Name: Analiza interakcji gospodarz-wirus w litycznej replikacji modelowego herpeswirusa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Poznaj metody badania interakcji gospodarz-wirus w litycznej replikacji herpeswirusa γHV68 przy użyciu myszy typu dzikiego i z nokautem genu Mavs. Dowiedz się, jak oznaczać miano wirusowe w płucach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr. Jamesowi (Zhijian) Chenowi (UT Southwestern, biologia molekularna) za dostarczenie niezbędnych odczynników, w tym myszy Mavs-/-, oraz dr. Ren Sun (University of California-Los Angeles, farmakologia i medycyna molekularna) za udostępnienie bakteryjnego sztucznego chromosomu γHV68 na potrzeby niniejszego badania.

1. Zakażanie myszy wirusem γHV68
<ol>
	<li>Do infekcji wirusowej wykorzystuje się myszy z jednego miotu, w wieku od sześciu do ośmiu tygodni, o tej samej płci (8 do 12 myszy na grupę). Po transporcie należy zapewnić myszom cztery pełne dni (96 godzin) na aklimatyzację.</li>
	<li>Kroki protokołu z wykorzystaniem wirusa należy przeprowadzać w komorze bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2 (BSL2), stosując standardowe środki ostrożności BSL2.</li>
	<li>Bezpośrednio przed eksperymentem należy przygotować zawiesinę wirusową γHV68 (40 do 1 x 105 jednostek tworzących plaki [PFU]) w 30 μl sterylnego PBS na mysz. Zawiesinę wirusową należy przechowywać w lodzie.</li>
	<li>Przygotować roztwór ketaminy/ksylazyny (1,5 mg ketaminy i 0,15 mg ksylazyny na 20 g masy ciała, 100 μl/mysz) do sedacji myszy. Sedację należy potwierdzić, wykonując ucisk palca u nogi.</li>
	<li>Myszy należy poddać sedacji poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe 1,5 mg ketaminy i 0,15 mg ksylazyny na 20 mg masy ciała (100 μl/mysz).</li>
	<li>Zawiesinę wirusową (30 μl/mysz) należy podać donosowo, kroplami, do jednej nozdrza zsedowanych myszy.</li>
	<li>Myszy należy położyć na boku na 5 - 10 min, aby ułatwić dostanie się wirusa drogami oddechowymi do płuc.</li>
	<li>Myszy należy umieścić z powrotem w klatce i monitorować do czasu pełnego wybudzenia z sedacji.</li>
	<li>W określonych dniach po infekcji myszy należy uśmiercić poprzez uduszenie CO2 i pobrać płuca po upewnieniu się o zgonie lub utracie głębokiej przytomności. Płuca należy umieścić w sterylnych probówkach z nakrętką o pojemności 1,5 ml zawierających 500 μl kulek cyrkonowo-krzemionkowych o średnicy 1,0 mm. Probówki należy przechowywać w lodzie. Jeśli następny krok nie zostanie wykonany tego samego dnia, próbki należy przechowywać w temperaturze -80°C. W zależności od ram czasowych eksperymentu, w tym momencie można pobrać tkankę śledziony lub wątroby do analizy latencji wirusa.</li>
	<li>Do probówki należy dodać 1 ml zimnego, bezzれたowego DMEM i zhomogenizować płuca za pomocą homogenizatora kulkowego przez 30 sekund. Probówki należy schładzać w lodzie przez co najmniej 1 min. Proces ten należy powtórzyć raz.</li>
	<li>Lizaty płuc należy odwirować przy 16 000 rcf w temperaturze 4°C przez 1 min, a supernatant wykorzystać do oznaczenia miana wirusa za pomocą testu plackowego na monowarstwie komórek NIH3T3 lub BHK21 (szczegóły w sekcji 5).</li>
</ol>
2. Wyznaczenie kinetyki wieloetapowego wzrostu γHV68 w embrionalnych fibroblastach myszych
<ol>
	<li>Hodować embrionalne fibroblasty mysie (MEF) typu dzikiego oraz te z niedoborem genu gospodarza do gęstości subkonfluencyjnej (około 80%) przed wysianiem komórek.</li>
	<li>Wysiać MEF na płytkę 24-dołkową w zagęszczeniu 10 000 komórek/dołek dla niskiej wielokrotności infekcji (MOI) w dniu poprzedzającym infekcję. Eksperymenty są zazwyczaj przeprowadzane w trzech powtórzeniach i zazwyczaj stosuje się MOI w zakresie 0,001 - 0,05.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę γHV68 zawierającą pożądaną ilość wirusa (0,5 ml na dołek).</li>
	<li>Usunąć pożywkę i pokryć MEF zawiesiną γHV68 w ilości 0,5 ml na dołek.</li>
	<li>Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych, kołysząc nią co 30 min; inkubację prowadzić przez 2 h.</li>
	<li>Usunąć zawiesinę wirusową i pokryć komórki 0,5 ml świeżej, pełnej pożywki DMEM zawierającej 8% płodowej surowicy bydlęcej.</li>
	<li>W różnych dniach po infekcji zebrać pożywkę i komórki do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Natychmiast zamrozić probówki w temperaturze -80°C.</li>
	<li>Uwolnić γHV68 z MEF poprzez zamrażanie w -80°C, rozmrażanie w łaźni wodnej o temperaturze 37°C i mieszanie w wortexie. Do próbek zazwyczaj stosuje się trzy cykle zamrażania i rozmrażania.</li>
	<li>Wyznaczyć miano wirusa za pomocą testu plackowego z użyciem monowarstwy NIH3T3 lub BHK21 (szczegóły w sekcji 5).</li>
	<li>Odczytać miano wirusa i wykreślić wielostopniową krzywą wzrostu γHV68 na MEF.</li>
</ol>
3. Molekularna analiza litycznej replikacji γHV68 w zarodkowych fibroblastach mysich
<ol>
	<li>Przeprowadź infekcję wirusową zgodnie z opisem w krokach 2.1 do 2.6 sekcji 2.</li>
	<li>W różnych dniach po infekcji odlej nadsącz. Przepłucz komórki zimnym PBS i poddaj je trypsynizacji. Wirowarką osadź komórki przy 1,000 rcf w temperaturze pokojowej przez 1 min. Odlej nadsącz i przechowuj komórki w temperaturze -80°C.</li>
	<li>Wyizoluj całkowite DNA (genom gospodarza i wirusa) oraz całkowite RNA zgodnie z wcześniej opisanymi metodami5,6.</li>
	<li>Przeprowadź reakcję real-time PCR, wykorzystując całkowite DNA oraz startery specyficzne dla litycznych transkryptów wirusa, takich jak RTA (ORF50), ORF57 i ORF60. Określ względną ilość wewnątrzkomórkowego genomu γHV68 w odniesieniu do genu gospodarza odpowiedzialnego za podstawowe funkcje komórkowe (np. β-actin).</li>
	<li>W celu usunięcia zanieczyszczeń w postaci DNA genomicznego, kluczowe dla przygotowania cDNA z całkowitego RNA i startera oligo(dT)11-19 jest zastosowanie DNazy wolnej od RNazy. Szczegółowe informacje na temat izolacji RNA, w tym traktowania DNazą wolną od RNazy oraz RT-PCR, znajdują się w pozycji bibliograficznej 5. Przeprowadź reakcję real-time PCR z użyciem cDNA i starterów opisanych powyżej, aby określić względną ilość transkryptów wirusowych w odniesieniu do ilości transkryptu genu gospodarza odpowiedzialnego za podstawowe funkcje komórkowe.</li>
</ol>
4. Generowanie rekombinowanego γHV68 z wykorzystaniem bakteryjnego sztucznego chromosomu
Metoda opisana w niniejszym materiale służy do wprowadzania mutacji do genu γHV68 zaangażowanego w interakcję gospodarz-wirus.
<ol>
	<li>Za pomocą PCR przygotować fragment DNA (około 1,5 kb) o sekwencji typu dzikiego lub sekwencji zawierającej pożądane mutacje w regionie centralnym.</li>
	<li>Za pomocą oczyszczania w skali midi (OriGene) przygotować bakteryjny sztuczny chromosom (BAC) zawierający insercję transpozonu7 w obrębie miejsca mutacji, co specyficznie inaktywuje badany gen. DNA BAC przechowywać w temperaturze 4°C (należy unikać zamrażania i rozmrażania DNA BAC).</li>
	<li>DNA BAC oraz produkt PCR zawierający pożądane mutacje badanego genu przetransfekować do komórek (np. NIH3T3 lub BHK21), które są wysoce podatne na replikację lityczną γHV68, przy użyciu Lipofectamine 2000 (Invitrogen).</li>
	<li>Kontynuować pasażowanie komórek aż do momentu pojawienia się efektu cytopatycznego (CPE) w monowarstwie. Zebrać supernatant zawierający wirusa i, jeśli jest to konieczne, namnożyć wirusa w komórkach NIH3T3 lub BHK21.</li>
	<li>Zainfekować komórki NIH3T3 wirusem rekombinowanym poprzez wirowanie przy 1800 rpm w temperaturze 30°C przez 30 min.</li>
	<li>Zebrać zainfekowane γHV68 komórki NIH3T3 i przygotować cyrkularyzowany genom wirusowy zgodnie z protokołem Hirta8,9.</li>
	<li>Przeprowadzić transformację kompetentnych komórek Electro-MAX DH10B (Invitrogen) metodą elektroporacji i wyselekcjonować kolonie oporne na chloramfenikol (Cm), ale wrażliwe na kanamycynę (Kan) (gen oporności na Cm znajduje się w szkielecie BAC, natomiast gen oporności na Kan w insercji transpozonu).</li>
	<li>Hodować kolonie CmRKanS w pożywce zawierającej chloramfenikol i przygotować DNA BAC za pomocą oczyszczania w skali mini lub midi (OriGene).</li>
	<li>Zweryfikować pożądaną mutację w docelowym genie za pomocą PCR, stosując startery specyficzne dla regionów flankujących miejsce mutacji, oraz za pomocą sekwencjonowania.</li>
	<li>Potwierdzić brak rearanżacji chromosomowych w BAC poprzez trawienie wybranymi enzymami restrykcyjnymi i elektroforezę w polu pulsującym.</li>
	<li>Rekombinowany BAC przetransfekować do komórek NIH 3T3 lub BHK21 przy użyciu Lipofectamine 2000 (Invitrogen) w celu przygotowania rekombinowanego γHV68.</li>
	<li>Kontynuować pasażowanie komórek aż do momentu pojawienia się CPE w monowarstwie. Zebrać supernatant zawierający wirusa i namnożyć rekombinowany γHV68 w komórkach NIH3T3 lub BHK21.</li>
	<li>Wyznaczyć miano wirusa rekombinowanego i scharakteryzować właściwości wzrostu wirusa ex vivo oraz in vivo zgodnie z opisem w sekcjach 1 i 2.</li>
</ol>
5. Wyznaczenie miana wirusa za pomocą testu plackowego
<ol>
