Name: Analiza czasowa translokacji jądrowej do cytoplazmatycznej białka wirusa opryszczki pospolitej 1 za pomocą immunofluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Poznaj metodę analizy translokacji jądrowo-cytoplazmatycznej białka ICP0 wirusa HSV-1 za pomocą mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia ilościowe badanie dynamiki białek w komórkach zakażonych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy finansowemu wsparciu z grantu NIH (RO1AI118992) przyznanego Haidong Gu. Dziękujemy Centrali Mikroskopii, Obrazowania i Cytometrii (MICR) na Uniwersytecie Stanowym Wayne za wsparcie techniczne.

1. Wysiewanie komórek i infekcja wirusowa
<ol>
	<li>W 20–24 godziny przed zakażeniem wirusem, nasiona 5 x 104 ludzkich komórek fibroblastów płuc zarodkowych (HEL) lub innych komórek, które należy zbadać na 4-dołkowym 11 mm schodkowym szkiełku w pożywce wzrostowej (zmodyfikowane podłoże Dulbecco Eagle Medium (DMEM) uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS)). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% dwutlenkiem węgla (CO2 ). 
	UWAGA: Każda studzienka powinna mieć 70-80% zbiegu komórek w momencie infekcji.</li>
	<li>Następnego dnia należy usunąć pożywkę wzrostową i zainfekować komórki wirusami w pożywce 199 w zakresie 4–10 pfu/komórkę. Inkubować komórki zakażone wirusem przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. W okresie inkubacji należy wstrząsać szkiełkiem.</li>
	<li>Po 1 godzinnej inkubacji usunąć Medium-199 i uzupełnić pożywką wzrostową. 
	UWAGA: Leki, które zakłócają różne fazy infekcji, mogą być dodawane na tym etapie lub przed wchłonięciem wirusa.</li>
	<li>Inkubować komórki zakażone wirusem w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez różną długość okresu infekcji.</li>
</ol>
2. Utrwalenie i przepuszczalność
<ol>
	<li>W odpowiednim momencie infekcji szybko przemyj zakażone komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) 3 razy i dodaj 200 μl 4% paraformaldehydu świeżo przygotowanego w PBS. Inkubuj komórki z paraformaldehydem przez 8-10 minut w temperaturze pokojowej, aby utrwalić komórki w każdym dołku.</li>
	<li>Odessać paraformaldehyd i przemyć studzienki 200 μl PBS 3 razy. Całkowicie odessać PBS po 3praniu.</li>
	<li>Dodaj 100 μl 0,2% niejonowego środka powierzchniowo czynnego do każdej studzienki, aby przepuszczalność komórek przez 5–10 minut.</li>
	<li>Odessać niejonowy środek powierzchniowo czynny i przemyć studzienki 200 μl PBS 3 razy.</li>
</ol>
3. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Całkowicie odessać PBS i dodać 200 μl buforu blokującego (1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 5% surowicy końskiej w PBS) do każdego dołka i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Dodać eksperymentalnie określone stężenie przeciwciała pierwszorzędowego (królicze przeciwciało poliklonalne anty-ICP0 12) w buforze blokującym i inkubować przeciwciało pierwszorzędowe w temperaturze pokojowej przez 2 godziny lub w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Przemyć buforem blokującym 3 razy w 10 minutowej inkubacji. Dodać sprzężone z Alexa 594 kozie przeciwciało drugorzędowe przeciwko królikowi (1:400 rozcieńczone w buforze blokującym) i inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Następnie umyć szkiełka 3 razy buforem blokującym w odstępie 10 minut.</li>
	<li>Na koniec umyj szkiełko raz PBS, aby usunąć resztki BSA i końskiej surowicy.</li>
	<li>Dodaj jedną kroplę podłoża mocującego antifade z 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI), aby zamontować szkiełko i uszczelnić je szkiełkiem nakrywkowym za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci.</li>
</ol>
4. Obrazowanie konfokalne
<ol>
	<li>Za pomocą mikroskopu konfokalnego ustaw długość fali na 590–650 nm dla Alexa 594 i 410–520 nm dla DAPI. Wybierz format obrazu 1024 x 1024 i średnią liniową 8, aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości.</li>
	<li>Przeanalizuj każdą studzienkę na 4-dołkowym szkiełku pod mikroskopem konfokalnym. Uzyskaj reprezentatywne obrazy komórek pod obiektywem 100X, jak pokazano na Rysunek 1 i <silna klasa="xfig">Rysunek 2.</li>
	<li>Aby zliczyć dużą liczbę komórek, wykonaj zdjęcia kolejnych pól pod obiektywem 40X. 
	UWAGA: Potrzeba 5–10 obrazów, aby zgromadzić ponad 200 zainfekowanych komórek z każdego punktu czasowego każdej infekcji.</li>
	<li>W każdym eksperymencie należy wykonać zdjęcia ze stałymi parametrami konfokalnymi dla wszystkich próbek.</li>
</ol>
5. Analiza dystrybucji jądrowej i cytoplazmatycznej
<ol>
	<li>Otwórz projekt za pomocą oprogramowania konfokalnego. Wybierz obraz, z którego komórki muszą zostać zestawione w tabeli pod kątem dystrybucji jądrowej i cytoplazmatycznej ICP0.</li>
	<li>Kliknij zakładkę "Ilość" w górnym menu i wybierz "sortuj ROI" z menu narzędzi.</li>
	<li>Narysuj linię podłużną w poprzek komórki, która ma być analizowana, wybierając "Rysuj linię" z górnego menu. 
	UWAGA: Pojawi się histogram pokazujący intensywność fluorescencji wzdłuż linii zarówno dla ICP0, jak i DAPI. Na histogramie niebieska linia reprezentuje piksele DAPI i wyznacza granicę jądra, podczas gdy czerwona linia reprezentuje piksele ICP0.</li>
	<li>Na podstawie barwienia tła ustaw stały próg intensywności ICP0, aby przeanalizować dystrybucję subkomórkową ICP0 w każdym eksperymencie.
	<ol>
		<li>Jak pokazano na przykładzie Rysunek 2, jeśli czerwony sygnał jest średnio poniżej progu w obszarze jądrowym, ale jest powyżej progu poza niebieską granicą, skategoryzuj czerwony sygnał jako zlokalizowany głównie w cytoplazmie.</li>
		<li>Jeśli sygnał czerwony znajduje się powyżej progu w całym jądrze i poza granicą sygnału niebieskiego, pogrupuj sygnał czerwony jako jądro plus lokalizacja cytoplazmatyczna.</li>
		<li>Jeśli sygnał czerwony znajduje się powyżej progu w jądrze, ale średnio znajduje się poniżej niego poza granicą sygnału niebieskiego, należy pogrupować sygnał czerwony jako lokalizację jądrową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz w tabeli ponad 200 zainfekowanych komórek z każdej próbki w różnym czasie infekcji i narysuj wykres słupkowy, aby zilustrować ruch ICP0 w zależności od czasu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3).</li>
</ol>

<ol><li>Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., et al. Pathogenesis and disease. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhitley%2C+R+%22Human+Herpesviruses%3A+Biology%2C+Therapy%2C+and+Immunoprophylaxis%22">Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis</a>. Arvin, A., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).</li>
<li>Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., et al. Herpes simplex viruses. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoizman%2C+B+%22Fields%27+Virology%22">Fields' Virology</a>. Knipe, D. M. , 6th Edition, Lippincott-Williams & Wilkins. USA. 1823-1897 (2013).</li>
<li>Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infected+cell+protein+0+functional+domains+and+their+coordination+in+herpes+simplex+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication.</a> World Journal of Virology. 5 (1), 1-13 (2016).</li>
<li>Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+the+nuclear-cytoplasmic+translocation+of+infected-cell+protein+0+of+herpes+simplex+virus+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1.</a> Journal of Virology. 75 (8), 3832-3840 (2001).</li>
<li>Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+1+alpha+regulatory+protein+ICP0+interacts+with+and+stabilizes+the+cell+cycle+regulator+cyclin+D3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3.</a> Journal of Virology. 71 (10), 7328-7336 (1997).</li>
<li>Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+intracellular+localization+domains+and+evidence+for+colocalization+interactions+between+the+IE110+and+IE175+nuclear+transactivator+proteins+of+herpes+simplex+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus.</a> Journal of Virology. 68 (5), 3250-3266 (1994).</li>
<li>Maul, G. G., Everett, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+location+of+PML%2C+a+cellular+member+of+the+C3HC4+zinc-binding+domain+protein+family%2C+is+rearranged+during+herpes+simplex+virus+infection+by+the+C3HC4+viral+protein+ICP0%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0.</a> Journal of General Virology. 75 (6), 1223-1233 (1994).</li>
<li>Chelbi-Alix, M. K., de The, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+virus+induced+proteasome-dependent+degradation+of+the+nuclear+bodies-associated+PML+and+Sp100+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins.</a> Oncogene. 18 (4), 935-941 (1999).</li>
<li>Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tale+of+Two+PMLs%3A+Elements+Regulating+a+Differential+Substrate+Recognition+by+the+ICP0+E3+Ubiquitin+Ligase+of+Herpes+Simplex+Virus+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1.</a> Journal of Virology. 90 (23), 10875-10885 (2016).</li>
<li>Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSV-1+ICP0%3A+An+E3+Ubiquitin+Ligase+That+Counteracts+Host+Intrinsic+and+Innate+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity.</a> Cells. 3 (2), 438-454 (2014).</li>
<li>Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+three+redundant+segments+responsible+for+herpes+simplex+virus+1+ICP0+to+fuse+with+ND10+nuclear+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies.</a> Journal of Virology. 89 (8), 4214-4226 (2015).</li>
<li>Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Elements+Regulating+the+Nuclear-to-Cytoplasmic+Translocation+of+ICP0+in+Late+Herpes+Simplex+Virus+1+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection.</a> Journal of Virology. 92 (2), e01673-e01617 (2018).</li>
<li>Gu, H. <a target="_blank" href="https://www.futuremedicine.com/doi/abs/10.2217/fvl-2018-0038">What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection?</a> Future Virology. 13 (6), (2018).</li>
<li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24974023">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li>
<li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li>
<li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+as+a+toolkit+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging.</a> Trends in Biotechnology. 23 (12), 605-613 (2005).</li>
<li>Teng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+proteins+inside+living+cells+using+external+fluorophores+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy.</a> Elife. 5, e20378(2016).</li>
<li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten został wykorzystany do badania translokacji ICP0 HSV-1 z jądra do cytoplazmy. ICP0 ulega transportowi subkomórkowemu podczas infekcji HSV-1 (ryc. 1). Prawdopodobnie ICP0 oddziałuje z różnymi szlakami komórkowymi, aby wykonywać różne funkcje w różnych lokalizacjach. Dzięki temu ICP0 może dostroić swoje liczne funkcje w przeciąganiu liny z ludzkim gospodarzem13. Jednak sposób, w jaki ICP0 koordynuje wiele funkcji w sposób przestrzenno-czasowy, nie został do...

