Wizualizacja aktywności kinazy białkowej A u myszy przy użyciu mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej

Przymocuj znieczuloną mysz z oknem czaszkowym nad jej korą ruchową na bieżni.

Mysz wykazuje ekspresję reportera kinazy białkowej A w neuronach korowych.

Umieść bieżnię pod dwufotonowym obiektywem FLIM.

Dodaj kroplę wody między obiektywem a oknem czaszki.

Pozwól myszy się obudzić i zaaklimatyzować na bieżni.

Korzystając z oświetlenia w jasnym polu, zlokalizuj obszar obrazowania. Zamknij obudowę mikroskopu, aby zablokować światło zewnętrzne.

Ustaw parametry obrazowania, zainicjuj obrót bieżni w celu wywołania lokomocji i rozpocznij obrazowanie.

Wymuszona lokomocja aktywuje PKA, który fosforyluje reportera, zbliżając do siebie fluorofory dawcy i akceptora.

Mikroskop kieruje laserem na podczerwień, pobudzając dawcę do przekazania energii do akceptora, skracając czas życia fluorescencji dawcy.

Kiedy lokomocja ustaje, PKA i reporter wracają do swoich stanów nieaktywnych, zmniejszając transfer energii i wydłużając czas życia fluorescencji dawcy.

Przeanalizuj obrazy, aby porównać poziomy PKA w korze mózgowej podczas odpoczynku i lokomocji.

Co najmniej dwa tygodnie po zainstalowaniu okna czaszkowego ustaw długość fali lasera wzbudzenia dwufotonowego na 960 nanometrów i potwierdź brak reakcji na szczypanie palców u znieczulonej myszy eksperymentalnej. Umieść znieczuloną mysz na zmotoryzowanej bieżni i zamontuj płytę czołową myszy do uchwytu płyty głowicy zestawu bieżni. Oczyść powierzchnię szkiełka nakrywkowego z szybą czaszki 70% etanolem i umieść zmotoryzowaną bieżnię pod obiektywem 2pFLIM.

Nałóż kroplę wody destylowanej między szkiełko nakrywkowe czaszki w obiektywie i pozwól myszy obudzić się i zaaklimatyzować w środowisku bieżni i mikroskopu przez co najmniej 10 minut. Przejdź do miejsca wstrzyknięcia w epi-illumination i udokumentuj cechy odniesienia w jasnym polu, aby pomóc w obrazowaniu tego samego obszaru zainteresowania podczas kolejnych sesji obrazowania.

Wyłącz źródło światła epi-illumination. Zamknij obudowę statywu mikroskopowego 2pFLIM. Aby aktywować lampy fotopowielacza mikroskopu 2pFLIM, włącz sprzętowe sterowanie napięciem sterującym. Aby uzyskać obraz Z-stack 2pFLIM, ustaw rozmiar obrazu na 128 na 128 pikseli. Prędkość skanowania do 2 milisekund na linię, pole widzenia do 90 do 100 mikrometrów w kadrze, średnio do trzech klatek.

Dostosuj ustawienia obrazowania w zależności od przygotowania i konfiguracji sprzętowej. I sprawdź uzyskany obraz w widoku FLIM. Użyj zmniejszonego pola widzenia, zmniejszonej prędkości skanowania, zwiększonej mocy lasera i zwiększonej liczby klatek do uśrednienia, aby zwiększyć liczbę zintegrowanych fotonów i w razie potrzeby zmniejszyć błąd oszacowania czasu życia.

Upewnij się, że uzyskałeś wystarczającą liczbę fotonów na obszar zainteresowania. Wykonalna zintegrowana liczba zdjęć dla pozytywnej somy w polu widzenia wynosi około 1000 do 10 000 fotonów.

Gdy obraz zostanie zoptymalizowany, uzyskuj podstawowe powtarzające się obrazy stosu Z w regularnych odstępach czasu przez co najmniej 15 minut z prędkością 0 na bieżni. Następnie ustaw obroty bieżni na około centymetry na sekundę przez 15 minut podczas pozyskiwania obrazów 2pFLIM, a następnie co najmniej 20 minut akwizycji obrazu po wyłączeniu rotacji bieżni, aby ocenić czas trwania aktywności kinazy białkowej A po ustaniu wymuszonej lokomocji.

W celu analizy obrazu 2pFLIM otwórz obrazy w widoku filmu i kliknij pola minimalnego i maksymalnego zakresu zliczania pojedynczych fotonów, aby wprowadzić odpowiednie wartości minimalnego i maksymalnego zakresu zliczania pojedynczych fotonów. Kliknij pole wartości czasu 0, aby wprowadzić wartość czasu 0, a następnie kliknij pole minimalnej wartości progowej luminancji w całym okresie użytkowania, aby wprowadzić żądaną wartość progową z zakresu od 5 do 30 fotonów.

Kliknij przycisk Nowa grupa i przypisz nazwę grupy eksperymentu, aby wygenerować grupę, która łączy dane z każdego dodanego obrazu FLIM. Kliknij opcję Region of Interest (Obszar zainteresowania) w module kontrolnym regionu zainteresowania i narysuj obszar zainteresowania wokół t-ACCR alfa-dodatniej somy. Przesuń dolny i górny limit Z na suwakach sterujących stosem Z, aby zmniejszyć zakres stosu Z i zminimalizować zanieczyszczenie sygnału pochodzącego z fotonów tła i innych spadków Z, a następnie kliknij przycisk Plus, aby dodać obraz FLIM do grupy.

Kliknij przycisk calc, aby obliczyć średni czas życia w błędzie oszacowania okresu istnienia dla obszaru zainteresowania i otwórz następny plik z serii obrazowania 2pFLIM. Mierz tę samą alfa-dodatnią somę T-ACCR na każdym kolejnym obrazie w czasie, dostosowując w razie potrzeby obszar zainteresowania wokół somy. Po przeanalizowaniu wszystkich obrazów wybierz średni czas emisji fotonów delta średnia fotoemisja delta T0 w module kontroli grupy i kliknij pole numeru linii bazowej, aby wprowadzić indeks dla interesujących obrazów w celu zdefiniowania obrazów używanych do obliczenia czasu życia linii bazowej.

Następnie kliknij wykres, aby wygenerować wykres zawierający odpowiedź FLIM na aktywność alfa-dodatnią T-ACCR podczas eksperymentu w zdefiniowanych obszarach zainteresowania, aby umożliwić porównanie aktywności kinazy białkowej A podczas lokomocji kinazy w różnych regionach zainteresowania.