Analiza interakcji gospodarz-wirus w litycznej replikacji modelowego herpeswirusa

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zastosowanie różnych podejść wirusologicznych i biochemicznych do zbadania roli szlaku sygnałowego gospodarza w litycznej replikacji modelowego wirusa opryszczki. Jako przykład badamy rolę mitochondrialnego przeciwwirusowego białka sygnalizacyjnego Mavs podczas zakażenia wirusem opryszczki gamma HV 68. Jako pierwsze, aby zbadać rolę Mavs podczas ostrej infekcji, myszy typu dzikiego i z nokautem Mavs są zakażone gamma HV 68 po ostrej infekcji wirusowej.

Płuco myszy jest pobierane, a miano wirusa jest oznaczane za pomocą testu płytkiowego, w którym próbki są seryjnie rozcieńczane i platerowane. Na monowarstwach zliczana jest następnie liczba blaszek. Zwiększone miano wirusa u myszy z nokautem sugeruje, że interesujący nas gen odgrywa rolę przeciwwirusową.

Natomiast zmniejszone miano wirusa u myszy z nokautem wskazuje, że gen jest wymagany do infekcji wirusowej Aby potwierdzić te ustalenia. Wieloetapowa kinetyka wzrostu wirusa in vitro jest badana w mysich fibroblastach embrionalnych, fibroblasty zarodkowe myszy typu dzikiego i mavs z nokautem MAVS są zakażone gamma HV 68 i inkubowane przez różne czasy. Komórki są następnie pobierane i przeprowadzane są testy płytki nazębnej w celu porównania wieloetapowej kinetyki wzrostu między komórkami typu dzikiego a komórkami z niedoborem mavs.

Aby jeszcze bardziej potwierdzić te odkrycia, mysie komórki fibroblastów embrionalnych typu dzikiego i mavs z nokautem są zakażone gamma HV 68. Następnie DNA i RNA są oddzielnie ekstrahowane z zakażonych komórek, a transkrypty genomowe wirusa są analizowane za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tego protokołu, gdy badaliśmy rolę szlaku odporności gospodarza podczas infekcji litycznej wirusem.

Protokół ten może być potencjalnie zastosowany do badania zasad szlaków sygnałowych gospodarza podczas infekcji innymi patogenami. Rozpocznij tę procedurę, pozwalając myszom w miocie wyprodukowanym w wieku od sześciu do ośmiu tygodni na aklimatyzację przez okres czterech dni po wysyłce. Poniższy eksperyment zostanie przeprowadzony w obiekcie stwarzającym zagrożenie biologiczne.

W ramach przygotowań załóż środki ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny, rękawice, maskę i buty pracujące w gabinecie bezpieczeństwa biologicznego. Poziom drugi. Przygotować zawiesinę wirusa z 40 do 10 000 PFU gamma HV 68 i 30 mikrolitrami sterylnego PBS dla każdej myszy, która zostanie zakażona.

Zawiesinę wirusa należy przechowywać na lodzie po dootrzewnowym wstrzyknięciu ketaminy ksylazyny. Upewnij się, że myszy zostały uspokojone, wykonując szczypanie palca u nogi. Następnie za pomocą pipety wlej kroplami 30 mikrolitrów zawiesiny wirusa do lewego lub prawego nozdrza.

Połóż mysz na boku na pięć do 10 minut, aby ułatwić dostarczanie wirusa do płuc przez drogi oddechowe. Następnie umieść myszy z powrotem w klatce i monitoruj je, aż w pełni wyzdrowieją z uspokojenia. Następnie tkanka płucna jest pobierana od wstrzykniętych myszy w celu przygotowania lizatu komórkowego do oceny miana wirusa w różnych dniach po zakażeniu.

Płuca pobrane od myszy należy umieścić w sterylnych probówkach z nakrętką o pojemności 1,5 mililitra zawierających 500 mikrolitrów 1,0 milimetrowych kulek krzemionki cyrkonowej na lodzie. Jeśli nie, przejdź do następnego kroku tego samego dnia. Próbki należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

W przeciwnym razie dodaj jeden mililitr DMEM bez zimnej surowicy. Umieść rurkę w ubijaku do kulek i naciśnij start, aby homogenizować płuca przez 30 sekund. Aby uniknąć przegrzania próbki, co może spowodować dezaktywację wirusa.

Schłodzić probówkę na lodzie przez co najmniej jedną minutę po 30 sekundach homogenizacji. Następnie powtórz ten proces. Następnie odwiruj homogenizowaną tkankę w temperaturze 16 000 RCF w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną minutę.

Po wirowaniu szczątki komórek znajdą się na dnie probówki, a lipidy na powierzchni. Natychmiast weź nacisk, jak pokazano tutaj, aby wykonać test płytki nazębnej przy użyciu monowarstwy NIH trzy, T, trzy lub BHK 21. Następnie przeprowadza się test płytki nazębnej Aby określić miano wirusa obecnego w próbce, rozpocznij test płytki od wykonania seryjnego rozcieńczenia supernatantu wirusa.

Najpierw za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 270 mikrolitrów pożywki do płytki 96-dołkowej. Pozostaw pierwszy wiersz pusty. Następnie dodać 200 mikrolitrów supernatantu do pierwszego rzędu płytki 96-dołkowej, każdą próbkę w trzech egzemplarzach.

Następnie przenieś 30 mikrolitrów próbki z pierwszego rzędu do następnego rzędu i wymieszaj. Następnie przenieś 30 mikrolitrów mieszanki do następnego rzędu i wymieszaj. Powtórz ten krok wiele razy, aby wykonać dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia.

Następnie dodaj rozcieńczony supernatant wirusowy na monowarstwę komórki. W płytce 24-dołkowej. Umieścić płytkę w inkubatorze i wstrząsać płytką co 30 minut podczas dwugodzinnej inkubacji następującej po inkubacji, aby usunąć resztki komórek, odessać supernatant z płytki.

Następnie umyj komórki raz świeżym podłożem. Po umyciu dodaj do komórek podłoże zawierające metylocelulozę. Inkubuj komórki przez cztery do sześciu dni.

Po upływie czterech do sześciu dni. Użyj mikroskopu, aby odczytać numer tabliczki dla każdej próbki. Zapisać liczbę blaszek dla każdego rozcieńczenia.

Następnie oblicz średnią i odchylenie standardowe. Studzienki zawierające zbyt wiele lub zbyt mało blaszek nie mogą być używane do dokładnego obliczenia miana. Tak więc dla każdej próbki użyj rozcieńczenia, w którym znajduje się od siedmiu do 70 blaszek.

Ta próbka rozcieńczona 1000 razy ma średnio 23 blaszki na studzienkę. Aby obliczyć miano wirusa w nierozcieńczonym roztworze, pomnóż współczynnik rozcieńczenia przez liczbę blaszek przez liczbę mikrolitrów w mililirze. Następnie podziel to przez objętość rozcieńczonego supernatantu dodanego do dołka.

Tak więc w tym przykładzie 1000 razy 23 płytki razy 1000 mikrolitrów na mililitr podzielone przez 100 mikrolitrów równa się 2,3 razy 10 piątym jednostkom formowania na mililitr. Następnie stosuje się roztwór podstawowy wirusa o znanym mianie w celu określenia kinetyki wzrostu gamma HV 68 w mysich fibroblastach embrionalnych ORM rozpoczyna się od rozszczepienia mitów typu dzikiego i tych z niedoborem genu gospodarza na 24-dołkową płytkę przy 10 000 komórek na studzienkę. Następnego dnia zastąp pożywkę w każdej studzience 0,5 mililitra zawiesiny o niskiej zawartości MOI gamma HV 68.

Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pozostawić inkubację na dwie godziny przez cały okres inkubacji. Kołysz płytką co 30 minut po inkubacji. Za pomocą pipety usunąć zawiesinę wirusa i dodać 0,5 mililitra świeżego kompletnego DM EM zawierającego 8% płodowej surowicy bydlęcej do komórek zakażonych wirusem.

Umieść komórki z powrotem w inkubatorze w różnych dniach po zakażeniu. Zbierz komórki na średnim końcu, wielokrotnie pipetując w górę i w dół. Przenieś je do sterylnych 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych, natychmiast zamroź probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aby uwolnić gamma HV 68 z Mets.

Wykonaj trzy cykle zamrażania i rozmrażania. Rozmrozić komórki, umieszczając je w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie zwiruj i umieść je z powrotem w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Określ miano wirusa za pomocą testu płytki nazębnej przy użyciu monowarstwy NIH trzy, T, trzy lub BHK 21, jak pokazano wcześniej, aby zbadać, czy na replikację DNA lub RNA ma wpływ niedobór genów gospodarza lub genów wirusa. Zacznij od zakażonych komórek w różnych dniach po zakażeniu, wyrzuć supernatant, przepłucz komórki zimnym PBS i komórkami lodu trypsyny. Następnie osadzać komórki przez odcentrowanie w temperaturze 1000 RCF w temperaturze pokojowej przez jedną minutę po wirowaniu, wyrzucić supernatant i przechowywać komórki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Wyodrębnij całkowite DNA i RNA, które jest pochodzenia gospodarza i wirusa. Następnie odwirować kolumny wirujące. Wykonaj PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu całkowitego DNA i startera specyficznego dla wirusowych transkryptów litycznych.

Określ względną ilość wewnątrzkomórkowego genomu gamma HV 68 w odniesieniu do genu utrzymującego porządek gospodarza, takiego jak beta aktyna. Przygotuj CDNA z całkowitym RNA i oligo starterem DT. Wykonaj PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu CD NA i starterów, jak powyżej, aby określić względną ilość transkryptów wirusa.

W odniesieniu do genu sprzątania gospodarza, Mavs jest skrótem od mitochondrialnej sygnalizacji przeciwwirusowej, jak pokazano tutaj. Cząsteczka adaptera Mavs przekazuje sygnalizację z receptorów cytozolowych w celu aktywacji NF, kappa, B i czynników regulacyjnych interferonu, IRF, które z kolei zwiększają ekspresję genów cytokin prozapalnych i interferonów. Wiremia w płucach myszy typu dzikiego zakażonych promieniami gamma HV i myszy z miotu z niedoborem Mavs są pokazane tutaj.

Niedobór Mavs znacznie zmniejszył miano wirusa w płucach po 10 dniach od zakażenia, co wskazuje, że Mavs jest niezbędny do skutecznej infekcji wirusowej in vivo. Rysunek ten przedstawia wieloetapową krzywą wzrostu wirusa na fibroblastach embrionalnych myszy typu dzikiego oraz tych z niedoborem Mavs w Mavs. Znacznie opóźniony wzrost wirusa na mysich fibroblastach embrionalnych, wskazujący, że Mavs jest wymagany do skutecznej replikacji wirusa in vitro, poziomy mRNA wirusowych genów litycznych w mysich fibroblastach embrionalnych zakażonych gamma HV 68 analizowano przez niedobór PCR w czasie rzeczywistym w Mavs, znacznie obniżył poziomy mRNA trzech podstawowych genów litycznych.

Wszystkie te wyniki łącznie wspierają wniosek, że Mavs jest wymagany do aktywacji transkrypcji gamma HV 68 i replikacji litycznej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać interakcję patogenu gospodarza na wielu poziomach, zarówno w VO, jak i Vevo. Nie zapominaj, że praca z patogenami może być bardzo niepewna.

Podczas występów należy zachować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej.