Name: Przeprowadzanie niestandardowych eksperymentów z mikromacierzami mikroRNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Naucz się przeprowadzać niestandardowe eksperymenty z mikromacierzami mikroRNA, obejmujące izolację RNA, etykietowanie fluorescencyjne, hybrydyzację i analizę sygnałów. Ta metoda umożliwia kompleksowe badanie ekspresji mikroRNA na skalę genomową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca została częściowo sfinansowana przez National Institute of Drug Abuse Center (P50 DA 011806) oraz United States Army Department of Defense (W81XWH-07-1-0183).

1. Drukowanie niestandardowych mikromacierzy miRNA
<ol>
	<li>Wydrukuj szkiełka do mikromacierzy, korzystając z usług centralnego laboratorium mikromacierzy na uniwersytecie lub w firmie komercyjnej. Jakość wykonania mikromacierzy jest jednym z krytycznych czynników wpływających na powodzenie eksperymentu. Jeśli to możliwe, przetestuj kilka różnych usług. Idealnie byłoby wydrukować od 50 do 100 szkiełek jednocześnie, tak aby wszystkie wyglądały identycznie, z dobrze oddzielonymi, pojedynczymi plamkami.</li>
	<li>Jako podłoże do mikromacierzy stosujemy szkiełka powlekane GAPS II.</li>
	<li>Do sond miRNA wykorzystujemy zestaw sond NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2.</li>
	<li>Rozpuść wszystkie oligonukleotydy w 3 x SSC do stężenia 10 μM i wydrukuj je na szkiełkach w czterech kopiach. Utrwal szkiełka poprzez naświetlanie promieniami ultrafioletowymi zgodnie z instrukcją dla szkiełek GAAPS II. Oznacz szkiełko za pomocą rysika diamentowego, aby wskazać obszar i stronę z wydrukowanymi sondami. Przechowuj w temperaturze 22°C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Do izolacji RNA można użyć dowolnej metody lub odczynnika, o ile zapewnia ona zachowanie małych RNA. Zazwyczaj do ekstrakcji całkowitego RNA stosujemy Trizol (Invitrogen), co pozwala uzyskać satysfakcjonującą ilość i jakość preparatów RNA, ocenianą na podstawie pomiarów A260nm i A280nm.</li>
	<li>W celu znakowania RNA należy zmieszać ˜ 25 μg całkowitego RNA z 0,5 μg 5'-pCU-DY547-3' 6 w 1 x buforze (50 mM HEPES, pH 7,8, 20 mM MgCl2, 10 μg/ml BSA, 10% DMSO) zawierającym ˜ 20 jednostek ligazy RNA T4 1, uzupełnionym o ˜ 10 mM DTT oraz ˜ 0,02-0,03 objętości końcowej 10 x buforu ligazy RNA T4 1 w celu dostarczenia ATP.</li>
	<li>Znakowanie powinno przebiegać na lodzie wewnątrz lodówki przez 2-24 godziny. RNA należy wytrącić za pomocą 0,3 M octanu sodu i 3 objętości etanolu. Aby zapewnić efektywną ligację i wytrącanie, całkowite RNA należy rozpuścić w stężeniu powyżej 2 mg/ml, a całkowitą objętość reakcji ligacji utrzymać na poziomie ˜ 20 μl.
	<ol>
		<li>W przypadku dostępności mniejszej ilości RNA, ilość RNA wejściowego oraz 5'-pCU-DY547-3' można proporcjonalnie zmniejszyć.</li>
		<li>Jeśli RNA jest bardzo rozcieńczone, należy dodać nośnik, taki jak tRNA drożdżowe, aby wspomóc wytrącanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu stworzenia kontroli procesu hybrydyzacji należy połączyć i oznakować łącznie 1 μg oligonukleotydów referencyjnego DNA odpowiadających podzbiorowi ssaczych miRNA, używając zestawu Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit 6. Oznakowane DNA należy oczyścić za pomocą kolumny CentriSep i przechowywać w ciemności w temperaturze -20°C.</li>
</ol>
3. Hybrydyzacja mikromacierzy
<ol>
	<li>Aby użyć szkiełek po raz pierwszy, należy przeprowadzić wstępną hybrydyzację szkiełek w przefiltrowanym roztworze 3 x SSC, 0,1% SDS, 0,2% BSA przez 30-60 min w temperaturze 37 °C. Zanurz je kilka razy w wodzie, a następnie w izopropanolu. Wysusz szkiełka w wirówce z adapterem do szkiełek przy 100 g przez 5 min w temperaturze 22°C.</li>
</ol>
Uwaga: Do przeprowadzania hybrydyzacji mikromacierzy wykorzystujemy komory hybrydyzacyjne do mikromacierzy firmy Corning oraz Lifterslipy z serii mSeries firmy Erie Scientific.
<ol start="2">
	<li>Przepłucz paski podnoszące w wodzie, a następnie w etanolu, po czym wysusz je na powietrzu. Umieść szkiełko w podstawie komory do hybrydyzacji mikromacierzy, a na szkiełku połóż pasek podnoszący. Pasek podnoszący powinien zakrywać obszar sond, tak aby jego białe paski stykały się ze szkiełkiem.</li>
	<li>W ciemności odwiruj osadzone, znakowane RNA. Przepłucz je raz 70% etanolem, a następnie wysusz osad na powietrzu. Osad powinien mieć czerwonkawy kolor.</li>
	<li>Przygotuj roztwór do hybrydyzacji zawierający 400 mM Na2HPO4 pH 7.0, 0,8% BSA, 5% SDS, 12% formamidu 6 z dodatkiem 1/15-1/100 μl oczyszczonego, znakowanego referencyjnego DNA (2.4) na każdą próbkę RNA. Ilość dodanego referencyjnego DNA zależy od liczby znakowanych różnych oligonukleotydów (2.4). Jeśli jest ich ponad 100, wymagane jest mniejsze rozcieńczenie.</li>
	<li>Dokładnie rozpuść osad RNA w ˜ 60 μl roztworu do hybrydyzacji.</li>
	<li>Dodaj 20 μl wody do każdego z dołków nawilżających w podstawie komory do hybrydyzacji mikromacierzy firmy Corning.</li>
	<li>Nanieś mieszaninę znakowanego RNA i referencyjnego DNA na szkiełko. Używając cienkiego końcówki do pipety, delikatnie dotknij krawędzi paska podnoszącego, pozwalając roztworowi wniknąć w przestrzeń między paskiem a szkiełkiem poprzez siły kapilarne.</li>
	<li>Nałóż pokrywę komory hybrydyzacyjnej na podstawę, a następnie uszczelnij komorę metalowymi klipsami.</li>
	<li>Włóż całą komorę do plastikowej torebki dołączonej do kasety komory firmy Corning.</li>
	<li>Umieść kasetę(y) do komory w pojemniku z wilgotnym ręcznikiem papierowym; przykryj pojemnik folią spożywczą i umieść go w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37°C i wysokiej wilgotności przez ˜ 24 godziny. Środki ostrożności te (3.6, 3.9, 3.10) zapewniają, że roztwór do hybrydyzacji nie wyschnie podczas inkubacji.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie po hybrydyzacji
<ol>
	<li>Rozmontuj kasety z komór jedna po drugiej. Zanurz szkiełko i dołączoną do niego listewkę (lifterslip) w 2 x SSC w temperaturze 22°C. Listewka naturalnie oddzieli się od szkiełka. Umieść ją w 0.8 x SSC. Przemyj szkiełka w 0.8 x SSC dwukrotnie, a następnie trzykrotnie w 0.4 x SSC, łącznie przez 1-2 min. Osusz szkiełka za pomocą wirówki z adapterem do szkiełek. Przemyj listewki wodą i zachowaj do ponownego użycia.</li>
	<li>Zeskanuj szkiełka za pomocą dowolnego odpowiedniego skanera, np. Perkin Elmer ScanArray 5000 lub skanera mikromacierzy Molecular Devices Axon GenePix 4000B. Skanowanie przeprowadź przy długościach fal bliskich 547 nm i 647 nm, aby uzyskać odpowiednie pliki obrazów.</li>
	<li>Użyj programów takich jak BlueFuse do kwantyfikacji intensywności pikseli w plikach obrazów wejściowych (z punktu 4.2). Przejrzyj poszczególne plamki za pomocą programu, aby wykluczyć z dalszej analizy plamki nieprawidłowe na mikromacierzach. Plamki te powstają zazwyczaj w wyniku wadliwego nadruku na szkiełku lub niewłaściwego obchodzenia się ze szkiełkiem po hybrydyzacji.</li>
	<li>Do analizy i prezentacji danych wykorzystaj programy takie jak GeneSpring oraz Excel. Stosuje się ogólne zasady normalizacji danych z mikromacierzy, co wykracza poza zakres niniejszego opracowania.</li>
	<li>Po uzyskaniu satysfakcjonujących sygnałów w punkcie 4.3), oczyść szkiełka mikromacierzy w celu ich ponownego wykorzystania 7. Przepłucz szkiełka wodą, a następnie zanurz w uprzednio podgrzanym roztworze 1 mM NaOH i 0.1 x SSC w kuwecie do barwienia w temperaturze 62°C przez 10-20 minut. Powtórz inkubację raz. Przemyj szkiełka kilka razy wodą przez maksymalnie 60 minut, delikatnie wstrząsając w temperaturze 22°C. Osusz szkiełka za pomocą wirówki i przechowuj w temperaturze 22°C.</li>
	<li>W przypadku korzystania z regenerowanych szkiełek ponowna prehybrydyzacja nie jest konieczna. Wystarczy przemyć je wodą, a następnie izopropanolem i osuszyć bezpośrednio przed hybrydyzacją.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
W dużej mierze zastosowaliśmy opisane procedury w celu profilowania globalnej ekspresji miRNA w tysiącach próbek, tj. w RNA wyizolowanym z okazów od rybek danio po ludzi w wielu różnych warunkach. Rysunek 1 przedstawia zeskanowany obraz mikromacierzy, demonstrujący bardzo precyzyjne i silne sygnały hybrydyzacji na szkiełku. Współczynniki korelacji Pearsona pomiędzy powtórzeniami technicznymi hybrydyzacji mikromacierzy wynoszą ˜ 0,99 7, co wskazuje na doskonałą powtarzalność.
<img alt="Schemat ekspresji genów w mikromacierzy z czerwonymi i zielonymi sygnałami fluorescencyjnymi do analizy porównawczej." src="/files/ftp_upload/3250/3250fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1 Obraz kompozytowy zeskanowanej płytki mikromacierzy miRNA po hybrydyzacji. Czerwone plamki powstały w wyniku hybrydyzacji referencyjnego DNA, zielone plamki z próbki RNA znakowanej DY547, natomiast żółte plamki powstały w wyniku hybrydyzacji zarówno DNA, jak i RNA do tych samych sond.

