Name: Przewlekłe obrazowanie kory wzrokowej myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-25T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Poznaj metodę przewlekłego obrazowania kory wzrokowej myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką. Technika ta umożliwia obserwację dynamiki kolców dendrytycznych w żywych zwierzętach i badanie plastyczności kory mózgowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez Burroughs Wellcome Career Award in the Biomedical Sciences (A.K.M), The Whitehall Foundation Research Grant (A.K.M), Sloan Foundation Fellowship (A.K.M), NIH EY019277 (A.K.M) oraz finansowany przez NEI Vision Training Grant, EY013319 (E.A.K.).

<ol>
 <li>Aby zwizualizować neurony w nienaruszonym mózgu przy użyciu mikroskopii dwufotonowej, stosuje się preparat, w którym neurony są znakowane markerami fluorescencyjnymi. W prezentowanych tutaj eksperymentach wykorzystujemy transgeniczną linię myszy GFP-M, która znakuje komórki piramidalne warstwy 51. Komórki piramidalne warstwy 5 rzutują wypustki dendrytyczne do warstw powierzchownych, co umożliwia wizualizację dendrytów i kolców dendrytycznych do głębokości 300 μm poniżej poziomu opony twardej. Alternatywnym podejściem jest znakowanie komórek za pomocą markerów wirusowych (patrz Lowery et al., przesłane do JOVE).</li>
 <li>Zdezynfekuj przestrzeń roboczą 70% etanolem i wysterylizuj narzędzia w autoklawie w celu przeprowadzenia aptycznej operacji. Przykryj powierzchnię operacyjną czystym opatrunkiem.</li>
 <li>Zpodaj myszom koktajl Fentanylu (fentanyl 0,05 mg/kg; midazolam 5 mg/kg; metatomadin 0,5 mg/kg), a następnie ćwiartkę dawki Avertinu (0,075 mg/ml), zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez IACUC. Wstępnie podaj myszom lek przeciwbólowy, buprenorfinę (0,5 mg/kg), drogą podskórną (SQ). Monitoruj poziom znieczulenia, sprawdzając reakcję na uciśnięcie ogona/palca.</li>
 <li>Utrzymuj zwierzę w temperaturze 37,5°C, korzystając z mata grzewczego z przymocowanym termometrem rektalnym.</li>
 <li>Nałóż maść oftalmiczną na oczy, aby zapobiec ich wysuszeniu. Przykryj oczy małym kawałkiem papieru, aby chronić je przed źródłem światła podczas operacji.</li>
 <li>Za pomocą nożyczek usuń sierść z tyłu głowy (za uszami) aż do oczu.</li>
 <li>Oczyść górną część głowy zwierzęcia poprzez sekwencyjną aplikację 70% etanolu, a następnie szorowanie betadyną i zastosowanie roztworu betadyny.</li>
 <li>Wykonaj nacięcie w kształcie litery L za uszami i w górę wzdłuż prawej lub lewej strony linii środkowej (w zależności od tego, która półkula będzie obrazowana) aż do oczu. Odchyl skórę i odsuń ją od miejsca operacji. Nie usuwaj skóry, ponieważ zostanie ona zaszyta po sesji obrazowania.</li>
 <li>Używając precyzyjnej pęsety, delikatnie odciągnij skórę w górę i odsuń od obszaru zainteresowania.</li>
 <li>Delikatnie zeskrob okostnę z odsłoniętego obszaru czaszki za pomocą czystej pęsety lub ostrza mikrosurgicalnego. Używając patyczka higienicznego, nałóż niewielką ilość 10% chlorku żelaza na czaszkę, aby całkowicie wysuszyć błonę okostną i upewnić się, że została ona całkowicie usunięta. Ważne jest, aby czaszka była całkowicie sucha, co zapewni prawidłowe przyleganie kleju (patrz pkt 1). Używając pęsety lub ostrza mikrosurgicalnego, delikatnie zeskrob wysuszoną błonę okostną.</li>
 <li>Nałóż cienką warstwę kleju cyjanoakrylowego wokół okna obrazowania stalowej płytki głowowej (patrz Rycina 1) i przymocuj płytkę do czaszki.</li>
 <li>Używając drewnanego końca patyczka higienicznego, nałóż klej na wewnętrzne szwy okna obrazowania, upewniając się, że wszystkie szczeliny między płytką obrazującą a krzywizną czaszki są wypełnione.</li>
 <li>Wpuść kroplę akceleratora kleju do okna. Szybko usuń nadmiar akceleratora patyczkiem higienicznym lub chusteczką Kimwipe. Klej powinien być całkowicie utwardzony przed wierceniem.</li>
 <li>Zacznij ścieńczać czaszkę w oknie obrazowania, używając wiertła stomatologicznego z zamocowanym wiertłem stalowym o średnicy 0,7 mm. Przeplataj wiercenie okazjonalną aplikacją 0,9% jałowej soli fizjologicznej, aby uniknąć nadmiernego nagrzania czaszki.</li>
