Nrf2+signaling+is+sufficient+to+ameliorate+neurodegenerative+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Dis Model Mech. 4, 701-707 (2011).</li>
<li>Coulom, H., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+exposure+to+rotenone+models+sporadic+Parkinson%27s+disease+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster.</a> J Neurosci. 24, 10993-10998 (2004).</li>
<li>Navarro, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+dopaminergic+neuronal+dysfunction+in+genetic+and+toxin-induced+models+of+Parkinson%27s+disease+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of dopaminergic neuronal dysfunction in genetic and toxin-induced models of Parkinson's disease in Drosophila.</a> J Neurochem. 131, 369-382 (2014).</li>
<li>Heisenberg, M., Böhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+anatomical+brain+mutants+of+Drosophila+by+histological+means%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Naturforschung+C%22%5BJournal%5D)">Isolation of anatomical brain mutants of Drosophila by histological means.</a> Zeitschrift für Naturforschung C. 34, 143(1979).</li>
<li>Han, P. L., Meller, V., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+brain+revisited+by+enhancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila brain revisited by enhancer detection.</a> J Neurobiol. 31, 88-102 (1996).</li>
<li>Lin, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+in+situ+brain+imaging+for+mapping+the+Drosophila+connectome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Automated in situ brain imaging for mapping the Drosophila connectome.</a> J Neurogenet. 29, 157-168 (2015).</li>
<li>Strausfeld, N. J., Sinakevitch, I., Vilinsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mushroom+bodies+of+Drosophila+melanogaster%3A+an+immunocytological+and+golgi+study+of+Kenyon+cell+organization+in+the+calyces+and+lobes%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">The mushroom bodies of Drosophila melanogaster: an immunocytological and golgi study of Kenyon cell organization in the calyces and lobes.</a> Microsc Res Tech. 62, 151-169 (2003).</li>
<li>Bettencourt da Cruz, A., Wentzell, J., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swiss+Cheese%2C+a+protein+involved+in+progressive+neurodegeneration%2C+acts+as+a+noncanonical+regulatory+subunit+for+PKA-C3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Swiss Cheese, a protein involved in progressive neurodegeneration, acts as a noncanonical regulatory subunit for PKA-C3.</a> J Neurosci. 28, 10885-10892 (2008).</li>
<li>Bolkan, B. J., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Tau+results+in+defects+in+photoreceptor+development+and+progressive+neuronal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Loss of Tau results in defects in photoreceptor development and progressive neuronal degeneration in Drosophila.</a> Dev Neurobiol. 74, 1210-1225 (2014).</li>
<li>Cook, M., Mani, P., Wentzell, J. S., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+RhoA+prenylation+in+the+loechrig+%28loe%29+mutant+leads+to+progressive+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Increased RhoA prenylation in the loechrig (loe) mutant leads to progressive neurodegeneration.</a> PLoS One. 7, e44440(2012).</li>
<li>Wittmann, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tauopathy+in+Drosophila%3A+neurodegeneration+without+neurofibrillary+tangles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tauopathy in Drosophila: neurodegeneration without neurofibrillary tangles.</a> Science. 293, 711-714 (2001).</li>
<li>Rasmuson, B., Green, M. M., Ewertson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QUALITATIVE+AND+QUANTITATIVE+ANALYSES+OF+EYE+PIGMENTS+AND+PTERIDINES+IN+BACK-MUTATIONS+OF+THE+MUTANT+wa+IN+DROSOPHILA+MELANOGASTER%5BTitle%5D)+AND+%22Hereditas%22%5BJournal%5D)">QUALITATIVE AND QUANTITATIVE ANALYSES OF EYE PIGMENTS AND PTERIDINES IN BACK-MUTATIONS OF THE MUTANT wa IN DROSOPHILA MELANOGASTER.</a> Hereditas. 46, 635-650 (1960).</li>
<li>Bettencourt da Cruz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+MAP1B-related+protein+FUTSCH+leads+to+changes+in+the+neuronal+cytoskeleton%2C+axonal+transport+defects%2C+and+progressive+neurodegeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Disruption of the MAP1B-related protein FUTSCH leads to changes in the neuronal cytoskeleton, axonal transport defects, and progressive neurodegeneration in Drosophila.</a> Mol Biol Cell. 16, 2433-2442 (2005).</li>
<li>Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+swiss+cheese+mutant+causes+glial+hyperwrapping+and+brain+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila.</a> J Neurosci. 17, 7425-7432 (1997).</li>
<li>Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+expression+of+Swiss+cheese+%28SWS%29%2C+the+Drosophila+orthologue+of+neuropathy+target+esterase+%28NTE%29%2C+is+required+for+neuronal+ensheathment+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Glial expression of Swiss cheese (SWS), the Drosophila orthologue of neuropathy target esterase (NTE), is required for neuronal ensheathment and function.</a> Dis Model Mech. 9, 283-294 (2016).</li>
<li>Davis, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocerebrosidase+Deficiency+in+Drosophila+Results+in+alpha-Synuclein-Independent+Protein+Aggregation+and+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Glucocerebrosidase Deficiency in Drosophila Results in alpha-Synuclein-Independent Protein Aggregation and Neurodegeneration.</a> PLoS Genet. 12, e1005944(2016).</li>
<li>Dias-Santagata, D., Fulga, T. A., Duttaroy, A., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+mediates+tau-induced+neurodegeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress mediates tau-induced neurodegeneration in Drosophila.</a> J Clin Invest. 117, 236-245 (2007).</li>
<li>Kretzschmar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+and+neuronal+expression+of+polyglutamine+proteins+induce+behavioral+changes+and+aggregate+formation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Glial and neuronal expression of polyglutamine proteins induce behavioral changes and aggregate formation in Drosophila.</a> Glia. 49, 59-72 (2005).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+for+TDP-43+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model for TDP-43 proteinopathy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3169-3174 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana metoda pozwala na ilościowe określenie neurodegeneracji w mózgu Drosophila. Podczas gdy inne metody, takie jak liczenie określonego typu komórek, mogą być używane do identyfikacji neurodegeneracji, zaletą tej metody jest to, że można ją zastosować bardziej ogólnie. Liczenie komórek wymaga, aby komórki te można było wiarygodnie zidentyfikować za pomocą swoistego przeciwciała lub ekspresji markera specyficznego dla komórki, który nie zawsze jest dostępny. Ponadto wykazano, że przy zastosowaniu tej metody<s...

Wraz ze wzrostem średniej długości życia, choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera czy Parkinsona, stały się coraz większym zagrożeniem dla zdrowia ogółu populacji. Według National Institutes of Health przewiduje się, że w 2050 roku 115 milionów ludzi na całym świecie będzie dotkniętych demencją. Chociaż poczyniono znaczne postępy w identyfikacji genów i czynników ryzyka związanych z przynajmniej niektórymi z tych chorób, w przypadku wielu z nich mechanizmy molekularne leżące u ich podstaw są nadal nieznane lub nie są dobrze poznane.
Proste modelowe organizmy bezkręgowców, takie jak Caenorhabditis elegans i Drosophila melanogaster, oferują różnorodne korzyści eksperymentalne do badania mechanizmów chorób neurodegeneracyjnych, w tym krótki cykl życia, dużą liczbę potomstwa oraz dostępność dobrze znanych i czasami unikalnych metod genetycznych i molekularnych1-12. Co więcej, organizmy te są podatne na bezstronne badania przesiewowe interakcji, które mogą zidentyfikować czynniki przyczyniające się do tych chorób poprzez ich pogarszający lub łagodzący wpływ na fenotypy neurodegeneracyjne.
Analizowanie takich interakcji genetycznych i ocena efektów starzenia wymaga ilościowych protokołów do wykrywania neurodegeneracji i mierzenia jej nasilenia. Ocenę tę można przeprowadzić stosunkowo łatwo, mierząc aspekty behawioralne u Drosophila, takie jak uczenie się węchu, negatywna geotaksja lub szybkie fototaksje, które zapewniają liczbową wartość wydajności13-21. Możliwe jest również określenie wpływu na przeżycie neuronów poprzez zliczanie neuronów. Jest to jednak możliwe tylko wtedy, gdy skupimy się na konkretnej populacji, która jest wyraźnie identyfikowalna, jak neurony dopaminergiczne, które są dotknięte chorobą Parkinsona, a nawet wtedy wyniki były kontrowersyjne22-24.
Opisany tutaj protokół wykorzystuje metodę kołnierza do wykonywania seryjnych odcinków parafiny, metodę, która została pierwotnie opracowana przez Heisenberga i Böhla, którzy użyli jej do izolacji anatomicznych mutantów mózgu u Drosophila25. Zastosowanie metody kołnierzowej zostało następnie dostosowane, m.in. w kriosekcjach, sekcjach wibratomicznych i sekcjach plastycznych26-28. W tym przypadku metoda ta jest stosowana do uzyskania seryjnych odcinków całej głowy muchy, które można następnie wykorzystać do pomiaru wakuoli, które rozwijają się u much z fenotypami neurodegeneracyjnymi16,21,29-32. Pomiary te mogą być wykonywane w określonych obszarach mózgu lub mogą obejmować cały mózg; To ostatnie podejście pozwala zidentyfikować nawet słabe fenotypy zwyrodnieniowe, które obserwuje się podczas starzenia się. Wreszcie, przy użyciu obroży, w ramach jednego preparatu można przetworzyć do 20 much, co jest nie tylko mniej czasochłonne, ale także pozwala na analizę much kontrolnych i doświadczalnych w tym samym preparacie, minimalizując artefakty spowodowane niewielkimi zmianami w preparacie.

