Pomiar aktywności proteasomu w różnych subkomórkowych przedziałach mózgu szczura

Zacznij od subkomórkowych frakcji jądrowych i synaptycznych pobranych z bocznego ciała migdałowatego mózgów zarówno szczurów kontrolnych, jak i uwarunkowanych strachem.

Każda frakcja subkomórkowa zawiera różne stężenia proteasomów 20S, katalitycznego rdzenia kompleksu proteasomu odpowiedzialnego za degradację niepożądanych białek komórkowych.

Dodać do próbek bufor testowy zawierający ATP i substrat peptydu fluorogenicznego i inkubować.

W obecności ATP proteasom rozszczepia peptyd fluorogenny, uwalniając wolne cząsteczki fluorogenne.

Za pomocą czytnika płytek mierz intensywność fluorescencji w regularnych odstępach czasu.

Określ ilościowo fluorescencję, porównując ją ze znanymi standardowymi stężeniami cząsteczki fluorogenicznej.

Intensywność fluorescencji jest proporcjonalna do aktywności proteasomu w próbce.

Zwiększona aktywność proteasomu we frakcji jądrowej szczurów uwarunkowanych strachem sugeruje zmiany w ekspresji genów związanych z pamięcią, podczas gdy zmniejszona aktywność we frakcji synaptycznej wskazuje na zmiany w ekspresji białek synaptycznych niezbędnych do utrzymania pamięci długotrwałej.

Aby skonfigurować test, należy wstępnie podgrzać czytnik płytek do 37 stopni Celsjusza i utrzymać go przez cały przebieg. Ustaw wzbudzenie na 360 nanometrów i emisję na 460 nanometrów. Jeśli używana płytka 96-dołkowa jest przezroczysta, ustaw pozycję optyki na dół. Jeśli używana jest ciemna 96-dołkowa płytka, ustaw pozycję optyki na Góra. Zaprogramuj bieg kinetyczny o czasie 2 godzin, skanując co 30 minut.

Rozpuść 20s 10x bufor testowy dostarczony w zestawie z 13,5 mililitrami ultraczystej wody. Dodaj 14 mikrolitrów 100 milimolowego ATP do teraz 1x bufora. To znacznie zwiększa aktywność proteasomu w próbkach i poprawia wiarygodność testu. Rozpuść wzorzec AMC dostarczony w zestawie za pomocą 100 mikrolitrów DMSO. Wykonuj czynności przy użyciu standardu AMC w ciemności lub przy słabym oświetleniu, ponieważ standard jest wrażliwy na światło.

Utwórz standardową krzywą AMC z serii wysokich i niskich stężeń AMC. Krzywa ta zostanie wykorzystana do kalibracji czytnika płytek i analizy aktywności proteasomu w homogenizowanych próbkach. Rozpuść substrat proteasomu dostarczony w zestawie w 65 mikrolitrach DMSO. Wykonaj ten krok również w ciemności lub przy słabym oświetleniu, ponieważ podłoże jest wrażliwe na światło.

Następnie utwórz rozcieńczenie substratu proteasomu od 1 do 20 w nowej probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra, używając buforu testowego 20 S. Dodaj znormalizowaną ilość żądanych próbek do płytki 96-dołkowej. Uruchom każdą próbkę w dwóch egzemplarzach. Ilość potrzebnej próbki różni się w zależności od przygotowania tkanki. Ogólnie rzecz biorąc, 10 do 20 mikrogramów jest wystarczające dla każdej frakcji subkomórkowej.

Doprowadzić objętość studzienki próbki do 80 mikrolitrów za pomocą ultraczystej wody. Dodana ilość zależy od objętości dodanej próbki. W dwóch oddzielnych studzienkach dodaj 80 mikrolitrów samej wody. Będą to ślepe próby testowe. Dodać 10 mikrolitrów buforu do oznaczania 20 S do każdego dołka, w tym ślepych prób testowych. Użyj repeatera lub automatycznej pipety, aby zapewnić stałą objętość testu we wszystkich studzienkach.

Wyłącz światła lub wejdź do ciemnego pokoju. Dodaj wszystkie 100 mikrolitrów rozcieńczonych wzorców AMC do nowej studzienki, używając jednego dołka dla każdego wzorca. W ciemności użyj repeatera lub automatycznej pipety, aby dodać 10 mikrolitrów rozcieńczonego substratu proteasomu do studzienek zawierających ślepe próby próbki i testy, ale nie wzorzec AMC. Umieść płytkę w czytniku płytek i rozpocznij bieg kinetyczny.