<ol><li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functions+of+animal+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The functions of animal microRNAs.</a> Nature. 431, 350-355 (2004).</li>
<li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2009).</li>
<li>Chekulaeva, M., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+miRNA-mediated+post-transcriptional+regulation+in+animal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of miRNA-mediated post-transcriptional regulation in animal cells.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 452-460 (2009).</li>
<li>Farazi, T. A., Spitzer, J. I., Morozov, P., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">miRNAs in human cancer.</a> J. Pathol. 223, 102-115 (2011).</li>
<li>Small, E. M., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pervasive+roles+of+microRNAs+in+cardiovascular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pervasive roles of microRNAs in cardiovascular biology.</a> Nature. 469, 336-342 (2011).</li>
<li>Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+custom+microarray+platform+for+analysis+of+microRNA+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression.</a> Nat. Methods. 1, 47-53 (2004).</li>
<li>Zhang, X., Xu, W., Tan, J., Zeng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stripping+custom+microRNA+microarrays+and+the+lessons+learned+about+probe%3Aslide+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Stripping custom microRNA microarrays and the lessons learned about probe:slide interactions.</a> Anal. Biochem. 386, 222-227 (2009).</li>
<li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+tools+for+microRNA+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucl. Acids. Res. 36, D154-D158 (2008).</li>
<li>Landgraf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+microRNA+expression+atlas+based+on+small+RNA+library+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing.</a> Cell. 129, 1401-1414 (2007).</li>
<li>Chiang, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs%3A+experimental+evaluation+of+novel+and+previously+annotated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes.</a> Genes. Dev. 24, 992-1009 (2010).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Pomimo niedawnego postępu w technologiach głębokiego sekwencjonowania, mikromacierze pozostają opłacalnym wyborem do wysokoprzepustowej analizy DNA i RNA. W porównaniu z głębokim sekwencjonowaniem, eksperymenty z wykorzystaniem mikromacierzy są tańsze, a typowe laboratorium biologii molekularnej może przeprowadzić większość badań i analizę danych we własnym zakresie, co zapewnia elastyczność i oszczędność czasu. W przyszłości mikromacierze prawdopodobnie będą dobrze dostosowane do intensywnego badania zestawów genów, np....

<table><tbody><tr><td>NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2</td><td>Invitrogen</td><td>MIRMPS201</td><td>Zaprojektowany na podstawie miRBase Release 9.0 (październik 2006). Zawiera &amp;#732; 1 140 niemodyfikowanych oligonukleotydów o długości 34-44 nt służących jako sondy dla miRNA nicieni, muchy, danio pręgowanego, myszy, szczura i człowieka oraz szereg sond kontrolnych wewnętrznych, takich jak snoRNA. Sondy miRNA są dubletami sekwencji komplementarnych do dojrzałych miRNA, stąd ich rozmiar wynoszący &amp;#732; 44 nt. Do analizy można wybrać miRNA z konkretnego genomu lub genomów, które są przedmiotem zainteresowania.</td></tr><tr><td>Trizol </td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>Do znakowania wykorzystano również wzbogaconą frakcję małych RNA, choć próbki całkowitego RNA są szybsze i łatwiejsze w przygotowaniu oraz kwantyfikacji i nadają się do dalszych zastosowań, takich jak analiza mRNA.</td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit</td><td>Invitrogen</td><td>U21660</td><td>Ten zestaw lub podobne produkty mogą być również użyte do znakowania eksperymentalnych próbek RNA lub kontrolnego RNA (zamiast kontrolnego DNA).</td></tr><tr><td>5&amp;rsquo;-pCU-DY547-3&amp;rsquo;</td><td>Dharmacon</td><td>Custom made</td><td>Frakcję małych RNA można w podobny sposób oznakować poprzez ligację.</td></tr><tr><td>Kolumny CentriSep </td><td>Princeton Separations</td><td>CS-901</td><td></td></tr><tr><td>Przeszkło GAPSII coated slide</td><td>Corning</td><td>40004</td><td>Można stosować również inne rodzaje szkiełek.</td></tr><tr><td>Komory do hybrydyzacji mikromacierzy</td><td>Corning</td><td>2551 lub 40080</td><td>Inne rodzaje komór do hybrydyzacji i lamelle również powinny być skuteczne. Stosowanie komercyjnie dostępnych urządzeń do hybrydyzacji może znacząco skrócić czas hybrydyzacji, np. do &amp;#732; 2 godzin.</td></tr><tr><td>Lifterslips</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>25X60I-M5439-001-LS</td><td></td></tr><tr><td>BlueFuse</td><td>BlueGenome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GeneSpring</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przeprowadzanie niestandardowych eksperymentów z wykorzystaniem mikromacierzy mikrorna

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

mikroRNA (miRNA) to liczna rodzina &tilde; cząsteczki RNA o długości 22 nukleotydów (nt), które są szeroko ekspresjonowane u eukariotów 1Złożone genomy kodują co najmniej setki miRNA, które hamują głównie ekspresję ogromnej liczby genów docelowych na poziomie potranskrypcyjnym. 2, 3miRNA kontrolują szeroki zakres procesów biologicznych 1Ponadto zmieniona ekspresja miRNA była wiązana z chorobami ludzi, takimi jak nowotwory, a miRNA mogą służyć jako biomarkery chorób oraz rokowań. 4, 5W związku z tym istotne jest zrozumienie ekspresji i funkcji miRNA w wielu różnych warunkach.
Do profilowania ekspresji miRNA zastosowano trzy główne podejścia: PCR w czasie rzeczywistym, mikromacierze oraz sekwencjonowanie głębokie. Technika mikromacierzy miRNA ma tę zaletę, że jest wysokoprzepustowa, zazwyczaj tańsza, a większość etapów eksperymentalnych i analitycznych można przeprowadzić w laboratorium biologii molekularnej w większości uniwersytetów, szkół medycznych i powiązanych z nimi szpitali. W niniejszej pracy opisujemy metodę przeprowadzania niestandardowych eksperymentów z użyciem mikromacierzy miRNA. Zestaw sond miRNA zostanie naniesiony na szklane slajdy w celu wytworzenia mikromacierzy miRNA. RNA izoluje się przy użyciu metody lub odczynnika, który zachowuje małe frakcje RNA, a następnie znakuje barwnikiem fluorescencyjnym. W ramach kontroli referencyjne oligonukleotydy DNA odpowiadające podzbiorowi miRNA są również znakowane innym barwnikiem fluorescencyjnym. Referencyjne DNA posłuży do wykazania jakości slajdu i hybrydyzacji, a także zostanie wykorzystane do normalizacji danych. RNA i DNA są mieszane i hybrydyzowane ze slajdem mikromacierzy zawierającym sondy dla większości miRNA znajdujących się w bazie danych. Po przemyciu slajd jest skanowany w celu uzyskania obrazów, a następnie kwantyfikuje się intensywność poszczególnych plamek. Surowe sygnały te zostaną następnie przetworzone i przeanalizowane jako dane dotyczące ekspresji odpowiadających im miRNA. Slajdy mikromacierzy można poddać procesowi usuwania sond i regeneracji w celu obniżenia kosztów oraz zwiększenia spójności eksperymentów. Te same zasady i procedury mają zastosowanie do innych rodzajów niestandardowych eksperymentów z wykorzystaniem mikromacierzy.

Opisano prostą procedurę przeprowadzania niestandardowych eksperymentów z wykorzystaniem mikromacierzy mikroRNA. Kroki obejmują izolację RNA, znakowanie RNA i DNA referencyjnego, hybrydyzację próbek z mikromacierzami, skanowanie mikromacierzy oraz kwantyfikację i analizę sygnałów hybrydyzacji.

Przeprowadzanie niestandardowych eksperymentów z wykorzystaniem mikromacierzy mikroRNA

mikroRNA (miRNA) to liczna rodzina cząsteczek RNA o długości około 22 nukleotydów (nt), które wykazują szeroką ekspresję u eukariotów 1. Złożone genomy kodują ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie eksperymentu z wykorzystaniem mikromacierzy mikroRNA. Jest to realizowane poprzez najpierw pozyskanie nadruków szkiełek mikromacierzowych zawierających bibliotekę sond mikroRNA oraz przygotowanie próbek RNA o odpowiedniej jakości i ilości. Następnie próbki RNA i kontrolowana próbka DNA są znakowane barwnikami fluorescencyjnymi.Następnie znakowane kwasy nukleinowe są dodawane do płytki mikroarray w celu hybrydyzacji. Na koniec płytka mikroarray jest płukana, skanowana i regenerowana. W rezultacie można uzyskać dane obrazujące ekspresję microRNA w całym genomie poprzez analizę intensywności hybrydyzacji poszczególnych sond microRNA na płytce.