<table><tbody><tr><td>Nazwa firmy produkującej odczynniki/sprzęt</td><td></td><td>Numer katalogowy</td><td></td></tr><tr><td>Obroża</td><td>Genesee Scientific</td><td>TS 48-100</td><td>Używamy obroży wykonanych na zamówienie, które są wykonane z jednego kawałka metalu, a nie warstw, jak te firmy Genesee. Opis sposobu wykonania obroży można znaleźć na stronie http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html&nbsp;</td></tr><tr><td>Gumowa tacka na kostki lodu do zatapiania</td> Sklep <td></td><td>gospodarstwa domowego</td><td>Rozmiar można dopasować do potrzeb poprzez wklejenie dodatkowych ścianek&nbsp;</td></tr><tr><td>Naczynie krystalizujące</td><td>Fisher Scientific company</td><td>08-762-3</td><td></td></tr><tr><td>Ether</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>E138-1</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Laboratories Inc.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Choloroform</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Methylbenzoate</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>M205-500</td><td>Wyraźny zapach - Stosować w dygestorium!</td></tr><tr><td>Wosk parafinowy o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>T565</td><td>Upewnij się, że jest on dodatkowo stopiony w 65&deg; C Mikrotom do kąpieli wodnej</td></tr><tr><td></td><td>Leica Biosystems</td><td>Reichert Jung 2040 Autocut</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>12-550D</td><td></td></tr><tr><td>Szklana osłona mikroskopu</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>SafeClear</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>314-629</td><td>Trzy różne pojemniki do mycia</td></tr><tr><td>Pionowy słoik do barwienia z Okładka</td><td>Ted Pella Inc.&nbsp;</td><td>432-1</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór poli-L-lizyny (PLL)</td><td>Sigma Life Science</td><td>P8290-500</td><td></td></tr></tbody></table>

