Analiza czasowa translokacji jądrowej do cytoplazmatycznej białka wirusa opryszczki pospolitej 1 za pomocą immunofluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie transportu białek dotyczące translokacji jądrowej i cytoplazmatycznej w systemie, w którym obrazowanie światłem nie jest dostępne. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją zastosować jako ogólny protokół do badania skroniowego ruchu białek bez konieczności obrazowania światłem. 20 do 24 godzin przed infekcją wirusową wysiewa się 5 razy 10 do 4 ludzkich embrionalnych komórek blastycznych płuc lub włókien HEL na studzienkę na czterodołkowym 11-milimetrowym szkiełku schodkowym i pożywce wzrostowej do nocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla.

Ważne jest, aby dokładnie kołysać szkiełkiem, aby zapewnić równomierne rozłożenie komórek, jednocześnie uważając, aby nie rozlać pożywki hodowlanej. Następnego dnia zastąp supernatanty tak, aby 70 do 80 procent zlewających się kultur było zlewające się z podłożem 199, zawierającym 410 jednostek tworzących płytki nazębne na komórkę, i umieść szkiełko w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając, na jedną godzinę. Pod koniec inkubacji zastąpić supernatanty świeżą pożywką wzrostową i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze na odpowiedni okres eksperymentalnego zakażenia.

W celu barwienia immunofluorescencyjnego komórek zakażonych wirusem, należy szybko przemyć komórki trzykrotnie PBS. Następnie następuje ośmio- do dziesięciominutowa inkubacja w 200 mikrolitrach czteroprocentowego paraformaldehydu w PBS na studzienkę. Pod koniec utrwalania umyj komórki trzykrotnie 200 mikrolitrami PBS na pranie i przepuszczaj komórki 100 mikrolitrami 0,2% niejonowego środka powierzchniowo czynnego na studzienkę przez pięć do dziesięciu minut.

Przemyć permeabilizowane komórki trzykrotnie w PBS, jak pokazano, i dodać 200 mikrolitrów buforu blokującego do każdej studzienki na jedną godzinę inkubacji w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj odpowiednie stężenie głównego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania do każdej studzienki w celu dwugodzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji usunąć wszelkie niezwiązane przeciwciała pierwszorzędowe za pomocą trzech dziesięciominutowych płukań w świeżym buforze blokującym i dodać odpowiednie przeciwciało drugorzędowe do każdej studzienki na jednogodzinną inkubację w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.

Pod koniec inkubacji przemyć komórki trzy razy w buforze blokującym, jak pokazano, a następnie przepłukać je jednym roztworem PBS i dodać do każdej studzienki jedną kroplę pożywki montażowej zapobiegającej blaknięciu uzupełnionej DAPI. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku i uszczelnij nachylenie pokrywy przezroczystym lakierem do paznokci. Delikatny nacisk podczas montażu szkiełka nakrywkowego usunie nadmiar medium mocującego, pomagając w zapewnieniu uzyskania wysokiej jakości obrazów.

Do obrazowania konfokalnego znakowanych, zakażonych komórek wybierz odpowiednie przeciwciało drugorzędowe i długości fal DAPI, a następnie ustaw format obrazu na 1 024 na 1 024 piksele ze średnią linią ośmiu. Następnie zobrazuj każdą studzienkę na szkiełku czterodołkowym pod obiektywem 100x. Aby zliczyć dużą liczbę komórek, uzyskaj od pięciu do dziesięciu obrazów z kolejnych pól w tej samej studni pod obiektywem 40x.

Aby przeanalizować rozkład jądrowy i cytoplazmatyczny ICP0, otwórz projekt w oprogramowaniu konfokalnym i wybierz obraz. Otwórz kartę Ilość i wybierz polecenie Sortuj obszary zainteresowania z menu Narzędzia. Wybierz opcję Rysuj linię i narysuj linię podłużną w poprzek komórki, która ma być analizowana.

Pojawi się histogram pokazujący intensywność fluorescencji wzdłuż linii zarówno dla interesującego białka, jak i DAPI. Na podstawie barwienia tła ustal stały próg intensywności białka będącego przedmiotem zainteresowania dla analizy subkomórkowej dystrybucji białka w każdym eksperymencie. Jeśli sygnał białkowy jest średnio poniżej progu w regionie jądrowym, ale jest powyżej progu poza granicą DAPI, sklasyfikuj sygnał białkowy jako zlokalizowany głównie w cytoplazmie.

Jeśli sygnał białkowy znajduje się powyżej progu w całym jądrze i poza granicą sygnału DAPI, pogrupuj sygnał białkowy jako jądro plus lokalizacja cytoplazmatyczna. Jeśli sygnał białkowy znajduje się powyżej progu w jądrze, ale średnio jest poniżej progu poza granicą grupy sygnałowej DAPI, białko sygnalizuje jako lokalizację jądrową. Na koniec należy zestawić w tabeli ponad 200 zainfekowanych komórek z każdej próbki w różnych punktach czasowych infekcji i nanieść dane na wykres słupkowy, aby zilustrować ruch białka będącego przedmiotem zainteresowania w czasie.

Jak wykazano, metoda ta ułatwia analizę translokacji białek będących przedmiotem zainteresowania z jądra do cytoplazmy. Na przykład zakażone białko komórkowe zero lub dystrybucja subkomórkowa ICP0 zmienia się wraz z postępem infekcji wirusowej. Aby zrozumieć elementy wymagane do transportu ICP0 podczas infekcji, ruchy ICP0 można śledzić w komórkach zakażonych wirusem opryszczki pospolitej typu dzikiego i zmutowanego typu 1 w różnych fazach infekcji, co pozwala na ocenę subkomórkowej dystrybucji ICP0 w różnych punktach czasowych infekcji.

Ważne jest, aby pamiętać o stosowaniu kultur jednowarstwowych, aby wiriony miały równy dostęp do komórek i normalizować wielość infekcji zgodnie z nazwą wirusa, tak aby postęp infekcji był porównywalny między wirusami i w ich obrębie. Po każdym opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny biologii i wirusologii komórkowej do badania ruchu białek poprzez badanie czasowych lokalizacji subkomórkowych białek będących przedmiotem zainteresowania w populacji komórek.