Obrazowanie czasu życia fluorescencji agregacji białka PolyQ w neuronach Caenorhabditis elegans

Zacznij od znieczulonych, dopasowanych do wieku robaków kontrolnych i opiekuńczych z niedoborem Caenorhabditis elegans. Obie

grupy wyrażają znakowane fluoroforem białka polyQ w swoich neuronach, które są podatne na nieprawidłowe fałdowanie.

U robaków kontrolnych białka opiekuńcze ograniczają nieprawidłowo sfałdowaną agregację polyQ, podczas gdy u robaków z niedoborem białka opiekuńczego nieprawidłowo sfałdowany polyQ łatwo tworzy agregaty.

Umieść szkiełko kontrolne na stoliku mikroskopu konfokalnego do mikroskopii obrazowania fluorescencji (FLIM).

Oświetl robaki za pomocą lasera impulsowego.

Laser wzbudza fluorofor, który emituje foton, gdy powraca do stanu podstawowego.

FLIM mierzy czas życia fluorescencji - czas, przez jaki fluorofor pozostaje w stanie wzbudzonym.

U robaków z niedoborem białka opiekuńczego agregacja polyQ grupuje fluorofory, promując transfer energii między sąsiednimi fluoroforami zamiast emisji fotonów, skracając w ten sposób czas życia fluorescencji.

Oprogramowanie FLIM przetwarza te okresy życia w celu wygenerowania map oznaczonych kolorami, umożliwiając wizualizację agregacji.

Skrócony czas życia fluorescencji u robaków z niedoborem białka opiekuńczego, w porównaniu z kontrolami, wskazuje na zwiększoną agregację polyQ.

Upewnij się, że nicienie są całkowicie nieruchome. Otwórz oprogramowanie do akwizycji FLIM. Znajdź przycisk Tab i naciśnij Włącz wyjścia. Umieść szkiełko z zamontowanymi C. elegans na stoliku i za pomocą soczewki o 10-krotnym powiększeniu w trybie transmisyjnym zlokalizuj położenie nicieni na szkiełku. Zdejmij szkiełko, zmień obiektyw na soczewkę o 63-krotnym powiększeniu i nałóż wymagane medium zanurzeniowe.

Umieść szkiełko na scenie i zlokalizuj nicienie. Rozpocznij skanowanie próbki. Wybierz obszar zainteresowania i skoncentruj się na jego maksymalnej płaszczyźnie rzutowania. W interfejsie oprogramowania FLIM wyświetl podgląd liczby wykrytych fotonów. Wartość ADC powinna wynosić od 1 razy 10 do czwartej i 1 razy 10 do piątej. W razie potrzeby przenieś ostrość na inną płaszczyznę lub zwiększ moc lasera, aby zebrać więcej fotonów.

- Upewnij się, że unikasz gromadzenia się fotonów, ale zbierz wystarczającą ilość fotonów, aby uzyskać dobre dopasowanie i pomiar w całym okresie użytkowania.

- Na pasku menu wybierz zakładkę, aby ustawić parametry pozyskiwania. Wybierz opcję Scan Sync In (Skanuj synchronizację w), aby zezwolić na wykrywanie pojedynczych fotonów. Ustaw akwizycję na określony czas lub ustaloną liczbę fotonów. Naciśnij Start, aby rozpocząć pobieranie. Otwórz oprogramowanie i zaimportuj pliki danych FLIM za pomocą opcji Plik, Załaduj dane FLIM. Załaduj wszystkie próbki z jednego warunku, nawet jeśli zostały uzyskane w różnych sesjach i z różnych powtórzeń biologicznych.

W razie potrzeby podziel na segmenty pojedyncze nicienie dla wielu obrazów FLIM za pomocą Segmentacji, Menedżera Segmentacji. Przeciągnij narzędzie do przycinania wokół obszaru zainteresowania, aż zostanie podświetlone. Po zakończeniu naciśnij OK. Wybierz mały obszar, w którym pojawia się obraz C. elegans oparty na intensywności. Krzywa zaniku tego obszaru pojawia się w dużym oknie zaniku po prawej stronie interfejsu.

Aby ekstrapolować okres istnienia na karcie Dane, ustaw dowolną zintegrowaną wartość minimalną z zakresu od 40 do 300, aby wykluczyć wszystkie piksele, które są zbyt ciemne, aby uzyskać dobre dopasowanie. Wybierz minimalną i maksymalną liczbę czasu, aby ograniczyć sygnał FLIM do tych wartości. Nie zmieniaj wstępnie ustawionego fotonu zliczającego jeden. Wprowadź częstotliwość powtarzania w megahercach lasera używanego podczas akwizycji.

Wprowadź maksymalną wartość bramki, aby wykluczyć wszystkie nasycone piksele. Na karcie Okres istnienia wybierz łącznik globalny, który ma zostać użyty. Nie zmieniaj żadnego innego parametru poza liczbą wyboru wykładniczego, jeśli wiadomo, że wybrany rozpad fluorescencji jest wielowykładniczy i wykazuje więcej niż jeden czas życia.

Prześlij plik IRF za pomocą menu IRF. Aby oszacować przesunięcie IRF, wybierz IRF, Szacowanie, Przesunięcie IRF. Zestaw wartości zostanie automatycznie wyświetlony na karcie IRF. Po ustaleniu tego nie zmieniaj żadnych innych parametrów tej zakładki. Po ustawieniu wszystkich parametrów naciśnij przycisk Dopasuj zestaw danych. Wynikowe dopasowanie zaznaczone niebieską linią powinno nakładać się na wszystkie zdarzenia. Dobre dopasowanie uzyskuje się, gdy wszystkie zdarzenia są wyrównane wzdłuż dopasowania.

Kliknij kartę Parametry znajdującą się w prawym górnym menu interfejsu oprogramowania i wybierz statystykę, średnią ważoną i sprawdź, czy wartość chi-kwadrat jest jak najbardziej zbliżona do jednego. Wartość w czasie życia wybranego obrazu jest zatem ujawniana jako tau 1. Eksportuj dowolne interesujące Cię informacje za pomocą Pliku, Eksportuj obrazy intensywności, Tabelę wyników dopasowania, Obrazy, Histogramy.