JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:23 min. • June 17th, 2025
Weź splot naczyniówkowy z mózgu myszy w koszu na próbki.
Tkanka, znajdująca się w komorach mózgu, zawiera warstwę komórek nabłonkowych z mikrokosmkami na ich wierzchołkowej powierzchni.
Inkubuj tkankę w roztworze utrwalającym, aby zachować jej architekturę komórkową.
Przemyć buforem, aby usunąć nadmiar utrwalacza i ustabilizować pH.
Inkubuj tkankę z tetratlenkiem osmu, który wiąże się z lipidami błony komórkowej, zachowując stabilność błony, a następnie spłucz nadmiar odczynnika.
Odwodnić tkankę za pomocą zwiększającego się stężenia alkoholu, aby zapobiec zniekształceniu tkanek podczas obrazowania.
Wysusz chusteczkę, przymocuj ją do uchwytu próbki pokrytego węglem, a następnie pokryj ją przewodzącą warstwą platyny.
Za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej skoncentruj wiązkę elektronów na powierzchni. Warstwa platyny rozprasza elektrony, zapobiegając gromadzeniu się ładunku i minimalizując artefakty obrazowania.
Detektor wychwytuje elektrony rozpraszane wstecznie z powierzchni, tworząc obraz tkanki wykazującej komórki nabłonkowe z mikrokosmkami.
Aby przygotować próbkę do SEM, przenieś świeżo wyizolowany splot naczyniówkowy do świeżo przygotowanego roztworu utrwalającego i inkubuj przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po zakończeniu przemyj próbkę trzykrotnie, używając od 3 do 5 mililitrów 0,1-molowego buforu kakodylanu sodu przez pięć minut każdy.
Po utrwaleniu próbek w 3 do 5 mililitrach 2% tetratlenku osmu w 0,1-molowym buforze kakodylanu sodu przez 30 minut. Następnie umyj próbki trzy razy przez pięć minut każda, używając od 3 do 5 mililitrów ultraczystej wody. Następnie odwodnić próbki w rosnącej serii lodowatych stężeń alkoholu etylowego w ciągu 15 minut na roztwór alkoholu etylowego. Użyj osuszacza w punkcie krytycznym, aby prawidłowo wysuszyć próbkę. Ostrożnie umieść próbkę na mocowaniu próbki za pomocą naklejki węglowej i wizualizuj próbki splotu naczyniówkowego za pomocą SEM.