	<li>Hodować komórki NIH3T3 do gęstości subkonfluencyjnej (około 80%) przed wysianiem komórek.</li>
	<li>Wysiać komórki NIH3T3 na płytkę 24-dołkową w zagęszczeniu 20 000 komórek/dołek w dniu poprzedzającym infekcję.</li>
	<li>Przygotować 10-krotne rozcieńczenia seryjne supernatantów wirusowych w medium DMEM zawierającym 8% surowicy z noworodka cielęcia (NCS).</li>
	<li>Usunąć medium i przykryć komórki NIH3T3 0,5 ml zawiesiny γHV68.</li>
	<li>Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych, kołysząc nią co 30 min, i kontynuować inkubację przez 2 h.</li>
	<li>Usunąć zawiesinę wirusową i przykryć komórki 0,5 ml medium DMEM zawierającego 2% NCS i 0,75% metylocelulozy (Sigma).</li>
	<li>Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych. Zliczyć plaki w 6. dniu po infekcji. Barwienie monowarstwy, np. fioletem krystalicznym, może ułatwić liczenie plaków.</li>
	<li>Obliczyć miano wirusa w nierozcieńczonych lizatach tkanek lub lizatach komórkowych, korzystając z następującego wzoru: Titer (PFU/ml) = D x N x 1000 μl/ml ÷ V μl. Gdzie N to średnia liczba plaków przy odpowiednim rozcieńczeniu; D to stopień rozcieńczenia (np. 5, 10, 100...); V (μl) to objętość dodanego do dołka rozcieńczonego seryjnie supernatantu.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
Przedstawiono tutaj trzy reprezentatywne rysunki, w tym replikację lityczną γHV68 w płucach myszy typu dzikiego oraz Mavs-/-10, fenotypy replikacji litycznej γHV68 w embrionalnych fibroblastach mysich (MEF) oraz rekombinowany γHV68 zawierający mutacje w miejscach fosforylacji modulowanych przez zależną od MAVS IKKβ. Te trzy potwierdzające eksperymenty stanowią schemat służący do określenia roli komponentów odporności wrodzonej w replikacji litycznej γHV68 in vivo oraz ex vivo.
<img alt="Schemat szlaku RIG-I pokazujący aktywację MAVS; produkcję cytokin, IFNα/β; wykres PFU/płuca." src="/files/ftp_upload/3140/3140fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Miano γHV68 w płucach myszy Mavs+/+ i Mavs-/-. A) Dwa główne szlaki sygnalizacji wrodzonej poniżej MAVS. Cząsteczka adaptorowa MAVS przekazuje sygnały z cytozolowych receptorów RIG-I-like w celu aktywacji NFκB oraz czynników regulacyjnych interferonu (IRFs), które z kolei zwiększają ekspresję genów cytokin prozapalnych i interferonów. B) Myszy Mavs+/+ oraz Mavs-/- zainfekowano donosowo dawką 40 PFU γHV68, a miano wirusa w płucach w określonych punktach czasowych określono za pomocą testu plackowego z wykorzystaniem monowarstwy NIH3T3. Każdy symbol reprezentuje jedną mysz.
<img alt="Wzrost infekcji wirusowej i poziomy mRNA; dwa wykresy, PFU/ml i ilość mRNA po dniach infekcji." src="/files/ftp_upload/3140/3140fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Kinetyka replikacji litycznej γHV68 w embrionalnych fibroblastach mysich (MEFs). Replikację lityczną γHV68 w MEFs Mavs+/+ oraz Mavs-/- oceniono za pomocą wielostopniowych krzywych wzrostu (A) oraz ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (B). W obu eksperymentach do infekcji wirusowej użyto równej liczby MEFs i ilości γHV68 przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 0,01. (A) Komórki i nadsącz zbierano w określonych punktach czasowych i poddawano testowi plackowemu w celu określenia miana wirusa. (B) Całkowity RNA wyekstrahowano z MEFs zainfekowanych γHV68 i przeanalizowano za pomocą ilościowej PCR w czasie rzeczywistym z zastosowaniem starterów specyficznych dla wybranych transkryptów litycznych (RTA, ORF57 oraz ORF60).
<img alt="Wykres wzrostu infekcji wirusowej; porównanie genotypów Mavs; PFU/ml, ilość mRNA; wykres eksperymentalny." src="/files/ftp_upload/3140/3140fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Kinetyka replikacji litycznej rekombinowanego γHV68 zawierającego mutacje w domenie transaktywacyjnej RTA, które znoszą fosforylację przez IKKγ. (A) Wielostopniowe krzywe wzrostu rekombinowanego wirusa typu dzikiego (γHV68.wt) oraz wirusa zmutowanego (γHV68.mut) w komórkach MEF Mavs+/+ i Mavs-/- (MOI=0,01). Komórki MEF zainfekowano γHV68 przy MOI wynoszącym 0,01. Komórki i nadsączone pobierano we wskazanych punktach czasowych, a miana wirusa określano za pomocą testu plackowego z wykorzystaniem monowarstwy NIH 3T3. (B) Poziom mRNA RTA γHV68 w zainfekowanych γHV68 komórkach NIH3T3 (MOI=0,01). W 30 h po infekcji z zainfekowanych γHV68 komórek NIH 3T3 wyizolowano całkowite RNA i przeanalizowano je za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym.

