Pomiar aktywności proteasomu w różnych subkomórkowych przedziałach mózgu szczura
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 4:10 min. • July 8th, 2025
Zacznij od subkomórkowych frakcji jądrowych i synaptycznych pobranych z bocznego ciała migdałowatego mózgów zarówno szczurów kontrolnych, jak i uwarunkowanych strachem.
Każda frakcja subkomórkowa zawiera różne stężenia proteasomów 20S, katalitycznego rdzenia kompleksu proteasomu odpowiedzialnego za degradację niepożądanych białek komórkowych.
Dodać do próbek bufor testowy zawierający ATP i substrat peptydu fluorogenicznego i inkubować.
W obecności ATP proteasom rozszczepia peptyd fluorogenny, uwalniając wolne cząsteczki fluorogenne.
Za pomocą czytnika płytek mierz intensywność fluorescencji w regularnych odstępach czasu.
Określ ilościowo fluorescencję, porównując ją ze znanymi standardowymi stężeniami cząsteczki fluorogenicznej.
Intensywność fluorescencji jest proporcjonalna do aktywności proteasomu w próbce.
Zwiększona aktywność proteasomu we frakcji jądrowej szczurów uwarunkowanych strachem sugeruje zmiany w ekspresji genów związanych z pamięcią, podczas gdy zmniejszona aktywność we frakcji synaptycznej wskazuje na zmiany w ekspresji białek synaptycznych niezbędnych do utrzymania pamięci długotrwałej.
Aby skonfigurować test, należy wstępnie podgrzać czytnik płytek do 37 stopni Ce
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych