Analiza ultrastrukturalna wycinka mózgu myszy z wykorzystaniem transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Weźmy na przykład fragment mózgu myszy umocowany tetratlenkiem osmu osadzony w bloku żywicy.

Uzyskaj obraz przekroju i wyrównaj go z wcześniej przygotowanym obrazem atlasu, aby zidentyfikować obszar zainteresowania.

Zaznacz granice tego regionu na bloku.

Podgrzej żywicę, aby ją zmiękczyć i wyciąć zaznaczony obszar.

Przyklej próbkę do szklanego pręta mocującego i przytnij ją.

Za pomocą ultramikrotomu przygotuj półcienkie i ultracienkie sekcje.

Przenieś sekcje półcienkie i ultracienkie odpowiednio na nośniki szklane i siatki niklowe.

Wybarwić półcienkie odcinki barwnikiem, który wiąże się z kwasami nukleinowymi, cytoplazmą bogatą w rybosomy i macierzą zewnątrzkomórkową.

Umyj skrawki i zbadaj je pod mikroskopem świetlnym, aby potwierdzić obecność obszaru docelowego.

Obserwuj ultracienkie skrawki pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym.

Tetratlenek osmu zwiększa gęstość elektronową błon komórkowych i organelli, zapewniając wysoki kontrast z cytoplazmą o mniejszej gęstości elektronów, umożliwiając wizualizację ultrastruktury komórkowej.

Aby zmapować obszar zainteresowania, należy wybrać obraz zawierający obszar zainteresowania z wcześniej przygotowanego atlasu obrazów. Naszkicuj granice obszaru zainteresowania na obrazie podzielonym na sekcje. Optycznie nałóż te obramowania na osadzoną próbkę pod mikroskopem i użyj jednocalowej igły o rozmiarze 26, aby zarysować te granice obszarów na próbce żywicy. Następnie podgrzej próbki do 95 stopni Celsjusza, aby zmiękczyć żywicę.

Następnie wyjmij ciepłe próbki żywicy z piekarnika i użyj żyletki, aby wyciąć interesujące obszary. Przyklej próbki do prętów mocujących ze szkła akrylowego o odpowiednim kalibrze i przytnij zamontowane próbki do pół- i ultracienkiego cięcia. Użyj ultramikrotomu, aby uzyskać półcienkie odcinki 0,7 mikrometra i ultracienkie 70 nanometrów, zbierając półcienkie odcinki na szklanych nośnikach i ultracienkie sekcje na siatkach niklowych.

Zabarwić półcienkie skrawki 1% błękitem toluidynowym w PBS przez cztery minuty, a następnie kilkakrotnie przepłukać w wodzie dejonizowanej przed zbadaniem skrawków za pomocą mikroskopii świetlnej. Ultracienkie przekroje można następnie bezpośrednio ocenić za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej przy napięciu 180 kilowoltów, bez dalszych modyfikacji.