Przewlekłe obrazowanie kory wzrokowej myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką

Kolce dendrytyczne to wypukłości błony z dendrytu neuronu, które otrzymują dane synaptyczne. Wydłużanie, kurczenie się lub zanikanie kolców następuje w odpowiedzi na zmiany w funkcjonowaniu sieci neuronowych, które wynikają ze specyficznych wzorców aktywności neuronalnej. Zjawisko to jest znane jako plastyczność korowa w celu obserwacji zmian morfologicznych w kolcach dendrytycznych.

U żywych zwierząt płytkę obrazową umieszcza się na czaszce myszy. Obszar czaszki jest chirurgicznie przerzedzony i wymagane są obrazy w małym i dużym powiększeniu. Obszary są następnie ponownie obrazowane w późniejszych punktach czasowych.

Uzyskane wyniki pokazują, że morfologię kolców dendrytycznych można wyraźnie zobrazować za pomocą cienkiego preparatu czaszki w wielu punktach czasowych. A ta morfologia kręgosłupa jest bardzo plastyczna, pokazując zmiany w strukturze, a także pojawianie się i zanikanie kolców dendrytycznych. Cześć, nazywam się Emily Kelly i pracuję w laboratorium Anayi Maka na Wydziale Neurobiologii i Anatomii Uniwersytetu w Rochester.

Dzisiaj pokażemy Ci procedurę przewlekłego obrazowania kory fiolki myszy po płetwach zwanych preparatem. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania dendrytycznych obrotów kręgosłupa. Więc zacznijmy.

Zabieg należy rozpocząć od wysterylizowania narzędzi do chirurgii aseptycznej. Następnie wysterylizuj miejsce pracy przy użyciu 70% etanolu i przykryj powierzchnię roboczą czystym opatrunkiem. Monitoruj głębokość znieczulenia u myszy znieczulonej koktajlem fentanylu, testując jej reakcję na uszczypnięcie palca u nogi, pokazana tutaj mysz to transgeniczna mysz A-G-F-P-M, w której wyraża się GFP.

W warstwie piątej komórki parametaliczne, które rzutują procesy dendrytyczne na warstwy powierzchowne. Aby utrzymać temperaturę ciała 37,5 stopnia Celsjusza, połóż zwierzę na kocu grzewczym i monitoruj je za pomocą dołączonego termometru doodbytniczego. Następnie nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec ich wysuszeniu za pomocą nożyczek.

Usuń włosy z tyłu głowy myszy zza uszu do oczu. Następnie oczyść czubek głowy zwierzęcia za pomocą aplikacji 70% etanolu, a następnie użyj peelingu Betadine i roztworu Betadine. Wykonaj nacięcie LCU za uszami i w górę wzdłuż prawej lub lewej strony linii środkowej, w zależności od tego, która półkula zostanie zobrazowana dla oczu, zawiń skórę nad i od miejsca operacji.

Nie usuwaj skóry, ponieważ zostanie ona później zszyta za pomocą cienkich kleszczy. Delikatnie pociągnij skórę do góry i odsuń ją od obszaru zainteresowania. Za pomocą czystych kleszczy delikatnie zeskrob okostną z odsłoniętego obszaru czaszki.

Nałóż niewielką ilość 10% jasnego chlorku na czaszkę, aby całkowicie wysuszyć błonę okostnej i upewnić się, że została całkowicie usunięta. Ważne jest, aby czaszka była całkowicie sucha. Aby zapewnić prawidłowe przyleganie kleju, delikatnie zeskrob wysuszoną błonę okostnej za pomocą ostrza mikrochirurgicznego.

Następnie nałóż cienką warstwę kleju akrylowego Sano wokół okienka obrazowania płyty głowicy ze stali nierdzewnej i przymocuj płytkę do czaszki. Drewnianym końcem bawełnianego patyczka do wacików nałóż klej na wewnętrzne szwy okienka obrazowego, upewniając się, że wypełniłeś wszystkie szczeliny między płytką obrazową a krzywizną czaszki. Umieść kroplę akceleratora kleju w oknie.

Następnie szybko zetrzyj nadmiar. Pozostaw klej do wyschnięcia, gdy klej całkowicie wyschnie. Za pomocą wiertła dentystycznego z przymocowanym zadziorem ze stali nierdzewnej o średnicy 0,7 milimetra zacznij rozrzedzać czaszkę w okienku obrazowania.

Naprzemienne wiercenie z okazjonalnym stosowaniem 0,9% sterylnego roztworu soli fizjologicznej. Aby uniknąć generowania zbyt dużej ilości ciepła na czaszce. Rozcieńczyć okienko o wymiarach cztery na cztery milimetry na czaszce, wykonując małe pociągnięcia po powierzchni czaszki.

Z wiertłem dentystycznym. Przetestuj cienkość czaszki za pomocą kleszczy o końcach. Powierzchnia czaszki lekko się wgnieci przy delikatnym nacisku.

Optymalna grubość czaszki do obrazowania wynosi od 10 do 30 mikronów. Po rozrzedzeniu czaszki oczyść okno ze wszystkich zanieczyszczeń i posmaruj czaszkę solą fizjologiczną. Sfotografuj okno obrazowania za pomocą aparatu cyfrowego zamontowanego na lunecie sekcyjnej.

Układ naczyniowy mózgu na tym zdjęciu pomoże w zlokalizowaniu pozycji, w której należy umieścić płytkę obrazową podczas kolejnych sesji obrazowania. Przetransportuj zwierzę na zestaw z dwoma fotonami. Zwierzę powinno pozostać na kocu grzewczym, a temperatura ciała powinna być stale monitorowana przez cały czas trwania sesji obrazowania.

Mikroskop dwufotonowy z laserem mi tai. Zastosowano pompę półprzewodnikową o mocy 10 W zapewniającą maksymalną moc oraz zmodyfikowaną jednostkę konfokalną Olympus z widokiem przepływu. System jest zoptymalizowany pod kątem głębokiego obrazowania tkanek, a zewnętrzne detektory są instalowane jak najbliżej obiektywu, aby umożliwić maksymalne wykrycie fluorescencji z mózgu, dodanie kropli soli fizjologicznej do okienka obrazowania za pomocą niskiego zoomu cyfrowego.

Zidentyfikuj obszar zawierający jaskrawo oznaczone neurony za pomocą kamery cyfrowej przymocowanej do mikroskopu. Ips, zrób zdjęcie obszaru obrazowania. Jest to konieczne, aby powrócić do tej samej lokalizacji obrazowania w kolejnym punkcie czasowym.

Uzyskaj stos o małym powiększeniu przez cały widoczny obszar mózgu, pokazując zakres rozgałęzień dendrytycznych. Zostanie to wykorzystane do zlokalizowania obszaru obrazowania w kolejnych punktach czasowych zarówno jako naczynia krwionośne, jak i dendryty. Utrzymuj ich strukturę u młodych i dorosłych zwierząt za pomocą oprogramowania do obrazowania.

Zwiększ powiększenie cyfrowe ośmiokrotnie, w razie potrzeby dostosuj współrzędne XY i zbierz stos o dużym powiększeniu, który pokaże szczegółową morfologię dendrytyczną, w tym lokalizacje i strukturę kolców dendrytycznych. Rób szczegółowe notatki dotyczące każdej kolekcji stosu, w tym współrzędnych panoramy, zakresu kolekcji, rozmiaru kroku Z i liczby kroków w stosie. Nuty te zostaną użyte podczas powrotu do tego dendri lub aksonu w kolejnym punkcie czasowym.

Po wykonaniu badania obrazowego należy zdjąć płytkę głowy, delikatnie oddzielając ją od powierzchni czaszki. Za pomocą kleszczy. Usuń resztki kleju i przetrzyj czaszkę 0,9% sterylnym roztworem soli fizjologicznej.

Zszyj skórę nad czaszką za pomocą nici do szwów numer sześć. Przetrzyj obszar 70% etanolem zgodnie z procedurą obrazowania. Umieść zwierzę w czystej klatce pod lampą grzewczą, aż się obudzi i będzie mobilne.

Następnie zwróć zwierzę do jego pierwotnej klatki, aby ponownie zobrazować zwierzę w późniejszym czasie, w dowolnym miejscu od dwóch dni do wielu miesięcy później, usuń szwy i ponownie otwórz skórę na głowie. Stosując metody aseptyczne, należy wykorzystać cyfrowy obraz układu naczyniowego mózgu wykonany podczas pierwszej operacji, aby zlokalizować pierwotną lokalizację obrazowania. Następnie ponownie zamocuj płytę głowicy tak jak poprzednio.

Użyj ostrza mikrochirurgicznego, aby delikatnie rozrzedzić kość, która mogła odrosnąć między punktami czasowymi obrazowania, jeśli to konieczne. Rozcieńczyć wiertłem dentystycznym, oczyść okienko obrazowania z zanieczyszczeń i nałóż kroplę 0,9% sterylnego roztworu soli fizjologicznej. Przenieś zwierzę do mikroskopu dwufotonowego i zlokalizuj oryginalny obszar obrazowania za pomocą cyfrowego obrazu fluorescencyjnego wykonanego podczas poprzedniej sesji.

Uruchom program widoku przepływu. Otwórz oryginalny obraz w małym powiększeniu, przyklej arkusz przezroczystości do ekranu komputera i naszkicuj główny wzór naczyń krwionośnych za pomocą pisaka przezroczystego. Następnie otwórz obraz na żywo i wyrównaj układ krwionośny do naszkicowanego wzoru na przezroczystej folii.

Usuń przezroczystość, aby ponownie wyświetlić ośmiokrotnie powiększone struktury. Otwórz żądany pobrany stos z poprzedniej sesji obrazowania. Naszkicuj strukturę na przezroczystej folii przymocowanej do ekranu komputera.

Powiększ obraz ośmiokrotnie od obrazu na żywo i wyrównaj obraz z przezroczystością. W zależności od dokładności wyrównania miejsca małego powiększenia, może być konieczne również nieznaczne dostosowanie kąta obrazu i ustawienie współrzędnych panoramy na parametry obrazowania pierwszego dnia, w tym rozmiar kroku i liczbę zbieranych obrazów, ponowne obrazowanie Zacka można wykonać dwukrotnie. Liczba otwarć skóry głowy powinna być ograniczona, aby uniknąć naruszenia integralności czaszki, co spowoduje słabą rozdzielczość obrazowania u myszy z ekspresją GFPM.

Podzbiór komórek parametalicznych warstwy piątej i odpowiadających im procesów dendrytycznych zwizualizowano za pomocą dwufotonowej laserowej mikroskopii skaningowej in vivo, pokazano dendryty kory wzrokowej oznaczone GFP. Obraz ten jest projekcją pojedynczego obrazu uzyskiwanego co pięć mikronów z PIA do końcowej głębokości 175 mikronów. Obszar pudełkowy jest pokazany w większym powiększeniu tutaj w dniu zero, i ponownie w czwartym dniu tutaj, w większym powiększeniu obrazu gałęzi dendrytycznej z dnia zero i dnia czwartego porównano.

Obrazy te pokazują stabilne kolce oznaczone białymi grotami strzałek, utracone cofające się kolce, które są oznaczone czerwonym grotem strzały i nowe kolce oznaczone zielonym grotem strzałki. Właśnie pokazaliśmy, jak wykonać przewlekłe obrazowanie dwufotonowe w korze wzrokowej myszy przy użyciu cienkiego preparatu czaszki. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu szczególnej ostrożności podczas procesu przerzedzania, aby uniknąć uszkodzenia czaszki i leżącej pod nią opony twardej, ponieważ spowoduje to słabą rozdzielczość obrazowania i robienie szczegółowych notatek.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.