masowa histologia w celu ilościowego określenia neurodegeneracji u drosophila

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Postępujące choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera (AD) czy choroba Parkinsona (PD), stanowią coraz większe zagrożenie dla zdrowia ludzkiego na całym świecie. Chociaż modele ssaków dostarczyły ważnych informacji na temat mechanizmów leżących u podstaw patogenności, złożoność systemów ssaków wraz z ich wysokimi kosztami ograniczają ich stosowanie. W związku z tym prosty, ale dobrze ugruntowany system modelowy Drosophila stanowi alternatywę dla badania szlaków molekularnych, które są dotknięte tymi chorobami. Oprócz deficytów behawioralnych, choroby neurodegeneracyjne charakteryzują się fenotypami histologicznymi, takimi jak śmierć neuronów i aksonopatia. Aby określić ilościowo zwyrodnienie neuronów i określić, w jaki sposób wpływają na nie czynniki genetyczne i środowiskowe, stosujemy podejście histologiczne, które opiera się na pomiarze wakuoli w mózgach dorosłych much. W celu zminimalizowania skutków błędu systematycznego oraz bezpośredniego porównania wycinków z muszek kontrolnych i doświadczalnych w jednym preparacie, do skrawków parafinowych stosujemy metodę "kołnierza". Neurodegeneracja jest następnie oceniana poprzez pomiar wielkości i/lub liczby wakuoli, które rozwinęły się w mózgu muchy. Można to zrobić, skupiając się na określonym obszarze zainteresowania lub analizując cały mózg, uzyskując seryjne sekcje obejmujące całą głowę. Dlatego metoda ta pozwala zmierzyć nie tylko poważne zwyrodnienie, ale także stosunkowo łagodne fenotypy, które są wykrywalne tylko w kilku sekcjach, jak to ma miejsce podczas normalnego starzenia.

Zastosowanie opisanego метода pozwala na uzyskanie seryjnych przekrojów barwionych pigmentem oka3, obejmujących całą głowę muchy. Część z nich przedstawiono na Rysunku 1B, gdzie przekroje z jednej głowy ukazano od góry do dołu. W tym przykładzie przekroje z różnych much widoczne są od lewej do prawej strony. Aby ułatwić orientację i identyfikację much, w pozycji 3 wstawiono muchę bezoczną (sine oculis) jako marker (strzałka, Rysunek 1B...

Drosophila jest powszechnie używana jako system modelowy do badania neurodegeneracji. Protokół ten opisuje metodę, za pomocą której można określić ilościowo zwyrodnienie, określone przez tworzenie się wakuoli w mózgu. Minimalizuje również efekty wynikające z procedury eksperymentalnej poprzez przetwarzanie i dzielenie much kontrolnych i eksperymentalnych jako jednej próbki.

Masowa histologia w celu ilościowego określenia neurodegeneracji u Drosophila

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe określenie stopnia neurodegeneracji w mózgu Drosophila, wywołanej przez różne czynniki, w tym wiek, modyfikacje genetyczne lub wpływy środowiskowe, bez konieczności stosowania specyficznego barwienia. Metoda ta jest bardzo użyteczna w analizie kluczowych pytań z zakresu chorób neurodegeneracyjnych, takich jak: które geny lub czynniki środowiskowe powodują te choroby lub przyczyniają się do ich rozwoju?Główną zaletą tej metody jest unikanie lub minimalizowanie błędów systematycznych, ponieważ muchy kontrolne i doświadczalne są traktowane jako jedna próba. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotykać trudności, gdyż wymagana jest praktyka, aby upewnić się, że na szkiełku znajduje się prawidłowy obszar mózgu oraz aby zapobiec uszkodzeniom, które mogą wystąpić podczas cięcia. Na początek należy za pomocą pęsety wprowadzić muchy badawcze szyją do uchwytów.Ustaw wszystkie głowy w tej samej orientacji i upewnij się, że głowy oraz oczy nie uległy uszkodzeniu. W losowych, znanych pozycjach umieść muchy Senoculus bez oczu, aby w przekrojach można było łatwo zidentyfikować kolejność much. Dodatkowo, jeśli badana linia much m

mass-histology-to-quantify-neurodegeneration-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Testy behawioralne służące do pomiaru funkcji lokomocyjnych, zdolności uczenia się i pamięci u Drosophila.

Ocena deficytów motorycznych, uczenia się i pamięci w modelach neurodegeneracji u Drosophila

Czynnikiem ograniczającym wykorzystanie oka dorosłych Drosophila w badaniach nad neurodegeneracją i biologią komórki jest trudność w obrazowaniu procesów wewnątrzkomórkowych. Opisujemy metodę preparowania pojedynczych ommatidiów w celu utworzenia właściwej pierwotnej hodowli komórek neuronalnych, która może być poddawana działaniu leków oraz zaawansowanemu obrazowaniu.

Disekcja i obrazowanie pojedynczego ommatidium Drosophila

Tu opisujemy dwa testy, które zostały opracowane w celu badania związanej z wiekiem neurodegeneracji neuronów dopaminergicznych (DA) w Drosophila: test ujemnej geotaksji indukowanej wspinaczkami/skurczem, który pozwala badać efekty funkcjonalne zwyrodnienia neuronów DA oraz immunobarwienie na hydroksylazę tyrozyny, które jest używane do identyfikacji i liczenia neuronów DA w całych preparatach mózgu.

Ocena fenotypow neurodegeneracyjnych w Drosophila neuronach dopaminergicznych poprzez testy wspinaczkowe i immunobarwienie całego mózgu

Tutaj opisujemy prostą i powszechnie dostępną metodę uszkadzania nerwów segmentowych u larw Drosophila, aby uwidocznić i określić ilościowo neurodegenerację neuronów ruchowych w złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) larw trzeciego stadium rozwojowego.

Prosta metodologia mechanicznego urazu, metoda neuronów do badania zwyrodnienia neuronów ruchowych Drosophila

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Opracowaliśmy prosty i elastyczny przepływ pracy do ekstrakcji danych ilościowych z badań biologicznych komórek opartych na obrazowaniu fluorescencyjnym agregacji białek i przepływu autofagicznego w ośrodkowym układzie nerwowym modeli neurodegeneracji Drosophila.

Ilościowa biologia komórki neurodegeneracji u Drosophila poprzez bezstronną analizę białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą ImageJ

Prezentujemy protokół wykorzystujący zaawansowane podejście genetyczne do badań przesiewowych w kierunku mutantów wykazujących neurodegenerację u Drosophila melanogaster. Obejmuje on test wspinaczkowy, analizę histologiczną, mapowanie genów i sekwencjonowanie DNA, aby ostatecznie zidentyfikować nowe geny związane z procesem neuroprotekcji.

Genetyczne badania przesiewowe in vivo w celu identyfikacji nowych genów neuroprotekcyjnych u Drosophila melanogaster

Tutaj udostępniamy protokoły do przeprowadzenia trzech prostych testów degeneracji aksonów (śmierci aksonów) wywołanych urazem u Drosophila melanogaster, aby ocenić morfologiczne i funkcjonalne zachowanie odciętych aksonów i ich synaps.

Ocena morfologiczna i funkcjonalna aksonów i ich synaps podczas śmierci aksonów u Drosophila melanogaster

Celem tej procedury jest wypreparowanie tkanki mięśnia podłużnego grzbietu (DLM) w celu oceny integralności strukturalnej połączeń nerwowo-mięśniowych DLM (NMJs) w modelach chorób neurodegeneracyjnych przy użyciu Drosophila melanogaster.

Wizualizacja zwyrodnienia synaptycznego u dorosłych Drosophila w związku z neurodegeneracją

To badanie przedstawia uproszczony protokół przetwarzania tkanek obejmujący dekapitację, fiksację, kriosekcję, barwienie fluorescencyjne, barwienie immunologiczne i obrazowanie, który może być rozszerzony na obrazowanie konfokalne i wielofotonowe. Metoda zachowuje skuteczność porównywalną ze skomplikowanymi sekcjami, omijając potrzebę zaawansowanych umiejętności motorycznych. Ilościowa analiza obrazu daje szeroki potencjał badawczy.

Bezpośrednia kriosekcja głów Drosophila w celu wzmocnienia barwienia fluorescencyjnego mózgu i barwienia immunologicznego

Poznaj metodę masowej histologii do ilościowego określania neurodegeneracji u Drosophila bez barwienia specyficznego. Technika minimalizuje błędy systematyczne, traktując muchy kontrolne i eksperymentalne jako jedną próbkę.

Masowa histologia w celu ilościowego określenia neurodegeneracji u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów