Obrazowanie subkomórkowej dynamiki wapnia w neuronach Caenorhabditis elegans

Weź dwa oddzielne transgeniczne szczepy Caenorhabditis elegans na szkiełkach z podkładkami agarowymi. Klocki zawierają roztwór do toczenia z czynnikiem paraliżującym, który minimalizuje ruch.

Brzuszny rdzeń nerwowy robaków lub VNC zawiera pobudzające interneurony, które wyrażają cytoplazmatyczne wskaźniki wapnia w jednym szczepie i mitochondrialne wskaźniki wapnia w drugim.

Umieść szkiełko nakrywkowe, aby zwinąć robaki, ustawiając VNC do wizualizacji, a następnie umieść je pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Użyj światła widzialnego, aby zlokalizować robaki, a następnie przełącz się w tryb fluorescencji.

W neuronach spoczynkowych niski wewnątrzkomórkowy poziom wapnia utrzymuje wskaźniki niezwiązane, co powoduje słabą fluorescencję.

Spontaniczna aktywność neuronalna otwiera kanały wapniowe bramkowane napięciem, umożliwiając napływ wapnia.

W szczepie ze wskaźnikami cytoplazmatycznymi wapń wiąże się ze wskaźnikami, wzmacniając fluorescencję cytoplazmatyczną.

Nadmiar cytoplazmatycznego wapnia dostaje się do mitochondriów przez kanały. W szczepie ze wskaźnikami mitochondrialnymi wiązanie wapnia zwiększa fluorescencję mitochondriów.

Zobrazuj neurony w obu szczepach, aby monitorować subkomórkową dynamikę wapnia.

W szklanej probówce hodowlanej o wymiarach 13 na 100 milimetrów przygotuj 3 mililitry 10% agaru, rozpuszczając agar klasy molekularnej w M9 i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez kilka sekund. Aby zrobić płatki agarowe, najpierw przygotuj dwa szkiełka, dodając dwie warstwy taśmy laboratoryjnej. Następnie umieść szkiełko mikroskopowe między dwoma szkiełkami. Odetnij końcówkę końcówki do pipety o pojemności 1,000 mikrolitrów i użyj jej do odpipetowania małej kropli agaru na środek szkiełka nakrywkowego.

Spłaszcz agar, naciskając kolejny szkiełko na wierzchu agaru. Po schłodzeniu pokrój agar na mały krążek, korzystając z otworu w 10-mililitrowej probówce, a następnie usuń otaczający agar. Następnie przygotuj roztwór do walcowania robaków, rozpuszczając proszek muscymolu w M9, aby uzyskać 30-milimolowy zapas. Rozcieńczyć bulion w stosunku jeden do jednego kulkami polistyrenu, aby uzyskać roztwór do walcowania.

Aby ustawić robaka do obrazowania, najpierw umieść 1,6 mikrolitra roztworu do walcowania na środku podkładki agarowej. Następnie, używając preferowanego kilofa do robaków, przenieś robaka w pożądanym wieku do roztworu do toczenia na podkładce agarowej. Odczekaj około pięciu minut, aż muscimol zmniejszy ruch robaka, a następnie upuść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 na 22 milimetry na podkładkę agarową.

W celu zobrazowania neurytów w brzusznym rdzeniu nerwowym zwiń robaka, lekko przesuwając szkiełko nakrywkowe. Aby zamontować robaka na mikroskopie, umieść kroplę olejku immersyjnego na szkiełku nakrywkowym. Znajdź robaka za pomocą obiektywu o małym powiększeniu w jasnym polu. Następnie przełącz się na obiektyw 100X i zlokalizuj neuryt AVA za pomocą oświetlenia GCaMP lub mito-GCaMP z laserem obrazującym 488 nanometrów.