<ol><li>Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen+recognition+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogen recognition and innate immunity.</a> Cell. 124, 783-801 (2006).</li>
<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+microorganisms+and+activation+of+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recognition of microorganisms and activation of the immune response.</a> Nature. 449, 819-826 (2007).</li>
<li>Speck, S. H., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+and+viral+genetics+of+chronic+infection%3A+a+mouse+model+of+gamma-herpesvirus+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Host and viral genetics of chronic infection: a mouse model of gamma-herpesvirus pathogenesis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 2, 403-409 (1999).</li>
<li>Speck, S. H., Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+latency+and+its+regulation%3A+lessons+from+the+gamma-herpesviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Viral latency and its regulation: lessons from the gamma-herpesviruses.</a> Cell Host Microbe. 8, 100-115 (2010).</li>
<li>Dong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+gamma-herpesvirus+68+hijacks+MAVS+and+IKKbeta+to+initiate+lytic+replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Murine gamma-herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to initiate lytic replication.</a> PLoS Pathog. 6, e1001001-e1001001 (2010).</li>
<li>Strauss, W. M. Preparation of genomic DNA from mammalian tissues. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStrauss%2C+WM+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. Ausubel, F. M. , John Wiley & Sons, Inc. 2-2 (1998).</li>
<li>Song, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+viral+genes+essential+for+replication+of+murine+gamma-herpesvirus+68+using+signature-tagged+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Identification of viral genes essential for replication of murine gamma-herpesvirus 68 using signature-tagged mutagenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 3805-3810 (2005).</li>
<li>Hirt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+extraction+of+polyoma+DNA+from+infected+mouse+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures.</a> J. Mol. Biol. 26, 365-369 (1967).</li>
<li>Zhao, S., Stodolsky, M. Cloning of β-herpesvirus genomes as bacterial artificial chromosomes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEva-Maria+Borst%2C+E+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. , Humana Press Inc. 256-256 (2004).</li>
<li>Sun, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+specific+and+essential+role+of+MAVS+in+antiviral+innate+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The specific and essential role of MAVS in antiviral innate immune responses.</a> Immunity. 24, 633-642 (2006).</li>
<li>Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+MAVS%2C+a+mitochondrial+antiviral+signaling+protein+that+activates+NF-kappaB+and+IRF+3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3.</a> Cell. 122, 669-682 (2005).</li>
<li>Kawai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IPS-1%2C+an+adaptor+triggering+RIG-I-+and+Mda5-mediated+type+I+interferon+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IPS-1, an adaptor triggering RIG-I- and Mda5-mediated type I interferon induction.</a> Nat. Immunol. 6, 981-988 (2005).</li>
<li>Meylan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardif+is+an+adaptor+protein+in+the+RIG-I+antiviral+pathway+and+is+targeted+by+hepatitis+C+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus.</a> Nature. 437, 1167-1172 (2005).</li>
<li>Xu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VISA+is+an+adapter+protein+required+for+virus-triggered+IFN-beta+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">VISA is an adapter protein required for virus-triggered IFN-beta signaling.</a> Mol. Cell. 19, 727-740 (2005).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

