Obrazowanie i kwantyfikacja agregatów białkowych w genetycznie zmodyfikowanych mózgach Drosophila

Zacznij od genetycznie zmodyfikowanych mózgów Drosophila. Mózgi te wyrażają zmutowane białko znakowane na czerwono fluorescencyjnie w neuronie, które może rozprzestrzeniać się na otaczającą komórkę glejową, wyrażając żółte normalne białko znakowane fluorescencyjnie, powodując ich agregację.

Dodaj roztwór utrwalający, który zachowuje integralność komórkową.

Usuń utrwalacz i przemyj buforem.

Dodaj odczynnik zapobiegający blaknięciu i inkubuj, aby zapobiec blaknięciu sygnałów fluorescencyjnych.

Przenieś mózgi na szkiełko i usuń nadmiar płynu.

Pozwól mózgom przylgnąć do szkiełka.

Używając małych kawałków szkiełka nakrywkowego jako przekładek, umieść na nich szkiełko nakrywkowe. Dodaj odczynnik zapobiegający blaknięciu i zapieczętuj go.

Pod mikroskopem konfokalnym uchwyć obrazy przy użyciu różnych długości fal wzbudzenia dla czerwonej i żółtej fluorescencji.

Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu, określ ilościowo agregaty białkowe.

Kolokalizacja czerwonej i żółtej fluorescencji wskazuje na rozprzestrzenianie się zmutowanych białek.

Po wypreparowaniu wszystkich mózgów przenieś probówkę zbiorczą do nutatora o temperaturze pokojowej i kołysz je przez około 5 minut. Po okresie utrw