Wirus opryszczki pospolitej 1 (HSV-1) powoduje szeroki zakres łagodnych i ciężkich chorób opryszczkowych, w tym opryszczkę wargową, opryszczkę narządów płciowych, zapalenie rogówki i zapalenie mózgu. Po zakażeniu wirus tworzy utajoną infekcję w neuronach zwojowych na całe życie. Czasami wirus może być reaktywowany z różnych powodów, takich jak gorączka, stres i supresja immunologiczna1, co prowadzi do nawracającego zakażenia opryszczką. Zakażone białko komórkowe 0 (ICP0) jest kluczowym regulatorem wirusa, kluczowym zarówno dla litycznego, jak i utajonego zakażenia HSV-1. Transaktywuje dalsze geny wirusa poprzez przeciwdziałanie wewnętrznej/wrodzonej obronie przeciwwirusowej gospodarza2,3. ICP0 wykazuje aktywność ligazy ubikwityny E3, która jest ukierunkowana na kilka czynników komórkowych degradacji zależnej od proteasomu3. Oddziałuje również z różnymi szlakami komórkowymi, regulując ich aktywność, a następnie równoważąc ograniczenia przeciwwirusowe gospodarza3. Wiadomo, że ICP0 lokalizuje się w różnych przedziałach subkomórkowych w miarę postępu infekcji3,4,5. Białko ma bogaty w lizynę/argininę sygnał lokalizacji jądrowej (NLS) zlokalizowany w resztach od 500 do 5066. Po syntezie de novo we wczesnym zakażeniu HSV-1, ICP0 jest natychmiast importowany do jądra. Po raz pierwszy wykrywa się go w dynamicznej strukturze jądrowej określanej jako domena jądrowa 10 (ND10)7. Aktywność ligazy ubikwityny E3 ICP0 wyzwala degradację białek organizatora ND10, białka białaczki promielocytowej (PML) i białka nakrapianego 100 kDa (Sp100)8,9,10. Po utracie białek organizatorowych, ciała jądrowe ND10 są rozpraszane, a ICP0 ulega dyfuzji, wypełniając całe jądro4,11.
Ciekawe, po rozpoczęciu replikacji DNA wirusa, ICP0 znika z jądra. Występuje wyłącznie w cytoplazmie, co sugeruje wystąpienie translokacji jądrowej do cytoplazmatycznej pod koniec infekcji HSV-14,12. Wymóg replikacji DNA implikuje potencjalny udział późnego białka (białek) wirusa w ułatwianiu cytoplazmatycznej translokacji HSV-1 ICP04,12. Wygląda na to, że transport ICP0 między różnymi przedziałami podczas infekcji umożliwia ICP0 modulowanie swoich interakcji z różnymi szlakami komórkowymi w sposób przestrzenno-czasowy, a tym samym koordynowanie swoich wielu funkcji w celu precyzyjnego dostrojenia równowagi między lityczną a utajoną infekcją HSV-113. Aby lepiej zrozumieć wielofunkcyjność ICP0 i koordynację domen funkcjonalnych ICP0 w całej infekcji litycznej, dokładnie przeanalizowaliśmy molekularne podstawy dynamicznej translokacji ICP012. Aby przeprowadzić wcześniej opisane badania mechanistyczne12, zastosowaliśmy metodę barwienia immunofluorescencyjnego, aby zobrazować lokalizację subkomórkową ICP0 w różnym stanie infekcji pod mikroskopem konfokalnym. Opracowaliśmy również protokół ilościowy do analizy dystrybucji jądrowej i cytoplazmatycznej ICP0 za pomocą oprogramowania konfokalnego. Populacja komórek zakażonych HSV-1 została zestawiona w tabelach we wszystkich fazach infekcji i przeanalizowano trendy ruchu ICP0 w ramach różnych zabiegów biochemicznych12. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół, który dokumentuje translokację ICP0 w zakażeniu HSV-1. Proponujemy, aby ta metoda mogła zostać przyjęta jako ogólna metoda badania translokacji jądrowej i cytoplazmatycznej dla innych białek wirusowych lub komórkowych, co może służyć jako alternatywa dla obrazowania na żywo, gdy technika obrazowania na żywo nie ma zastosowania z powodu problemów, takich jak metoda znakowania, intensywność sygnału lub obfitość białek.

<table><tbody><tr><td><silne>komórki i wirusy</silne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ludzkie embrionalne fibroblasty płuc (komórki HEL)</td><td>Dr Thomas E. Shenk (Uniwersytet Princeton)</td><td></td><td>Komórki HEL hodowano w DMEM uzupełnionym 10%</td></tr><tr><td>wirusem FBS HSV-1 Stock (szczep F)</td><td>Dr. Bernard Roizman Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>Średni</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; 11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F0926-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Medium-199 (10x)</td><td>Gibco</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr>4<tr><td>- well 11 mm schodkowa naprzemienna</td><td>Cel-Line/Thermofisher Scientific</td><td>&nbsp; 30-149H-BLACK</td><td></td></tr><tr><td>16% roztwór paraformaldehydu (w/v) Bez metanolu</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Odczynniki Fisher</td><td>BP151-1C0</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Abumin (BSA)</td><td>Calbiochem</td><td>CAS 9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Surowica dla koni</td><td>Sigma</td><td>H1270</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH 7,4)</td><td>Dr. Haidong Gu lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Bioodczynnik Fisher</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Bioodczynnik Fisher</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Fisher Bioreagent</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Bufor blokujący (PBS z 1% BSA i 5% surowicą końską)</td> <td>Dr. Haidong Gu lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabiit Przeciwciało anty-ICP0</td><td>Dr. Haidong Gu lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PML (PG-M3)-Mysi monoklonalny IgG</td><td>santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-966</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-kozia anty-królicza IgG</td><td>invitrogen</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-koza anty-mysia IgG</td><td>invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Pożywka do metalu z laboratoriami DAPI</td><td>Vector</td><td>Pipeta H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur</td><td>Fisher Brand</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Lakier do paznokci</td><td>Sally Hansen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td> <td>konfokalnyLeica SP8</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal Software</td><td>Leica LAS X Pakiet aplikacji Oprogramowanie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2 Thermo</td><td>Scientific</td><td>Kod zamówienia 51026282</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza czasowa translokacji jądrowej do cytoplazmatycznej białka wirusa opryszczki pospolitej 1 za pomocą immunofluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Zakażone białko komórkowe 0 (ICP0) wirusa opryszczki pospolitej 1 (HSV-1) jest natychmiastowym wczesnym białkiem zawierającym ligazę ubikwityny typu RING E3. Jest odpowiedzialny za proteasomalną degradację czynników ograniczających gospodarza i późniejszą aktywację genów wirusa. ICP0 zawiera kanoniczną sekwencję lokalizacji jądrowej (NLS). Dostaje się do jądra natychmiast po syntezie de novo i realizuje swoje funkcje obronne przeciwko gospodarzowi głównie w jądrze. Jednak w późniejszej fazie infekcji ICP0 znajduje się wyłącznie w cytoplazmie, co sugeruje wystąpienie translokacji jądrowej do cytoplazmatycznej podczas infekcji HSV-1. Przypuszczalnie translokacja ICP0 umożliwia ICP0 modulowanie swoich funkcji zgodnie z jego subkomórkowymi lokalizacjami w różnych fazach infekcji. W celu nakreślenia funkcji biologicznej i mechanizmu regulacyjnego translokacji jądrowej do cytoplazmatycznej ICP0, zmodyfikowaliśmy metodę mikroskopii immunofluorescencyjnej w celu monitorowania transportu ICP0 podczas infekcji HSV-1. Protokół ten obejmuje barwienie immunofluorescencyjne, obrazowanie mikroskopem konfokalnym oraz analizę dystrybucji jądrowej i cytoplazmatycznej. Celem tego protokołu jest adaptacja obrazów konfokalnych w stanie stacjonarnym wykonanych w czasie do ilościowej dokumentacji ruchu ICP0 podczas infekcji litycznej. Proponujemy, że tę metodę można uogólnić w celu ilościowej analizy lokalizacji jądrowej i cytoplazmatycznej innych białek wirusowych lub komórkowych bez angażowania technologii obrazowania na żywo.

Aby zrozumieć podstawy molekularne i funkcje biologiczne transportu ICP0 podczas infekcji HSV-1, stosujemy metodę mikroskopii immunofluorescencyjnej w celu analizy rozmieszczenia wewnątrzkomórkowego ICP0 w różnych fazach infekcji. Rysunek 1 przedstawia reprezentatywne komórki z charakterystyczną lokalizacją ICP0 w miarę postępu infekcji. Aby ilościowo określić translokację ICP0 z jądra do cytoplazmy, analizujemy rozmieszczenie ICP0 względem jądra, kategoryzuj...

ICP0 ulega translokacji jądrowej do cytoplazmatycznej podczas infekcji HSV-1. Mechanizm molekularny tego zdarzenia nie jest znany. W tym miejscu opisujemy zastosowanie mikroskopu konfokalnego jako narzędzia do ilościowego określania ruchu ICP0 w zakażeniu HSV-1, co stanowi podstawę do ilościowej analizy translokacji ICP0 w przyszłych badaniach mechanistycznych.

Analiza czasowa translokacji jądrowej do cytoplazmatycznej białka wirusa opryszczki pospolitej 1 za pomocą immunofluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie transportu białek dotyczące translokacji jądrowej i cytoplazmatycznej w systemie, w którym obrazowanie światłem nie jest dostępne. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją zastosować jako ogólny protokół do badania skroniowego ruchu białek bez konieczności obrazowania światłem. 20 do 24 godzin przed infekcją wirusową wysiewa się 5 razy 10 do 4 ludzkich embrionalnych komórek blastycznych płuc lub włókien HEL na studzienkę na czterodołkowym 11-milimetrowym szkiełku schodkowym i pożywce wzrostowej do nocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla.Ważne jest, aby dokładnie kołysać szkiełkiem, aby zapewnić równomierne rozłożenie komórek, jednocześnie uważając, aby nie rozlać pożywki hodowlanej. Następnego dnia zastąp supernatanty tak, aby 70 do 80 procent zlewających się kultur było zlewające się z podłożem 199, zawierającym 410 jednostek tworzących płytki nazębne na komórkę, i umieść szkiełko w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając, na jedną godzinę. Pod koniec inkubacji zastąpić supernatanty świeżą pożywką wzrostową i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze na odpowiedni okres eksperymentalnego zakażenia.W celu barwienia immunofluorescencyjnego komórek zakażonych wirusem, należy szybko przemyć komórki trzykrotnie PBS. Następnie następuje ośmio- do dziesięciominutowa inkubacja w 200 mikrolitrach czteroprocentowego paraformaldehydu w PBS na studzienkę. Pod koniec utrwalania umyj komórki trzykrotnie 200 mikrolitrami PBS na pranie i przepuszczaj komórki 100 mikrolitrami 0,2% niejonowego środka powierzchniowo czynnego na studzienkę przez pięć do dziesięciu minut.Przemyć permeabilizowane komórki trzykrotnie w PBS, jak pokazano, i dodać 200 mikrolitrów buforu blokującego do każdej studzienki na jedną godzinę inkubacji w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj odpowiednie stężenie głównego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania do każdej studzienki w celu dwugodzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji usunąć wszelkie niezwiązane przeciwciała pierwszorzędowe za pomocą trzech dziesięciominutowych płukań w świeżym buforze blokującym i dodać odpowiednie przeciwciało drugorzędowe do każdej studzienki na jednogodzinną inkubację w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.Pod koniec inkubacji przemyć komórki trzy razy w buforze blokującym, jak pokazano, a następnie przepłukać je jednym roztworem PBS i dodać do każdej studzienki jedną kroplę pożywki montażowej zapobiegającej blaknięciu uzupełnionej DAPI. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku i uszczelnij nachylenie pokrywy przezroczystym lakierem do paznokci. Delikatny nacisk podczas montażu szkiełka nakrywkowego usunie nadmiar medium mocującego, pomagając w zapewnieniu uzyskania wysokiej jakości obrazów.Do obrazowania konfokalnego znakowanych, zakażonych komórek wybierz odpowiednie przeciwciało drugorzędowe i długości fal DAPI, a następnie ustaw format obrazu na 1 024 na 1 024 piksele ze średnią linią ośmiu. Następnie zobrazuj każdą studzienkę na szkiełku czterodołkowym pod obiektywem 100x. Aby zliczyć dużą liczbę komórek, uzyskaj od pięciu do dziesięciu obrazów z kolejnych pól w tej samej studni pod obiektywem 40x.Aby przeanalizować rozkład jądrowy i cytoplazmatyczny ICP0, otwórz projekt w oprogramowaniu konfokalnym i wybierz obraz. Otwórz kartę Ilość i wybierz polecenie Sortuj obszary zainteresowania z menu Narzędzia. Wybierz opcję Rysuj linię i narysuj linię podłużną w poprzek komórki, która ma być analizowana.Pojawi się histogram pokazujący intensywność fluorescencji wzdłuż linii zarówno dla interesującego białka, jak i DAPI. Na podstawie barwienia tła ustal stały próg intensywności białka będącego przedmiotem zainteresowania dla analizy subkomórkowej dystrybucji białka w każdym eksperymencie. Jeśli sygnał białkowy jest średnio poniżej progu w regionie jądrowym, ale jest powyżej progu poza granicą DAPI, sklasyfikuj sygnał białkowy jako zlokalizowany głównie w cytoplazmie.Jeśli sygnał białkowy znajduje się powyżej progu w całym jądrze i poza granicą sygnału DAPI, pogrupuj sygnał białkowy jako jądro plus lokalizacja cytoplazmatyczna. Jeśli sygnał białkowy znajduje się powyżej progu w jądrze, ale średnio jest poniżej progu poza granicą grupy sygnałowej DAPI, białko sygnalizuje jako lokalizację jądrową. Na koniec należy zestawić w tabeli ponad 200 zainfekowanych komórek z każdej próbki w różnych punktach czasowych infekcji i nanieść dane na wykres słupkowy, aby zilustrować ruch białka będącego przedmiotem zainteresowania w czasie.Jak wykazano, metoda ta ułatwia analizę translokacji białek będących przedmiotem zainteresowania z jądra do cytoplazmy. Na przykład zakażone białko komórkowe zero lub dystrybucja subkomórkowa ICP0 zmienia się wraz z postępem infekcji wirusowej. Aby zrozumieć elementy wymagane do transportu ICP0 podczas infekcji, ruchy ICP0 można śledzić w komórkach zakażonych wirusem opryszczki pospolitej typu dzikiego i zmutowanego typu 1 w różnych fazach infekcji, co pozwala na ocenę subkomórkowej dystrybucji ICP0 w różnych punktach czasowych infekcji.Ważne jest, aby pamiętać o stosowaniu kultur jednowarstwowych, aby wiriony miały równy dostęp do komórek i normalizować wielość infekcji zgodnie z nazwą wirusa, tak aby postęp infekcji był porównywalny między wirusami i w ich obrębie. Po każdym opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny biologii i wirusologii komórkowej do badania ruchu białek poprzez badanie czasowych lokalizacji subkomórkowych białek będących przedmiotem zainteresowania w populacji komórek.

temporal-analysis-nuclear-to-cytoplasmic-translocation-herpes-simplex

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejszy eksperyment w formie wizualizacji jest przewodnikiem po wykorzystaniu fluorescencyjnego klonu molekularnego HIV do eksperymentów z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek.

Wizualizacja transferu HIV między komórkami z wykorzystaniem fluorescencyjnych klonów HIV oraz konfokalnej mikroskopii żywych komórek

Protokół opisuje wydajny i powtarzalny system modelowy do badania latencji i reaktywacji wirusa prostego opryszczki typu 1 (HSV-1). Test wykorzystuje homogeniczne kultury neuronów współczulnych i umożliwia molekularną analizę oddziaływań wirus-neuron przy użyciu różnych narzędzi, w tym interferencji RNA oraz ekspresji białek rekombinowanych.

System hodowli pierwotnych neuronów do badania latencji i reaktywacji wirusa opryszczki zwykłej

Ten film demonstruje metodę monitorowania zakażonego białka komórkowego 0, ICP0 w zakażeniu wirusem opryszczki pospolitej-1. Po syntezie de novo ICP0 przemieszcza się do jądra, a następnie przemieszcza się do cytoplazmy podczas progresji infekcji. Mikroskopia immunofluorescencyjna ujawnia i analizuje subkomórkową lokalizację białka, oferując wgląd w jego transport w różnych fazach infekcji.

Technika immunofluorescencji lokalizacji białek wirusowych w zakażonych komórkach

Obrazowanie żywych komórek zakażeń wirusem opryszczki umożliwia analizę dynamicznych zdarzeń transportu kierowanego i rozprzestrzeniania się międzykomórkowego. W tym miejscu przedstawiamy metodologie, które wykorzystują rekombinowane szczepy wirusa eksprymujące fluorescencyjne białka fuzyjne, aby ułatwić wizualizację zespołów wirusowych podczas infekcji neuronów pierwotnych.