W odpowiedzi na infekcję wirusową aktywowane są zależne od MAVS szlaki sygnalizacyjne odporności wrodzonej, aby promować produkcję przeciwirusowych cytokin zapalnych10-14. Wykorzystując mysi wirus γHV68 jako model wirusa dla ludzkiego onkogennego wirusa herpes związanego z ziarniakiem Kaposiego oraz wirusa Epstein-Barr3,4, odkryliśmy, że γHV68 zawłaszcza szlak MAVS-IKKβ, aby promować lityczną replikację wirusa poprzez aktywację transkrypcyjną5. Dzięki zastosowaniu genetycznie zmodyfikowan...

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Komórki kompetentne Electro-MAX DH10B</td><td>Invitrogen</td><td>18290-015</td><td></td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do minipreparacji plazmidów POWERPREP HP</td><td>OriGene</td><td>NP100004</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do midipreparacji plazmidów POWERPREP HP</td><td>OriGene</td><td>NP100006</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza oddziaływań gospodarz-wirus podczas litycznej replikacji modelowego herpeswirusa

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

W odpowiedzi na infekcję wirusową organizm gospodarza wykształca różnorodne odpowiedzi obronne, takie jak aktywacja wrodzonych szlaków sygnalizacji immunologicznej, które prowadzą do produkcji cytokin przeciwwirusowych1,2. Aby skolonizować gospodarza, wirusy muszą unikać jego odpowiedzi przeciwwirusowych i manipulować szlakami sygnalizacyjnymi. Zrozumienie interakcji między gospodarzem a wirusem pozwoli na opracowanie nowych strategii terapeutycznych przeciwko infekcjom wirusowym.
Mysi wirus γHV68 jest blisko spokrewniony z ludzkim onkogennym wirusem związanym z ziarniakowładzakem Kaposiego oraz wirusem Epsteina-Barr3,4. Infekcja γHV68 u myszy laboratoryjnych stanowi praktyczny model małego zwierzęcia do badania całego przebiegu odpowiedzi gospodarza i infekcji wirusowej in vivo, co nie jest możliwe w przypadku ludzkich herpeswirusów. W niniejszym protokole przedstawiamy panel metod do charakterystyki fenotypowej i molekularnej analizy komponentów sygnalizacyjnych gospodarza podczas litycznej replikacji γHV68 zarówno in vivo, jak i ex vivo. Dostępność genetycznie zmodyfikowanych szczepów myszy umożliwia badanie roli szlaków sygnalizacyjnych gospodarza podczas ostrej infekcji γHV68 in vivo. Ponadto embrionalne fibroblasty mysie (MEFs) wyizolowane z tych deficyjnych szczepów myszy mogą być wykorzystane do dalszej analizy roli tych cząsteczek podczas litycznej replikacji γHV68 ex vivo.
Wykorzystując testy wirusologiczne i biologii molekularnej, możemy precyzyjnie określić mechanizm molekularny oddziaływań gospodarz-wirus oraz zidentyfikować geny gospodarza i wirusa niezbędne do litycznej replikacji wirusa. Wreszce system bakteryjnego sztucznego chromosomu (BAC) umożliwia wprowadzenie mutacji do czynnika (czynników) wirusowych, które specyficznie przerywają oddziaływanie gospodarz-wirus. Rekombinowany szczep γHV68 niosący te mutacje może być wykorzystany do odtworzenia fenotypów litycznej replikacji γHV68 w MEF z deficytem kluczowych komponentów sygnalizacyjnych gospodarza. Niniejszy protokół stanowi doskonałą strategię badania oddziaływań gospodarz-patogen na wielu poziomach interwencji in vivo oraz ex vivo.
Niedawno odkryliśmy, że γHV68 przejmuje szlak sygnałowy odporności wrodzonej w celu promowania litycznej replikacji wirusa5. Konkretnie, infekcja de novo γHV68 aktywuje kinazę immunologiczną IKKβ, a aktywowana IKKβ fosforyluje główny wirusowy czynnik transkrypcyjny, replikator i transaktywator (RTA), aby promować wirusową aktywację transkrypcyjną. W ten sposób γHV68 skutecznie wiąże swoją aktywację transkrypcyjną z aktywacją wrodzonej odporności gospodarza, ułatwiając tym samym transkrypcję wirusa i replikację lityczną. Niniejsze badanie stanowi doskonały przykład, który można zastosować do innych wirusów w celu analizy interakcji między gospodarzem a wirusem.

Opisujemy protokół służący do identyfikacji kluczowych ról cząsteczek sygnałowych gospodarza w litycznej replikacji modelowego herpeswirusa, gamma herpeswirusa 68 (γHV68). Wykorzystując genetycznie zmodyfikowane szczepy myszy oraz fibroblasty zarodkowe do litycznej replikacji γHV68, protokół ten umożliwia zarówno charakterystykę fenotypową, jak i analizę molekularną oddziaływań wirus-gospodarz podczas litycznej replikacji wirusa.

Analiza oddziaływań gospodarz-wirus podczas litycznej replikacji modelowego herpeswirusa