 <li>Wycieraj okno o wymiarach 4x4 mm na czaszce, wykonując krótkie ruchy w poprzek powierzchni czaszki wiertłem stomatologicznym. Sprawdź grubość czaszki za pomocą pęsety o tępym końcu. Powierzchnia czaszki powinna lekko uginać się pod delikatnym naciskiem. Optymalna grubość czaszki do obrazowania wynosi od 10 do 30 μm.</li>
 <li>Gdy czaszka będzie cienka, a okno oczyszczone ze wszystkich zanieczyszczeń, nałóż sól fizjologiczną na czaszkę. Sfotografuj okno obrazowania za pomocą cyfrowego aparatu zamontowanego na stereomikroskopie. Fotografia i wykorzystanie naczyń krwionośnych mózgu pomogą w zlokalizowaniu miejsca umieszczenia płytki obrazującej w kolejnych sesjach.</li>
 <li>Przenieś zwierzę do zestawu do mikroskopii dwufotonowej. Zwierzę powinno pozostawać na macie grzewczej (z sondą rektalną) przez całą sesję obrazowania. Uwaga: podczas sedacji temperatura wewnętrzna ciała zwierzęcia będzie znacznie wahać się w przypadku braku urządzenia grzewczego, co doprowadzi do uszkodzeń kory mózgowej lub potencjalnie do śmierci.</li>
 <li>Używany jest mikroskop dwufotonowy z laserem Mai Tai, pompką stanu stałego 10W dla maksymalnej mocy oraz zmodyfikowaną jednostką konfokalną Olympus Fluoview. System jest zoptymalizowany do obrazowania głębokich tkanek, a detektory zewnętrzne są zainstalowane jak najbliżej obiektywu, aby umożliwić maksymalną detekcję fluorescencji z mózgu. Stosowany jest obiektyw Olympus LUMPlan fl/IR 20X/0,95NA. Podczas obrazowania do zanurzenia obiektywu używana jest 0,9% sól fizjologiczna.</li>
 <li>Za pomocą tego mikroskopu, przy niskim cyfrowym powiększeniu (x1), zidentyfikuj obszar zawierający jasno znakowane neurony.</li>
 <li>Używając aparatu cyfrowego przymocowanego do okularu mikroskopu, wykonaj zdjęcie obszaru obrazowania. Alternatywnie, naszkicuj wzór unaczynienia krwi. Jest to konieczne, aby powrócić do tego samego miejsca obrazowania w późniejszym czasie.</li>
 <li>Uzyskaj stos obrazów przy niskim powiększeniu (obiektyw x20, 512x512 pikseli; krok 5 μm) przez cały widoczny zakres mózgu (zazwyczaj obejmujący ~20 μm), pokazujący zakres ramifikacji dendrytycznej. Uwaga: ten obraz przy niskim powiększeniu będzie służył do lokalizacji obszaru obrazowania w późniejszych punktach czasowych, ponieważ zarówno naczynia krwionośne, jak i dendryty zachowują swoją strukturę u zwierząt młodych i dorosłych.</li>
 <li>Używając oprogramowania do obrazowania (Fluoview, v. 5.0, FV30), zwiększ powiększenie cyfrowe 8-krotnie. W razie potrzeby dostosuj współrzędne X,Y (współrzędne panoramy) i zbierz stos obrazów o wysokim powiększeniu, który pokaże szczegółową morfologię dendrytyczną, w tym lokalizację i strukturę kolców dendrytycznych. Sporządź szczegółowe notatki dotyczące każdego zbieranego stosu, np. współrzędne panoramy, zakres zbierania, wielkość kroku z oraz liczbę kroków w stosie. Notatki te będą wykorzystywane przy powrocie do tego dendrytu lub aksonu w późniejszym czasie.</li>
 <li>Po obrazowaniu usuń płytkę głowową, delikatnie oddzielając ją od powierzchni czaszki. Używając pęsety, usuń resztki kleju pozostałe na czaszce i przemyj powierzchnię czaszki 0,9% jałową solą fizjologiczną. Zaszyj skórę nad czaszką, używając nici chirurgicznej nr 6. Przetrzyj obszar 70% etanolem. Aby złagodzić ból podczas rekonwalescencji pooperacyjnej, podaj 0,1 mg/kg buprenorfinę przeciwbólową, SQ.</li>
 <li>Umieść zwierzę w czystej klatce pod lampą grzewczą, aż się obudzi i odzyska sprawność ruchową. Przenieś zwierzę do oryginalnej klatki.</li>
 <li>Aby ponownie obrazować zwierzę w późniejszym czasie (nasze punkty czasowe mogą być oddalone od 2 dni do wielu miesięcy), usuń szwy lub ponownie otwórz skórę na głowie, stosując powyższe metody aseptyczne. Użyj cyfrowego obrazu unaczynienia mózgu (wykonanego w dniu pierwszej operacji), aby zlokalizować pierwotne miejsce obrazowania. Ponownie przymocuj stalową płytkę głowową (kroki 10-12). Użyj ostrza mikrosurgicalnego, aby delikatnie usunąć jakąkolwiek kość, która mogła odrosnąć między punktami czasowymi obrazowania. W razie potrzeby użyj wiertła stomatologicznego. Oczyść okno obrazowania zanieczyszczeń i nałóż kroplę 0,9% jałowej soli fizjologicznej.</li>
