Obrazowanie i kwantyfikacja agregatów białkowych w genetycznie zmodyfikowanych mózgach Drosophila

Zacznij od genetycznie zmodyfikowanych mózgów Drosophila. Mózgi te wyrażają zmutowane białko znakowane na czerwono fluorescencyjnie w neuronie, które może rozprzestrzeniać się na otaczającą komórkę glejową, wyrażając żółte normalne białko znakowane fluorescencyjnie, powodując ich agregację.

Dodaj roztwór utrwalający, który zachowuje integralność komórkową.

Usuń utrwalacz i przemyj buforem.

Dodaj odczynnik zapobiegający blaknięciu i inkubuj, aby zapobiec blaknięciu sygnałów fluorescencyjnych.

Przenieś mózgi na szkiełko i usuń nadmiar płynu.

Pozwól mózgom przylgnąć do szkiełka.

Używając małych kawałków szkiełka nakrywkowego jako przekładek, umieść na nich szkiełko nakrywkowe. Dodaj odczynnik zapobiegający blaknięciu i zapieczętuj go.

Pod mikroskopem konfokalnym uchwyć obrazy przy użyciu różnych długości fal wzbudzenia dla czerwonej i żółtej fluorescencji.

Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu, określ ilościowo agregaty białkowe.

Kolokalizacja czerwonej i żółtej fluorescencji wskazuje na rozprzestrzenianie się zmutowanych białek.

Po wypreparowaniu wszystkich mózgów przenieś probówkę zbiorczą do nutatora o temperaturze pokojowej i kołysz je przez około 5 minut. Po okresie utrwalania należy usunąć większość roztworu utrwalającego za pomocą pipety P1000 i wyrzucić go, bardzo uważając, aby pozostawić mózgi w probówkach. Wymaga to delikatnego ssania i uważnej obserwacji.

Następnie dodaj 1 mililitr świeżego PBST do mózgu. Przykryj tubkę i pozwól jej kołysać się na nutatorze przez około minutę, aby zmyć pozostały utrwalacz. Następnie usuń roztwór i powtórz ten krótki krok mycia.

Po dwóch krótkich praniach wykonaj jedno 5-minutowe mycie, następnie trzy 20-minutowe mycie, a na koniec jedno 1-godzinne mycie. Po ostatnim praniu ostrożnie usuń większość PBST i zanurz mózgi w 30 mikrolitrach odczynnika zapobiegającego blaknięciu na bazie glicerolu. Następnie inkubuj mózgi w temperaturze 4 stopni Celsjusza w ciemności bez ruchu przez 1 do 24 godzin.

Później wyjmij mózgi z probówki zbiorczej za pomocą końcówki pipety i przenieś je do szkiełka mikroskopowego. Następnie delikatnie ustaw mózg w odpowiedniej pozycji do obrazowania za pomocą kleszczy. Wiele próbek można zamontować na tym samym szkiełku w oddzielnych rzędach.

Następnie usuń nadmiar odczynnika zapobiegającego blaknięciu ze szkiełka za pomocą rogu złożonej chusteczki laboratoryjnej. Nie pozwól, aby tkanka miała kontakt z mózgiem. Następnie pozostaw próbki w ciemności na 5 do 10 minut, aby mózgi przylgnęły do szkiełka.

Następnie weź małe kawałki potłuczonego szkła nakrywkowego i umieść je wokół mózgu, pokrywając obszar o powierzchni około 19 milimetrów kwadratowych. Następnie delikatnie opuść szklankę o średnicy 22 milimetrów kwadratowych na mozaikę mózgów i szkła, aby wykonać mocowanie mostu. Następnie powoli dozuj świeży odczynnik zapobiegający blaknięciu pod szkiełko nakrywkowe, aby wypełnił puste przestrzenie. Rób to bardzo ostrożnie, aby mózg i szkło pozostały na swoim miejscu. Następnie uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci. Najpierw po prostu nałóż go w rogach. Pozostaw narożne ślady do wyschnięcia na 5 do 10 minut przed zakończeniem uszczelniania wzdłuż krawędzi. Mózgi powinny zostać zobrazowane tak szybko, jak to możliwe.

Wyobraź sobie zamontowane mózgi za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw olejowy 40x lub 63x, aby zebrać plasterki Z w obszarze mózgu, w którym dochodzi do ekspresji transgenów. Następnie przeanalizuj dane, określając ilościowo puncta w poszczególnych wycinkach z lub, alternatywnie, po renderowaniu wycinków w trzech wymiarach.

Aby określić ilościowo zmutowane agregaty Huntingtona, które są dobrze oddzielone i mają niewielki sygnał tła, otwórz konfokalną serię Z w trybie oglądania 3D. Następnie za pomocą Kreatora analizy zidentyfikuj poszczególne punkty w wybranym kanale.

W ustawieniach dostosuj progi i filtry, aby dokładnie odwzorować wszystkie agregacje o niejednorodnych rozmiarach jako pojedyncze obiekty na obrazie. Następnie włącz opcję Podziel obiekty w obszarze Filtr wstępny przetwarzania binarnego, aby oddzielić ściśle powiązane agregacje. Informacje ilościowe o obiektach zidentyfikowanych przez oprogramowanie są raportowane w sekcji Pomiary.

Po policzeniu puncta, scharakteryzuj je dalej w oprogramowaniu do analizy obrazu. Na przykład wykonaj odpowiednie pomiary punktów lub powierzchni, aby uzyskać informacje o średnicy, objętości lub intensywności kruszywa. Niektóre agregaty Huntingtona typu dzikiego można określić ilościowo, ręcznie przesuwając się przez stos z i licząc zielone punkty, które można odróżnić od otaczającego sygnału rozproszonego.

Należy uważać, aby nie liczyć pojedynczych agregacji dwukrotnie, jeśli występują one w więcej niż jednym wycinku. Inną interesującą analizą jest określenie częstości kolokalizacji między agregatami Huntington Q25-YFP i Huntington Q91-mCherry. Zrób to za pomocą ręcznego liczenia, przesuwając plasterek po wycinku przez konfokalny stos z.