W odpowiedzi na infekcję wirusową organizm gospodarza wykształca różne odpowiedzi obronne, takie jak aktywacja wrodzonych szlaków sygnalizacyjnych odporności, które prowadzą do działania przeciwwirusowego...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wykorzystanie różnych podejść wirologicznych i biochemicznych do przeanalizowania roli szlaku sygnalizacyjnego gospodarza w litycznej replikacji modelowego wirusa opryszczki. Jako przykład badamy tutaj rolę mitochondrialnego białka sygnalizacji przeciwwirusowej Mavs podczas infekcji wirusem opryszczki gamma HV 68. W celu zbadania roli Mavs podczas ostrej infekcji, myszy typu dzikiego oraz myszy z nokautem genu Mavs zostają zainfekowane gamma HV 68 w ramach ostrej infekcji wirusowej.Pobiera się płuca myszy, a następnie wyznacza miano wirusa za pomocą testu plackowego, w którym próbki są rozcieńczane seryjnie i wysiewane. Następnie na monowarstwach zlicza się liczbę placków. Zwiększone miano wirusa u myszy z knockoutem sugeruje, że badany gen pełni rolę przeciwwirusową.W przeciwieństwie do tego, zmniejszona wiremia u myszy z knockoutem wskazuje, że gen ten jest niezbędny do infekcji wirusowej. Aby zweryfikować te wyniki, badano kinetykę wieloetapowego wzrostu wirusa in vitro w zarodkowych fibroblastach mysich; zarodkowe fibroblasty mysie typu dzikiego oraz zarodkowe fibroblasty mysie z knockoutem mavs zainfekowano wirusem gamma HV 68 i inkubowano przez różne odstępy czasu. Następnie zebrano komórki i przeprowadzono testy płytkowe, aby porównać kinetykę wieloetapowego wzrostu między komórkami typu dzikiego a komórkami z niedoborem mavs.Aby dodatkowo zweryfikować te wyniki, zarazem embrionalne fibroblasty mysie typu dzikiego oraz z knockoutem genu mavs są infekowane wirusem gamma HV 68. Następnie z zainfekowanych komórek oddzielnie ekstrahuje się DNA i RNA, a transkrypty genomowe wirusa analizuje się za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Pomysł na ten protokół pojawił się podczas badania roli szlaku odporności gospodarza podczas litycznej infekcji wirusowej.Niniejszy protokół może potencjalnie zostać zastosowany do badania reguł sygnałowych szlaków gospodarza podczas infekcji innymi patogenami. Przed rozpoczęciem procedury należy pozwolić myszom w wieku od sześciu do ośmiu tygodni, dobranym pod względem płci i pochodzącym z jednego miotu, na aklimatyzację przez okres czterech dni po transporcie. Poniższy eksperyment zostanie przeprowadzony w obiekcie przeznaczonym do pracy z materiałem biologicznym niebezpiecznym.W ramach przygotowań należy założyć środki ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny, rękawiczki, maskę oraz ochraniacze na obuwie, pracując w komorze bezpieczeństwa biologicznego poziomu drugiego. Przygotować zawiesinę wirusową zawierającą od 40 do 10 000 PFU gamma HV 68 oraz 30 µL sterylnego PBS dla każdej myszy, która zostanie zainfekowana.Przechowywać zawiesinę wirusową w lodu po podaniu dostronikowym ketaminy i ksylazyny. Upewnić się, że myszy zostały uspokojone, wykonując próbę uszczypnięcia palca. Następnie, używając pipety, wprowadzić 30 µL zawiesiny wirusowej kroplami do lewej lub prawej dziurki nosa.Połóż mysz na boku na pięć do 10 minut, aby ułatwić dostarczenie wirusa do płuc drogą oddechową. Następnie umieść myszy z powrotem w klatce i monitoruj je, aż całkowicie wybudzą się z sedacji. Następnie od pobranych myszy pobiera się tkankę płucną w celu przygotowania lizatu komórkowego do oceny miana wirusa w różnych dniach po infekcji.Umieścić płuca pobrane od uśpionych myszy w sterylnych probówkach z nakrętką o pojemności 1,5 ml zawierających 500 µL kulek cyrkonowo-krzemionkowych o średnicy 1,0 mm, a następnie przenieść na lód. Jeśli następny krok nie zostanie wykonany tego samego dnia, próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.W przeciwnym razie należy dodać 1 mL zimnej pożywki DMEM bez surowicy. Umieść probówkę w homogenizatorze kulkowym i naciśnij start, aby homogenizować płuca przez 30 s. Pozwoli to uniknąć przegrzania próbki, co mogłoby doprowadzić do inaktywacji wirusa.Schładzaj probówkę na lodzie przez co najmniej jedną minutę po 30 sekundach homogenizacji. Następnie powtórz ten proces. W dalszej kolejności odwiruj zhomogenizowaną tkankę przy 16 000 RCF w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną minutę.Po wirowaniu szczątki komórkowe znajdą się na dnie probówki, a lipidy na powierzchni. Należy niezwłocznie pobrać supernatant, jak pokazano tutaj, aby przeprowadzić test plackowy z wykorzystaniem monowarstwy komórek NIH 3T3 lub BHK-21. Następnie wykonuje się test plackowy w celu oznaczenia miana wirusa w próbce; należy rozpocząć go od przygotowania rozcieńczeń seryjnych supernatantu wirusowego.W pierwszej kolejności za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 270 µL pożywki do płytki 96-dołkowej. Pozostaw pierwszy rząd pusty. Następnie dodaj 200 µL supernatantu do pierwszego rzędu płytki 96-dołkowej, nanosząc każdą próbkę w trzech powtórzeniach.Następnie przenieś 30 µL próbki z pierwszego rzędu do następnego rzędu i wymieszaj. Następnie przenieś 30 µL mieszaniny do kolejnego rzędu i wymieszaj. Powtórz ten krok wielokrotnie, aby przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne.Następnie nanieś rozcieńczony nadsącz wirusowy na monowarstwę komórkową w płytce 24-dołkowej. Umieść płytkę w inkubatorze i