 <li>Przenieś zwierzę do mikroskopu dwufotonowego i zlokalizuj pierwotne pole obrazowania. W celu pomocy skorzystaj z fotografii cyfrowej wykonanej podczas pierwszej sesji obrazowania.</li>
 <li>Uruchom program Fluoview i otwórz oryginalny obraz przy niskim powiększeniu. Przyłóż arkusz przezroczystości do ekranu komputera i naszkicuj główny wzór naczyń krwionośnych za pomocą pisaka do folii.</li>
 <li>Otwórz obraz na żywo i dopasuj unaczynienie krwi do naszkicowanego wzoru na folii przezroczystej.</li>
 <li>Aby ponownie obrazować struktury powiększone 8-krotnie, otwórz wybrany stos zebrany podczas poprzedniej sesji obrazowania. Naszkicuj strukturę (np. aksonalną, dendrytyczną, glejową) na folii przezroczystej przyłożonej do ekranu komputera.</li>
 <li>Powiększ 8-krotnie obraz na żywo i ustaw współrzędne panoramy zgodnie z parametrami obrazowania z pierwszego dnia. W zależności od dokładności dopasowania lokalizacji przy niskim powiększeniu, może być konieczne również lekkie skorygowanie kąta obrazu. Po znalezieniu pożądanej struktury, dopasuj ją do naszkicowanego wzoru o wysokim powiększeniu. Zbierz stos z identyczną wielkością kroku i liczbą obrazów stosu z dla późniejszej analizy.</li>
 <li>Powtarzaj kroki 29 i 30, aż wszystkie obrazy o wysokim powiększeniu zostaną ponownie zebrane.</li>
 <li>Po zakończeniu obrazowania powtórz kroki 2-24. Ponowne obrazowanie może być powtarzane w maksymalnie dwóch oddzielnych punktach czasowych.</li>
 <li>Eksperymenty na zwierzętach były prowadzone zgodnie z wytycznymi i regulacjami ustanowionymi przez Vivarium oraz Division of Laboratory Animal Medicine w University of Rochester School of Medicine and Dentistry, w pełnej akredytacji Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, International (AAALAC) oraz są zgodne z prawem stanowym, ustawami federalnymi i polityką NIH.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
W myszach wykazujących ekspresję GFP-M podzbiór piramidowych komórek warstwy 5 oraz odpowiadające im wypustki dendrytyczne można łatwo zobrazować za pomocą dwufotonowej skaningowej mikroskopii laserowej (2PLSM)1. W niniejszej pracy zaprezentowaliśmy preparację z utonczoną czaszką, w której kość nad wybranym obszarem obrazowania zostaje utonczona do ~10-30 μm. Prawidłowo wykonany protokół pozwolił nam na wyraźną wizualizację dendrytów i kolców korowych w nienaruszonej korze wzrokowej w celu przeprowadzenia analizy ostrej lub przewlekłej (Rysunek 2).
<img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig1.jpg" alt="Wytwarzanie chipa mikroprzepływowego przedstawione w czterech widokach: zdjęcia z montażu (A, B, C) oraz schemat techniczny (D)." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rysunek 1. Niestandardowa głowica i płyta podstawowa. (A) Widok z góry wykonanej na zamówienie płytki głowowej i podstawy użytych do przygotowania operacji cieńczenia czaszki. (B) Widok z boku wykonanej na zamówienie płytki głowowej i podstawy. (C,D) Szczegółowy schemat i obraz płytki głowowej.
<img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig2.jpg" alt="Wzrost naczyń krwionośnych w ciągu 4 dni, obrazy mikroskopowe przedstawiające zmiany naczyniowe, opisane według dni." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Reprezentatywne wyniki z 2PLSM po wykonaniu preparacji cienkiej czaszki. (A) Obrazowanie dendrytów in vivo w korze wzrokowej transgenicznej myszy GFP-M przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Obraz jest projekcją pojedynczego zdjęcia uzyskanego co 5 μm od opony miękkiej do końcowej głębokości 175 μmObramowany obszar w A przedstawia powiększony region w (B) i (C) obrazowany w dniu 0 (D0) oraz cztery dni później (D4). (D,E) Większe powiększenie odnogi dendrytycznej obramowanej w B i C, wykazujące kolce stabilne (białe groty strzałek), kolce utracone/cofające się (czerwone groty strzałek) oraz nowe kolce (zielone groty strzałek). Paski skali= A. 200 μm, B, C. 20 μm, D,E. 5 μm.

