Przeprowadzanie niestandardowych eksperymentów z mikromacierzami mikroRNA

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie eksperymentu z mikromacierzą RNA. Osiąga się to poprzez uprzednie pozyskanie drukowanych szkiełek z mikromacierzy, które zawierają bibliotekę sond mikro RNA i przygotowanie próbek RNA o odpowiedniej jakości i ilości. Następnie próbka RNA i kontrolowanego DNA A jest znakowana barwnikami fluorescencyjnymi.

Następnie znakowane kwasy nukleinowe dodaje się do szkiełka mikromacierzy w celu hybrydyzacji. Na koniec szkiełko z mikromatrycą jest myte i skanowane, a szkiełko jest regenerowane. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują ekspresję mikroRNA w całym genomie poprzez analizę szkiełka pod kątem intensywności hybrydyzacji poszczególnych sond mikro RNA.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie ekspresji genów, takie jak to, w jaki sposób normalne warunki fizjologiczne lub zróżnicowane stany patologiczne wpływają na mikropotrzeby ekspresji w skali globalnej. Jakość wykonania mikromacierzy jest jednym z najważniejszych czynników decydujących o powodzeniu eksperymentu z mikromacierzami. Po wyizolowaniu RNA przy użyciu metody, która zachowuje małe RNA i ponownym zawieszeniu go w stężeniu równym lub większym niż dwa miligramy na mililitr, znakuje RNA w objętości reakcyjnej 20 mikrolitrów, najpierw mieszając około 25 mikrogramów całkowitego RNA z 0,5 mikrograma pięciu pierwszych P-C-U-D-Y 5 4 7 3 prime w jednym buforze X HEPs uzupełnionym T four RNA Ligaza 1D TT, oraz TP. Jeśli dostępnych jest mniej RNA, zmniejsz ilość RNA i reakcję.

Jeśli RNA jest bardzo rozcieńczony, dodaj nośnik, taki jak drożdże, TRNA, aby pomóc w wytrącaniu, inkubuj reakcję na lodzie w lodówce przez dwie do 24 godzin. Następnie dodaj octan sodu do 0,3 mola, a następnie trzy objętości etanolu i wytrącaj RNA przez noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby użyć szkiełek po raz pierwszy, należy je wstępnie zhybrydyzować w przefiltrowanym roztworze trzech XSSC, 0,1% SDS i 0,2% BSA przez 30 do 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie zanurz zjeżdżalnie kilka razy w wodzie. Następnie w izopropanolu wysuszyć szkiełka za pomocą wirówki z adapterem szkiełka o temperaturze 100 razy G przez pięć minut w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Opłucz paski podnośnika w wodzie.

Następnie w etanolu przed wysuszeniem na powietrzu umieść szkiełko w podstawie komory hybrydyzacyjnej mikromacierzy, a podnośnik na górze szkiełka, tak aby ślizg podnośnika zakrył obszar sondy i jej białe paski. Skontaktuj się ze szkiełkiem w ciemności, odkręć wytrącony oznaczony RNA, umyj go raz 70% etanolem i wysusz granulkę na powietrzu. Granulka powinna mieć czerwonawy kolor.

Przygotuj roztwór hybrydyzacyjny, używając jednej 15 do jednej setnej objętości oczyszczonego, znakowanego referencyjnego DNA na próbkę RNA Całkowicie rozpuść osad RNA w około 60 mikrolitrach roztworu hybrydyzacyjnego, aby upewnić się, że roztwór hybrydyzacyjny nie wyschnie. Podczas inkubacji dodaj 20 mikrolitrów wody do każdej ze studzienek nawilżających. W podstawie komory hybrydyzacyjnej mikromacierzy.

Dodaj mieszaninę znakowanego RNA i referencyjnego DNA do szkiełka. Za pomocą cienkiej końcówki pipety delikatnie dotknij krawędzi ślizgu podnośnika i poprzez ssanie. Pozwól, aby roztwór wszedł do przestrzeni między ślizgiem podnośnika a ślizgiem podnośnika.

Umieść pokrywę komory hybrydyzacji na podstawie. Następnie uszczelnij komorę metalowymi klipsami. Umieść całą komorę w plastikowej torbie dołączonej do kasety komory.

Na koniec umieść kasetę komory w pojemniku z mokrym ręcznikiem papierowym. Następnie przykryj pojemnik folią spożywczą i umieść go w inkubatorze do hodowli komórkowych o wilgotności 37 stopni Celsjusza na około 24 godziny. Aby przetworzyć szkiełka po hybrydyzacji, należy zdemontować kasety komory jedna po drugiej, zanurzyć szkiełko, a jego podnośnik ześlizgnąć się w dwóch XSSC w temperaturze 22 stopni Celsjusza.

Poślizg podnośnika w naturalny sposób spadnie ze zjeżdżalni, umyj szkiełka w 0.8 XSSC dwa razy, a następnie trzy razy w 0.4 XSSC w sumie od jednej do dwóch minut. Wysuszyć szkiełka za pomocą wirówki z adapterem do szkiełek. Następnie zeskanuj slajdy za pomocą skanera mikrotablicowego i użyj programu, takiego jak blue fuse, aby określić ilościowo intensywności w plikach obrazów.

Sprawdź poszczególne miejsca, aby wykluczyć nieprawidłowe plamy, które zwykle powstają w wyniku drukowania szkiełek porowych lub obsługi szkiełka po hybrydyzacji. Do analizy i prezentacji danych użyj programów, takich jak Gene Springing i Excel, aby ponownie wykorzystać mikromacierz. Zdejmij szkiełko, płucząc je w wodzie, a następnie zanurzając w naczyniu barwiącym z podgrzanym jednomilimolowym NAOH i 0,1 XSSC w temperaturze 62 stopni Celsjusza na 10 do 20 minut.

Powtórz inkubację po raz drugi. Umyj szkiełka kilka razy w wodzie do 60 minut, delikatnie wstrząsając w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Wysuszyć szkiełka za pomocą wirówki i przechowywać w temperaturze 22 stopni Celsjusza.

Szkiełka mogą być używane bez wstępnej hybrydyzacji. Rysunek ten przedstawia zeskanowany obraz mikromacierzy wykazujący bardzo precyzyjne i silne sygnały hybrydyzacji. Czerwone plamki wynikały z hybrydyzacji referencyjnego DNA, zielone plamki z próbki RNA znakowanej DY 5 47, a żółte plamki pochodziły z hybrydyzacji zarówno DNA, jak i RNA z tymi samymi sondami.

Współczynniki korelacji Pearsona między technicznymi powtórzeniami hybrydyzacji mikromacierzy wynoszą około 0,99, co wskazuje na doskonałą odtwarzalność. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić niestandardowy eksperyment mikrorentgenowski, nie tylko w celu ilościowego określenia mikronazy, ale także w celu ilościowego określenia innych rodzajów kwasów nukleinowych, takich jak mRNA.