wstrząsaj nią co 30 minut podczas dwugodzinnej inkubacji. Po zakończeniu inkubacji odessaj nadsącz z płytki, aby usunąć szczątki komórkowe.Następnie raz przemyj komórki świeżą pożywką. Po przemyciu dodaj do komórek pożywkę zawierającą metylocelulozę. Inkubuj komórki przez cztery do sześciu dni.Po upływie od czterech do sześciu dni należy za pomocą mikroskopu odczytać liczbę plak dla każdej próbki. Zapisz liczbę plak dla każdego rozcieńczenia.Następnie oblicz średnią oraz odchylenie standardowe. Do dokładnego obliczenia miana nie można wykorzystać dołków zawierających zbyt wiele lub zbyt mało plak. W związku z tym dla każdej próbki należy wybrać takie rozcieńczenie, w którym znajduje się od 7 do 70 plak.Próbka ta, rozcieńczona 1000-krotnie, zawiera średnio 23 plaki na dołek. Aby obliczyć miano wirusa w nierozcieńczonym roztworze, należy pomnożyć współczynnik rozcieńczenia przez liczbę plaków oraz liczbę mikrolitrów w jednym mililitrze. Następnie wynik ten należy podzielić przez objętość rozcieńczonego nadosadu dodaną do każdego dołka.W tym przykładzie: 1000 razy 23 plakówki razy 1000 µL na ml podzielone przez 100 µL równa się 2,3 × 10⁵ jednostek tworzących kolonie na ml. Następnie roztwór zapasu wirusa o znanym mianie jest wykorzystywany do wyznaczenia kinetyki wzrostu gamma HV 68 w embrionalnych fibroblastach mysich. Procedurę rozpoczyna się od wysiania mysich fibroblastów typu dzikiego oraz tych z deficytem określonego genu gospodarza na płytkę 24-dołkową w zagęszczeniu 10 000 komórek na dołek. Następnego dnia medium w każdym dołku należy zastąpić 0,5 ml zawiesiny gamma HV 68 o niskim MOI.Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i inkubuj przez dwie godziny. Co 30 minut w trakcie inkubacji delikatnie potrząśnij płytką. Za pomocą pipety usuń zawiesinę wirusa, a następnie dodaj 0,5 ml świeżego, kompletnego medium DMEM zawierającego 8% płodowej surowicy bydlęcej do zainfekowanych wirusem komórek.Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze w określonych dniach po infekcji. Zebrać medium i komórki, pipetując wielokrotnie w górę i w dół. Przenieść je do sterylnych probówek do wirowania o pojemności 1,5 milliliter, a następnie natychmiast zamrozić probówki w temperaturze minus 80 degrees Celsius, aby uwolnić gamma HV 68 z komórek.Przeprowadź trzy cykle zamrażania i rozmrażania. Rozmroź komórki, umieszczając je w temperaturze 37°C. Następnie wymieszaj je w wortexie i ponownie umieść w zamrażarce w temperaturze -80°C.Wyznacz miano wirusa za pomocą metody plackowej, wykorzystując monowarstwę komórek NIH 3T3 lub BHK 21 zgodnie z wcześniejszym opisem, aby zbadać, czy replikacja DNA lub RNA jest zaburzona przez deficyt genów gospodarza lub genów wirusowych. Rozpocznij od zainfekowanych komórek w różnych dniach po infekcji, odlej supernatant, wypłucz komórki zimnym PBS i zneutralizuj je trypsyną w lodzie. Następniet osadź komórki poprzez wirowanie przy 1000 RCF w temperaturze pokojowej przez jedną minutę; po wirowaniu odlej supernatant i przechowuj komórki w temperaturze -80 °C.Wyekstrahuć całkowite DNA i RNA pochodzenia gospodarza oraz wirusa. Następnie odwiruj kolumny do oczyszczania. Przeprowadź reakcję real-time PCR z wykorzystaniem całkowitego DNA oraz starterów specyficznych dla litycznych transkrypty wirusowych.Wyznacz względną ilość wewnątrzkomórkowego genomu gamma HV 68 w odniesieniu do genu gospodarza odpowiedzialnego za podstawowe funkcje komórkowe, takiego jak beta aktyna. Przygotuj cDNA z całkowitego RNA i startera oligo DT. Przeprowadź reakcję real-time PCR z wykorzystaniem cDNA oraz starterów opisanych powyżej, aby określić względną ilość transkrypcyjnych produktów wirusa.W odniesieniu do genu gospodarza odpowiedzialnego za homeostazę, Mavs jest skrótem od mitochondrial antiviral signaling, co przedstawiono tutaj. Cząsteczka adapterowa Mavs przekazuje sygnały z cytozolowych receptorów podobnych do RIG, aby aktywować NF kappa B oraz czynniki regulacyjne interferonu (IRFs), które z kolei zwiększają ekspresję genów cytokin prozapalnych i interferonów. Przedstawiono tutaj ładunek wirusowy w płucach myszy typu dzikiego oraz myszy z jednego miotu z niedoborem Mavs, zainfekowanych gamma HV.Niedobór Mavs znacząco zmniejszył ładunek wirusa w płucach 10 dni po zakażeniu, co wskazuje, że Mavs jest niezbędny do efektywnego zakażenia wirusem in vivo. Rysunek ten przedstawia wieloetapową krzywą wzrostu wirusa na embrionalnych fibroblastach mysich typu dzikiego oraz tych z niedoborem Mavs. Znaczące opóźnienie wzrostu wirusa na embrionalnych fibroblastach mysich wskazuje, że Mavs jest wymagany do efektywnej replikacji wirusa in vitro. Poziomy mRNA litycznych genów wirusowych w embrionalnych fibroblastach mysich zainfekowanych gamma HV 68 przeanalizowano za pomocą PCR w czasie rzeczywistym; niedobór Mavs znacząco obniżył poziomy mRNA trzech kluczowych genów litycznych.Wszystkie te wyniki wspólnie potwierdzają wniosek, że Mavs jest niezbędny do aktywacji transkrypcji gamma HV 68 oraz replikacji litycznej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre zrozumienie tego, jak badać interakcje między patogenem a gospodarzem na wielu poziomach, zarówno w VO, jak i w Vevo. Pamiętaj, że praca z patogenami może być niezwykle ryzykowna.Podczas przeprowadzania procedur należy zachować środki ostrożności, takie jak stosowanie środków ochrony osobistej.

dissecting-host-virus-interaction-lytic-replication-model

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Sekcjonowanie interakcji gospodarz-wirus w lizogenicznej replikacji wirusa opryszczki pospolitej

Protokół opisuje wydajny i powtarzalny system modelowy do badania latencji i reaktywacji wirusa prostego opryszczki typu 1 (HSV-1). Test wykorzystuje homogeniczne kultury neuronów współczulnych i umożliwia molekularną analizę oddziaływań wirus-neuron przy użyciu różnych narzędzi, w tym interferencji RNA oraz ekspresji białek rekombinowanych.

System hodowli pierwotnych neuronów do badania latencji i reaktywacji wirusa opryszczki zwykłej

Obrazowanie żywych komórek zakażeń wirusem opryszczki umożliwia analizę dynamicznych zdarzeń transportu kierowanego i rozprzestrzeniania się międzykomórkowego. W tym miejscu przedstawiamy metodologie, które wykorzystują rekombinowane szczepy wirusa eksprymujące fluorescencyjne białka fuzyjne, aby ułatwić wizualizację zespołów wirusowych podczas infekcji neuronów pierwotnych.

Obrazowanie żywych komórek transportu i rozprzestrzeniania się wirusa alfaopryszczki

Opisujemy protokół pomiaru produkcji cytokin przeciwwirusowych u myszy zakażonych modelowym herpeswirusem, mysim gamma herpesvirus 68 (γHV68), który jest blisko spokrewniony z ludzkim wirusem opryszczki Kaposiego (KSHV) i wirusem Epsteina-Barr (EBV). Wykorzystując genetycznie zmodyfikowane szczepy myszy i mysie fibroblasty embrionalne (MEF), oceniliśmy produkcję cytokin przeciwwirusowych zarówno in vivo, jak i ex vivo. "Odtwarzając" ekspresję wrodzonych składników odpornościowych w...

Analiza wrodzonej sygnalizacji immunologicznej w unikaniu produkcji cytokin przez wirusa

Ustaliliśmy protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania trwałego genomu wirusa DNA w sekcjach tkanek modeli zwierzęcych. Protokół ten umożliwia badanie procesu infekcji poprzez kodetekcję genomu wirusa, jego produktów RNA oraz białek wirusowych lub komórkowych w obrębie pojedynczych komórek.

Wykrywanie genomu i transkryptów przetrwałego wirusa DNA w tkankach neuronalnych za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ połączonej z barwieniem immunologicznym

Skóra jest jednym z celów ludzkiego patogenu wirusa opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1). Aby zbadać drogę inwazji HSV-1 do tkanki, ustaliliśmy model infekcji ex vivo mysich arkuszy naskórka, które reprezentują najbardziej zewnętrzną warstwę skóry.

Ex vivo Zakażenie mysiego naskórka wirusem opryszczki pospolitej typu 1

Celem tego protokołu jest specyficzne oznaczanie i selektywne izolowanie wirusowego DNA z zakażonych komórek w celu scharakteryzowania białek związanych z genomem wirusa.

Oczyszczanie DNA wirusa w celu identyfikacji powiązanych białek wirusowych i komórkowych

Tutaj prezentujemy protokoły identyfikacji 1) kodowanych przez wirusa immunomodulatorów, które promują replikację arbowirusa i 2) eukariotycznych czynników gospodarza, które ograniczają replikację arbowirusa. Te metody oparte na fluorescencji i luminescencji pozwalają naukowcom szybko uzyskać ilościowe odczyty replikacji arbowirusa w uproszczonych testach o niskim stosunku sygnału do szumu.

Zakażenia arbowirusem jako narzędzia przesiewowe do identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników przeciwwirusowych gospodarza

ICP0 ulega translokacji jądrowej do cytoplazmatycznej podczas infekcji HSV-1. Mechanizm molekularny tego zdarzenia nie jest znany. W tym miejscu opisujemy zastosowanie mikroskopu konfokalnego jako narzędzia do ilościowego określania ruchu ICP0 w zakażeniu HSV-1, co stanowi podstawę do ilościowej analizy translokacji ICP0 w przyszłych badaniach mechanistycznych.

Analiza czasowa translokacji jądrowej do cytoplazmatycznej białka wirusa opryszczki pospolitej 1 za pomocą immunofluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej

W tym badaniu prezentujemy strategie oparte na inhibitorach i siRNA, które mają na celu zakłócenie przepływu autofagicznego w komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów zakażonych wirusem opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1).

Elektroporacja siRNA w celu modulacji autofagii w komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów zakażonych wirusem opryszczki pospolitej typu 1

Wirusy z pseudotypami (PV) to wiriony z wadami replikacji, które są używane do badania interakcji gospodarz-wirus w bezpieczniejszych warunkach niż obsługa autentycznych wirusów. Przedstawiono szczegółowy protokół, który pokazuje, w jaki sposób PV SARS-CoV-2 mogą być wykorzystywane do testowania zdolności neutralizacyjnej surowicy pacjentów po szczepieniu przeciwko COVID-19.

Wirusy pseudotypowane jako narzędzie molekularne do monitorowania humoralnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko SARS-CoV-2 za pomocą testu neutralizacji

Protokół ten opisuje system in vitro do modelowania de novo litycznego zakażenia wirusem opryszczki związanego z mięsakiem Kaposiego przy użyciu wirionów pochodzących z BAC16. Metoda umożliwia badanie wczesnej replikacji i rozprzestrzeniania się wirusa. Produkcja wirusa zakaźnego jest określana ilościowo za pomocą testów jednostek zakaźnych opartych na GFP i PCR w czasie rzeczywistym enkapsydowanych genomów wirusowych.

Ustalenie i kwantyfikacja zakażenia litycznego de novo wirusem opryszczki związanym z mięsakiem Kaposiego

Poznaj metody badania interakcji gospodarz-wirus w litycznej replikacji herpeswirusa γHV68 przy użyciu myszy typu dzikiego i z nokautem genu Mavs. Dowiedz się, jak oznaczać miano wirusowe w płucach.

Analiza oddziaływań gospodarz-wirus podczas litycznej replikacji modelowego herpeswirusa

Przeglądaj więcej filmów