<ol><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+synaptic+structure+in+sensory+cortical+areas+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo.</a> J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li>
<li>Xu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Przewlekłe obrazowanie z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej staje się coraz popularniejszą techniką badania zmian morfologicznych wywoływanych podczas plastyczności2-5. W niniejszym materiale prezentujemy preparację z cienką czaszką, która pozwala na śledzenie zidentyfikowanych kolców dendrytycznych w nienaruszonym mózgu myszy w różne dni obrazowania. W tym protokole czaszka pozostaje nienaruszona, co powoduje minimalne uszkodzenia kory i skutkuje bardzo niskim poziomem neurostanu zapalnego, który mógłby ...

<table><tbody><tr><td>Cytrynian fentanylu</td><td></td><td>Wewnętrzny</td><td></td><td>Koktajl z fentanylem: koktajl anestetyczny;&lt;br/&gt;Dawka IP: 0,0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Końcowe stężenie koktajlu: 0,05 mg/kg</td></tr><tr><td>Chlorowodorek medetomidyny</td><td></td><td>Wewnętrzny</td><td></td><td>Koktajl z fentanylem: koktajl anestetyczny;&lt;Obrazowanie in vivo z wykorzystaniem dwufotonowej skaningowej mikroskopii laserowej (2PLSM) umożliwia badanie żywych komórek i procesów neuronalnych w nienaruszonym mózgu. Przedstawiona tutaj technika pozwala na obrazowanie tego samego obszaru mózgu w kilku punktach czasowych (obrazowanie chroniczne) z rozdzielczością mikroskopową, co umożliwia śledzenie kolców dendrytycznych – niewielkich struktur stanowiących większość postsynaptycznych miejsc pobudzających w OUN. Zdolność do wyraźnego obrazowania drobnych struktur korowych w wielu punktach czasowych niesie ze sobą wiele korzyści, szczególnie w badaniach nad plastycznością mózgu, w których zmiany morfologiczne w synapsach oraz przebudowa obwodów mogą pomóc w wyjaśnieniu leżących u ich podstaw mechanizmów. W niniejszym filmie oraz materiałach uzupełniających prezentujemy protokół chronicznego obrazowania in vivo nienaruszonego mózgu z wykorzystaniem preparacji z cienkiej czaszki. Preparacja z cienkiej czaszki jest podejściem małoinwazyjnym, które pozwala uniknąć potencjalnych uszkodzeń opony twardej i/lub kory, redukując tym samym wystąpienie odpowiedzi zapalnej. Przy prawidłowym wykonaniu tego protokołu możliwe jest wyraźne monitorowanie zmian w charakterystyce kolców dendrytycznych w nienaruszonym mózgu przez dłuższy okres czasu.&gt;Dawka IP: 0,0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Końcowe stężenie koktajlu: 0,05 mg/kg</td></tr><tr><td>Midazolam HCl</td><td></td><td>Wewnątrzinstytucjonalnie</td><td></td><td>Koktajl z fentanylem: koktajl anestetyczny;&lt;Obrazowanie in vivo z wykorzystaniem dwufotonowej laserowej mikroskopii skanującej (2PLSM) umożliwia badanie żywych komórek i wypustek neuronalnych w nienaruszonym mózgu. Przedstawiona tutaj technika pozwala na obrazowanie tego samego obszaru mózgu w kilku punktach czasowych (obrazowanie chroniczne) z rozdzielczością mikroskopową umożliwiającą śledzenie kolców dendrytycznych, które są małymi strukturami stanowiącymi większość postsynaptycznych miejsc pobudzających w OUN. Zdolność do wyraźnego rozdzielenia drobnych struktur korowych w kilku punktach czasowych niesie ze sobą wiele korzyści, szczególnie w badaniach nad plastycznością mózgu, w których zmiany morfologiczne w synapsach i przebudowa obwodów mogą pomóc w wyjaśnieniu leżących u ich podstaw mechanizmów. W tym filmie i materiałach uzupełniających prezentujemy protokół chronicznego obrazowania in vivo nienaruszonego mózgu z wykorzystaniem preparacji z utkaną czaszką. Preparacja z utkaną czaszką jest podejściem małoinwazyjnym, które pozwala uniknąć potencjalnego uszkodzenia opony twardej i/lub kory, redukując tym samym wystąpienie reakcji zapalnej. Przy prawidłowym wykonaniu tego protokołu możliwe jest wyraźne monitorowanie zmian w charakterystyce kolców dendrytycznych w nienaruszonym mózgu przez dłuższy okres czasu.&gt;Dawka domięśniowa: 0,0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Końcowe stężenie koktajlu: 0,05 mg/kg</td></tr><tr><td>2,2,2-tribromo&amp;#8211;etanol </td><td></td><td></td><td></td><td>Koktajl Avertin: środek znieczulający;&lt;br/&gt;Dawka domięśniowa: 0,0075 cm³/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Końcowe stężenie koktajlu: 1%</td></tr><tr><td>2-metylo-2-butanol (stężenie końcowe: 0,775%)</td><td></td><td></td><td></td><td>Koktajl Avertin: środek znieczulający;&lt;br/&gt;Dawka domięśniowa (IP): 0,0075 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Końcowe stężenie koktajlu: 0,775%</td></tr><tr><td>System kontroli temperatury TC-1000 dla myszy</td><td></td><td>CWE, Inc.</td><td>Mysz TC-1000</td><td>Regulacja temperatury ciała</td></tr><tr><td>Toberadex</td><td></td><td>Własny (wykonany wewnętrznie)</td><td></td><td>Maść do oczu</td></tr><tr><td>10% chlorek żelaza(III)</td><td></td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3120-32</td><td>Przygotowanie z cieńszą czaszką</td></tr><tr><td>Skalpel mikrochirurgiczny</td><td></td><td>Sable Industries</td><td>S-6400</td><td>Przygotowanie preparatu z utcieńczoną czaszką</td></tr><tr><td>Cyjanoakrylan 404,401</td><td></td><td>Loctite</td><td>Nr kat. 46551</td><td>Przygotowanie cienkiej czaszki</td></tr><tr><td>Cyjanoakryl 401</td><td></td><td>Loctite</td><td>Nr kat. 40140</td><td>Przygotowanie metodą ścieńczenia czaszki</td></tr><tr><td>Akcelerator kleju Zip Kicker</td><td></td><td>Technologia Pacer</td><td>PT-29</td><td>Przygotowanie cienkiej czaszki</td></tr><tr><td>Stalowe wiertła mikrochirurgiczne o średnicy końcówki 0,7 mm</td><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-07</td><td>Przygotowanie preparatu z cienkiej czaszki</td></tr><tr><td>Sterownik momentu obrotowego Microtorque i końcówka Tech2000</td><td></td><td>Ram Products, Inc.</td><td>TECH2000 WŁ./WYŁ.</td><td>Przygotowanie cienkiej czaszki</td></tr><tr><td>szew jedwabny 6-0 (0,7 metryczne)</td><td></td><td>Ethicon Inc.</td><td>K8894H</td><td>Stożek C-1</td></tr><tr><td>Kleszczyki okularne, 10 cm, szerokość końcówki 0,5 mm, zakrzywione</td><td>Narzędzia chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Bonn extra fine, 8,5 cm, końcówka prosta, ostrze tnące 13 mm</td><td>Narzędzia chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta standardowa, prosta, końcówka 2,5 mm x 1,35 mm, 12 cm</td><td>Narzędzia chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr></tbody></table>

przewlekłe obrazowanie kory wzrokowej myszy z wykorzystaniem preparatu z pocienioną czaszką

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo obrazowanie z wykorzystaniem dwufotonowej skaningowej mikroskopii laserowej (2PLSM) umożliwia badanie żywych komórek i wypustek neuronalnych w nienaruszonym mózgu. Przedstawiona tutaj technika pozwala na obrazowanie tego samego obszaru mózgu w kilku punktach czasowych (obrazowanie chroniczne) z rozdzielczością mikroskopową umożliwiającą śledzenie kolców dendrytycznych, czyli niewielkich struktur stanowiących większość postsynaptycznych miejsc pobudzających w OUN. Zdolność do wyraźnego rozdzielania drobnych struktur korowych w wielu punktach czasowych niesie ze sobą wiele zalet, szczególnie w badaniach plastyczności mózgu, w których zmiany morfologiczne w synapsach i przebudowa obwodów mogą pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów podstawowych. W tym filmie i materiałach uzupełniających prezentujemy protokół chronicznego obrazowania in vivo nienaruszonego mózgu z wykorzystaniem preparacji z pocienioną czaszką. Preparacja z pocienioną czaszką jest podejściem małoinwazyjnym, które pozwala uniknąć potencjalnego uszkodzenia opony twardej i/lub kory, redukując tym samym wystąpienie reakcji zapalnej. Przy prawidłowym wykonaniu tego protokołu możliwe jest wyraźne monitorowanie zmian w charakterystyce kolców dendrytycznych w nienaruszonym mózgu przez dłuższy okres czasu.

W tym filmie i materiałach uzupełniających przedstawiamy protokół przewlekłego obrazowania in vivo nienaruszonego mózgu z wykorzystaniem preparacji z cienkiej czaszki.

Przewlekłe obrazowanie kory wzrokowej myszy z wykorzystaniem preparatu z pocienioną czaszką

Obrazowanie in vivo z wykorzystaniem dwufotonowej skaningowej mikroskopii laserowej (2PLSM) umożliwia badanie żywych komórek oraz wypustek neuronalnych w nienaruszonym mózgu.

Kolce dendrytyczne to wypustki błonowe dendrytu neuronu, które przyjmują sygnały synaptyczne. Wydłużanie, kurczenie, pojawianie się lub zanikanie kolców następuje w odpowiedzi na zmiany w funkcjonowaniu sieci neuronowej, które wynikają ze specyficznych wzorców aktywności neuronalnej. Zjawisko to, umożliwiające obserwację zmian morfologicznych w kolcach dendrytycznych, znane jest jako plastyczność kory.U żywych zwierząt do czaszki myszy przymocowana jest płyta obrazująca. Obszar czaszki zostaje chirurgicznie odchudzony, a następnie wykonuje się obrazy przy małym i dużym powiększeniu. Następnie obszary te są ponownie obrazowane w późniejszych punktach czasowych.Uzyskane wyniki pokazują, że morfologia kolców dendrytycznych może być wyraźnie wizualizowana przy użyciu preparatu z cienką czaszką w wielu punktach czasowych. Wykazano również, że morfologia kolców jest wysoce plastyczna, co objawia się zmianami w strukturze, a także pojawianiem się i zanikaniem kolców dendrytycznych. Cześć, nazywam się Emily Kelly i pracuję w laboratorium Anayi Maki w Departamencie Neurobiologii i Anatomii na Uniwersytecie w Rochester.Dzisiaj przedstawimy procedurę chronicznego obrazowania kory wzgórzowej myszy po przygotowaniu tzw. okna czaszkowego. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania wymiany kolców dendrytycznych. Zacznijmy zatem.Rozpocznij procedurę od sterylizacji narzędzi do chirurgii aseptycznej. Następnie zdezynfekuj obszar roboczy 70% ethanol i pokryj powierzchnię operacyjną czystym opatrunkiem. Monitoruj głębokość znieczulenia u myszy znieczulonej koktajlem z fentanylem, sprawdzając reakcję na uciśnięcie palca u stopy; mysz przedstawiona tutaj to mysz transgeniczna A-G-F-P-M, w której ekspresjonowane jest GFP.W warstwie piątej znajdują się komórki parametalne, które wysyłają wypustki dendrytyczne do warstw powierzchownych. Aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37,5 °C, umieść zwierzę na podgrzewającej macie i monitoruj ją za pomocą przymocowanego termometru rektalnego. Następnie, używając nożyczek, nałóż maść oftalmiczną do oczu, aby zapobiec ich wysychaniu.Usuń sierść z tyłu głowy myszy, od miejsca za uszami aż do oczu. Następnie oczyść górną część głowy zwierzęcia, aplikując 70% etanol, a następnie szorując Betadyną i przemywając roztworem Betadyny. Wykonaj nacięcie LCU za uszami i w górę wzdłuż prawej lub lewej strony linii środkowej, w zależności od tego, która półkula będzie obrazowana, aż do oczu; odchyl skórę i złóż ją z dala od miejsca operacji.Nie usuwaj skóry, ponieważ zostanie ona później zaszyta przy użyciu precyzyjnych pincet. Delikatnie odciągnij skórę w górę i odsuń ją od obszaru zainteresowania. Używając czystych pincet, delikatnie zeskrob okostną z odsłoniętego obszaru czaszki.Nanieś niewielką ilość 10% chlorku cynku na czaszkę, aby całkowicie osuszyć błonę okostnową i upewnić się, że została ona w pełni usunięta. Ważne jest, aby czaszka była całkowicie sucha. Aby zapewnić odpowiednią przyczepność kleju, delikatnie zeskrob wysuszoną błonę okostnową za pomocą ostrza mikroschirurgicznego.Następnie nanieś cienką warstwę akrylowego kleju Sano wokół okna obrazowania stalowej płytki głowowej i przytwierdź płytkę do czaszki. Za pomocą drewn ownego końca patyczka higienicznego nanieś klej na wewnętrzne krawędzie okna obrazowania, upewniając się, że wszystkie szczeliny między płytką obrazującą a krzywizną czaszki zostały wypełnione. Umieść kroplę akceleratora kleju w oknie.Następnie szybko usuń nadmiar kleju. Pozostaw klej do całkowitego wyschnięcia. Używając wiertarki stomatologicznej z zamocowanym stalowym wiertłem o średnicy 0,7 mm, rozpocznij cieńczenie czaszki w oknie obrazowania.Wiercenie należy przeplatać okresowym podawaniem 0,9% soli fizjologicznej, aby uniknąć nadmiernego przegrzania czaszki. Należy wyciąć okno o wymiarach 4x4 mm w czaszce, wykonując krótkie ruchy w poprzek jej powierzchni.Za pomocą wiertła dentystycznego. Sprawdzić grubość czaszki, naciskając ją kleszczykami tępymi. Powierzchnia czaszki lekko ugnie się pod wpływem delikatnego nacisku.Optymalna grubość czaszki dla obrazowania wynosi od 10 do 30 mikronów. Po ścienieniu czaszki należy oczyścić okno z wszelkich zanieczyszczeń i nanieść sól fizjologiczną na czaszkę. Należy sfotografować okno obrazowania za pomocą kamery cyfrowej zamontowanej na stereomikroskopie.Układ naczyniowy mózgu na tej fotografii pomoże w zlokalizowaniu miejsca umieszczenia płyty obrazowej podczas kolejnych sesji obrazowania. Przenieś zwierzę do układu dwufotonowego. Zwierzę powinno pozostać na macie grzewczej, a temperatura ciała musi być stale monitorowana przez cały czas trwania sesji obrazowania.Mikroskop dwufotonowy z laserem Mi Tai. Wykorzystano 10 watową pompę półprzewodnikową dla uzyskania maksymalnej mocy oraz zmodyfikowaną jednostkę konfokalną Olympus Flow View. System został zoptymalizowany do obrazowania głębokich tkanek, a detektory zewnętrzne zainstalowano jak najbliżej obiektywu, aby umożliwić maksymalną detekcję fluorescencji z mózgu; przy użyciu niskiego cyfrowego powiększenia dodaj kroplę soli fizjologicznej do okna obrazowania.Za pomocą przymocowanej do mikroskopu kamery cyfrowej zidentyfikuj obszar zawierający intensywnie znakowane neurony. Następnie wykonaj zdjęcie obszaru obrazowania. Jest to niezbędne, aby móc powrócić do tego samego miejsca obrazowania w kolejnym punkcie czasowym.Wykonaj stos obrazów przy niskim powiększeniu obejmujący cały widoczny zakres mózgu, aby ukazać stopień ramifikacji dendrytycznej. Posłuży to do lokalizacji obszaru obrazowania w kolejnych punktach czasowych, ponieważ zarówno naczynia krwionośne, jak i dendryty zachowują swoją strukturę u zwierząt młodych i dorosłych przy użyciu oprogramowania do obrazowania.Zwiększ powiększenie cyfrowe ośmiokrotnie, w razie potrzeby skoryguj współrzędne XY i wykonaj stos obrazów przy dużym powiększeniu, aby ukazać szczegółową morfologię dendrytów, w tym lokalizację i strukturę kolców dendrytycznych. Sporządź szczegółowe notatki dotyczące każdego wykonanego stosu, uwzględniając współrzędne panowania, zakres akwizycji, wielkość kroku Z oraz liczbę kroków w stosie. Notatki te będą wykorzystane podczas powrotu do tego dendrytu lub aksonu w kolejnym punkcie czasowym.Po zakończeniu obrazowania należy zdjąć płytkę głowową, delikatnie oddzielając ją od powierzchni czaszki za pomocą pęsety. Należy usunąć wszelkie pozostałości kleju i przemyć czaszkę 0,9% jałową solą fizjologiczną.Zszyj skórę nad czaszką, używając nici chirurgicznej nr 6. Po zakończeniu procedury obrazowania przemyj ten obszar 70% etanolem. Umieść zwierzę w czystej klatce pod lampą grzewczą do czasu wybudzenia się i odzyskania sprawności ruchowej.Następnie należy zwrócić zwierzę do jego pierwotnej klatki, aby powtórzyć obrazowanie w późniejszym punkcie czasowym, od dwóch dni do wielu miesięcy później; należy usunąć szwy i ponownie otworzyć skórę na głowie. Stosując metody aseptyczne, należy wykorzystać cyfrowy obraz naczyń krwionośnych mózgu wykonany podczas pierwszej operacji, aby zlokalizować pierwotne miejsce obrazowania. Następnie należy ponownie zamocować płytkę głowową w ten sam sposób co wcześniej.W razie potrzeby użyj ostrza mikrosurgicalnego, aby delikatnie usunąć nadmiar kości, która mogła odrosnąć między punktami czasowymi obrazowania. Przetnij tkankę wiertłem dentystycznym, oczyść okno obrazowania z resztek i nanieś kroplę 0,9% jałowej soli fizjologicznej. Przenieś zwierzę do mikroskopu dwufotonowego i zlokalizuj pierwotny obszar obrazowania, korzystając z cyfrowego obrazu fluorescencyjnego wykonanego podczas poprzedniej sesji.Uruchom program widoku przepływu. Otwórz oryginalny obraz przy niskim powiększeniu, przyłóż arkusz folii przezroczystej do ekranu komputera i naszkicuj główny wzór naczyń krwionośnych za pomocą pisaka do folii. Następnie otwórz obraz na żywo i wyrównaj układ naczyń krwionośnych z wzorem naszkicowanym na folii przezroczystej.Usuń folię przezroczystą, aby ponownie zobrazować struktury powiększone ośmiokrotnie. Otwórz wybrany stos obrazów zebranej podczas poprzedniej sesji obrazowania. Odrysuj strukturę na folii przezroczystej przymocowanej do ekranu komputera.Przybliż obraz na żywo ośmiokrotnie i wyrównaj go z przezroczystością. W zależności od dokładności wyrównania przy niskim powiększeniu, może być konieczne również niewielkie skorygowanie kąta obrazu. Ustaw współrzędne panoramy zgodnie z parametrami obrazowania z pierwszego dnia, w tym wielkość kroku i liczbę obrazów do zebrania w stosie Z. Ponowne obrazowanie można przeprowadzić maksymalnie dwukrotnie. Liczba otwarć skóry głowy powinna być ograniczona, aby uniknąć naruszenia integralności czaszki, co skutkowałoby niską rozdzielczością obrazowania u myszy wykazujących ekspresję GFP.Podzbiór komórek parametalnych warstwy piątej oraz odpowiadające im wypustki dendrytyczne zostały zwizualizowane przy użyciu dwufotonowej laserowej mikroskopii skaningowej in vivo; tutaj przedstawiono dendryty kory wzrokowej znakowane GFP. Obraz ten jest projekcją pojedynczych obrazów uzyskanych co 5 µm od PIA do końcowej głębokości 175 µm. Obszar zaznaczony ramką pokazano tutaj w większym powiększeniu w dniu zerowym, a następnie w dniu czwartym, porównując obrazy gałązki dendrytycznej w większym powiększeniu z dnia zerowego i czwartego.Obrazy te przedstawiają stabilne kolce wskazane białymi grotami strzałek, zanikające i cofające się kolce zaznaczone czerwonymi grotami strzałek oraz nowe kolce wskazane zielonymi grotami strzałek. Przedstawiliśmy właśnie sposób wykonywania chronicznego obrazowania dwufotonowego w korze wzrokowej myszy z wykorzystaniem preparacji cienkiej czaszki. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zachować szczególną ostrożność w procesie ścieńczania, aby uniknąć uszkodzenia czaszki i leżącej pod nią opony twardej, ponieważ spowoduje to niską rozdzielczość obrazowania; należy również prowadzić szczegółowe notatki.To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentów.

chronic-imaging-mouse-visual-cortex-using-thinned-skull

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przewlekłe obrazowanie kory wzrokowej myszy przy użyciu przygotowania z przerzedzonymi czaszkami

Niniejszy film i protokół demonstrują sposób implantacji pokrytego szkłem okna czaszkowego u gryzoni. Preparaty te mogą być wykorzystywane do przewlekłego obrazowania dwufotonowego neocortex in vivo w skalach czasowych obejmujących wiele miesięcy. Mogą one być również stosowane w innych rodzajach obrazowania, w tym w obrazowaniu sygnałów optycznie immanentnych.

Procedura kraniotomii w celu przewlekłego obrazowania mózgu

Opisujemy metodę wielokrotnej wizualizacji mikrogleju mysiego oraz monocytów krążących in vivo w czasie liczonym w godzinach, dniach lub tygodniach, z wykorzystaniem transkranialnej mikroskopii dwufotonowej. Demonstrujemy sposób przygotowania okna z cienkiej czaszki, które umożliwia przerywaną obserwację spoczywającego mikrogleju, który może zostać aktywowany poprzez sąsiednią stereotaktyczną iniekcję białka regulatorowego Tat wirusa HIV-1.

Technika cienkiej okienkowej czaszki do przewlekłego obrazowania dwufotonowego in vivo mikrogleju mysiego w modelach neurozapalenia

Przedstawiamy metodę tworzenia okna obrazującego w czaszce myszy, które obejmuje obszar o wielkości kilku milimetrów i pozostaje stabilne przez wiele miesięcy bez wywoływania stanu zapalnego mózgu. Metoda ta jest odpowiednia do podłużnych badań przepływu krwi, dynamiki komórkowej oraz struktury komórkowej i naczyniowej z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej.

Polerowane i wzmocnione okno z cienkiej czaszki do długoterminowego obrazowania mózgu myszy

Łącząc zastosowanie polerowanego i wzmocnionego cienkiego okna czaszkowego (PoRTS) z wstrzykiwaniem komórek glejaka wielopostaciowego (GBM), możemy w sposób podłużny obserwować inicjację i wzrost glejaka z wstrzykniętych komórek GBM w mózgu żywej myszy.

Obrazowanie inicjacji glejaka in vivo poprzez wypolerowane i wzmocnione cienkie okno czaszkowe

Prezentujemy metodę tworzenia okna korowego z cieńszą czaszką (TSCW) w modelu mysim do obrazowania in vivo OCT kory mózgowej.

Technika cienkiego okienka korowego czaszki do obrazowania w optycznej tomografii koherentnej in vivo

Obrazowanie poklatkowe u żywego zwierzęcia dostarcza cennych informacji na temat reorganizacji strukturalnej w nienaruszonym mózgu. Tutaj wprowadzamy preparat z rozcieńczoną czaszką, który umożliwia przezczaszkowe obrazowanie znakowanych fluorescencyjnie struktur synaptycznych w żywej korze myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Dwufotonowe obrazowanie in vivo kolców dendrytycznych w korze myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką

Ostra uraz mózgu to poważny uraz, który do tej pory nie doczekał się odpowiedniego leczenia. Mikroskopia wielofotonowa pozwala na badanie podłużne procesu rozwoju ostrego urazu mózgu i sondowanie strategii terapeutycznych u gryzoni. W protokole przedstawiono dwa modele ostrego urazu mózgu badane za pomocą dwufotonowego obrazowania mózgu in vivo.

Ostry uraz mózgu u myszy, po którym następuje podłużne obrazowanie dwufotonowe

Ten manuskrypt opisuje procedurę śledzenia przebudowy układu naczyniowo-mózgowego podczas gromadzenia się blaszek amyloidowych in vivo za pomocą podłużnej mikroskopii dwufotonowej. Preparat z rozcieńczoną czaszką umożliwia wizualizację barwników fluorescencyjnych w celu oceny postępu uszkodzenia naczyń mózgowych w mysim modelu choroby Alzheimera.

Podłużne obrazowanie in vivo naczyń mózgowych: znaczenie dla chorób OUN

Ten protokół opisuje technikę przewlekłego wszczepiania okien czaszkowych, która może być używana do podłużnego obrazowania struktur nerwowo-glejowo-naczyniowych, interakcji i funkcji zarówno w zdrowych, jak i chorych warunkach. Służy jako alternatywa uzupełniająca dla metody obrazowania przezczaszkowego, która, choć często preferowana, ma pewne krytyczne ograniczenia.

Precyzyjne mapowanie mózgu w celu wykonywania powtarzalnych obrazowań in vivo dynamiki neuroimmunologicznej u myszy

Prezentowany tutaj jest protokół wszczepienia przewlekłego okna czaszkowego do podłużnego obrazowania komórek mózgowych u obudzonych, skrępowanych głową myszy.

Implantacja okna czaszkowego w celu powtórzenia obrazowania in vivo u obudzonych myszy

Poznaj metodę przewlekłego obrazowania kory wzrokowej myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką. Technika ta umożliwia obserwację dynamiki kolców dendrytycznych w żywych zwierzętach i badanie plastyczności kory mózgowej.

Przewlekłe obrazowanie kory wzrokowej myszy z wykorzystaniem preparatu z pocienioną czaszką

Przeglądaj więcej filmów