Obrazowanie żywych komórek transportu i rozprzestrzeniania się wirusa alfaopryszczki

Ustaliliśmy protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania trwałego genomu wirusa DNA w sekcjach tkanek modeli zwierzęcych. Protokół ten umożliwia badanie procesu infekcji poprzez kodetekcję genomu wirusa, jego produktów RNA oraz białek wirusowych lub komórkowych w obrębie pojedynczych komórek.

Wykrywanie genomu i transkryptów przetrwałego wirusa DNA w tkankach neuronalnych za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ połączonej z barwieniem immunologicznym

Skóra jest jednym z celów ludzkiego patogenu wirusa opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1). Aby zbadać drogę inwazji HSV-1 do tkanki, ustaliliśmy model infekcji ex vivo mysich arkuszy naskórka, które reprezentują najbardziej zewnętrzną warstwę skóry.

Ex vivo Zakażenie mysiego naskórka wirusem opryszczki pospolitej typu 1

Celem tego protokołu jest specyficzne oznaczanie i selektywne izolowanie wirusowego DNA z zakażonych komórek w celu scharakteryzowania białek związanych z genomem wirusa.

Oczyszczanie DNA wirusa w celu identyfikacji powiązanych białek wirusowych i komórkowych

Fabryki transkrypcji wirusa to odrębne struktury, które są wzbogacone o komórkową polimerazę RNA II w celu zwiększenia transkrypcji genów wirusa podczas reaktywacji. W tym miejscu opisano metodę lokalizacji miejsc aktywnej transkrypcji chromatyny wirusowej w przestrzeni jądrowej 3D poprzez połączenie barwienia immunofluorescencyjnego i hybrydyzacji RNA in situ.

Obrazowanie funkcjonalne fabryk transkrypcji wirusów przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej 3D

Opisujemy protokół wykorzystujący fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH) do wizualizacji wielu herpeswirusowych RNA w litycznych infekowanych komórkach ludzkich, zarówno w zawiesinie, jak i w adherentach. Protokół ten obejmuje kwantyfikację fluorescencji wytwarzającą stosunek nukleocytoplazmatyczny i może być rozszerzony o jednoczesną wizualizację białek gospodarza i wirusa za pomocą immunofluorescencji (IF).

Ilościowa fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) i immunofluorescencja (IF) specyficznych produktów genowych w komórkach zakażonych KSHV

Prezentowany tutaj jest protokół dla metody obrazowania fluorescencyjnego, multiplex immunofluorescencyjna metodawykrywania DNA, RNA i proteiny (MICDDRP), metoda zdolna do jednoczesnej fluorescencyjnej wizualizacji pojedynczych komórek białka wirusowego i kwasów nukleinowych o różnym typie i nici. Takie podejście można zastosować do różnych systemów.

Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy

Wzmocnienie sygnału tyramidu podczas barwienia immunofluorescencyjnego umożliwia czułe wykrywanie fosforylowanych RIPK3 i MLKL podczas nekroptozy wywołanej przez ZBP1 po zakażeniu HSV-1.

Wzmocnienie sygnału tyramidu do barwienia immunofluorescencyjnego zależnej od ZBP1 fosforylacji RIPK3 i MLKL po zakażeniu HSV-1 w komórkach ludzkich

Poznaj metodę analizy translokacji jądrowo-cytoplazmatycznej białka ICP0 wirusa HSV-1 za pomocą mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia ilościowe badanie dynamiki białek w komórkach zakażonych.

Analiza czasowa translokacji jądrowej do cytoplazmatycznej białka wirusa opryszczki pospolitej 1 za pomocą immunofluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej (Wideo) | JoVE Journal

Analiza czasowa translokacji jądrowej do cytoplazmatycznej białka wirusa opryszczki pospolitej 1 za pomocą immunofluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej

Przeglądaj więcej filmów