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie ekspresji genów, takie jak wpływ normalnych warunków fizjologicznych lub stanów patologicznych na ekspresję mikroRNA w skali globalnej. Jakość wykonania macierzy mikroarray jest jednym z krytycznych czynników warunkujących sukces eksperymentu. Po wyizolowaniu RNA metodą zachowującą małe RNA i ponownym zawieszeniu go w stężeniu równym lub wyższym niż 2 mg/mL, należy znakować RNA w objętości reakcyjnej 20 µL, mieszając początkowo około 25 µg całkowitego RNA z 0,5 µg 5' P-C-U-D-Y 5 4 7 3' w buforze 1X HEPs uzupełnionym o T4 RNA Ligase 1D TT oraz ATP. Jeśli dostępna jest mniejsza ilość RNA, należy proporcjonalnie zmniejszyć ilość RNA oraz objętość reakcji.Jeśli RNA jest bardzo rozcieńczone, należy dodać nośnik, taki jak tRNA drożdżowy, aby wspomóc precypitację, a następnie inkubować reakcję na lodzie w lodówce od 2 do 24 godzin. Następnie należy dodać octan sodu do stężenia 0,3 M, a potem trzy objętości etanolu i precypitować RNA przez noc w temperaturze -20 °C. Przy pierwszym użyciu szkiełek należy przeprowadzić prehybrydyzację w przefiltrowanym roztworze 3 XSSC, 0,1% SDS i 0,2% BSA przez 30 do 60 minut w temperaturze 37 °C.Następnie zanurz preparaty kilka razy w wodzie. Potem w izopropanolu, a następnie wysusz preparaty w wirówce z adapterem do szkiełek przedmiotowych przy 100 ×g przez pięć minut w temperaturze 22 °C. Opłucz paski do podnoszenia w wodzie.Następnie, przed suszeniem na powietrzu w etanolu, umieść szkiełko wewnątrz podstawy komory do hybrydyzacji mikroarrayów, a na szkiełku płytkę dystansową w taki sposób, aby zakrywała ona obszar sond oraz białe paski. W ciemności dociśnij szkiełko, odwiruj osadzone znakowane RNA, przemyj je raz 70% etanolu i wysusz osad na powietrzu. Osad powinien mieć czerwonkawy kolor.Przygotuj roztwór do hybrydyzacji, stosując od 1/15 do 1/100 objętości oczyszczonego znakowanego referencyjnego DNA na każdą próbkę RNA. Całkowicie rozpuść osad RNA w około 60 µl roztworu do hybrydyzacji, aby zapobiec wyschnięciu roztworu. Podczas inkubacji dodaj 20 µl wody do każdego z otworów nawilżających w podstawie komory hybrydyzacyjnej mikromacierzy.Nanieś mieszaninę znakowanego RNA i referencyjnego DNA na szkiełko. Za pomocą cienkiej końcówki pipety delikatnie dotknij krawędzi szkiełka przykrywnego i poprzez ssanie doprowadź do wprowadzenia roztworu w przestrzeń między szkiełkiem przykrywnym a podstawowym.Umieść pokrywę komory hybrydyzacyjnej na podstawie. Następnie zamknij komorę za pomocą metalowych zacisków. Włóż całą komorę do plastikowej torebki dołączonej do kasety komory.Na koniec umieść kasetę komorową w pojemniku z mokrym ręcznikiem papierowym. Następnie przykryj pojemnik folią spożywczą i umieść go w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37°C na około 24 godziny. Aby przetworzyć preparaty po hybrydyzacji, rozmontuj kasety komorowe jedna po drugiej i zanurz slajd wraz z szybką przykrywającą w 2XSSC w temperaturze 22°C.Podkładka do przesuwania samoczynnie oddzieli się od szkiełka; należy przemyć szkiełka dwukrotnie w 0,8 XSSC, a następnie trzykrotnie w 0,4 XSSC, tak aby całkowity czas płukania wynosił od jednej do dwóch minut. Osuszyć szkiełka za pomocą wirówki z adapterem do szkiełek. Następnie należy zeskanować szkiełka skanerem do mikromacierzy i użyć programu takiego jak Blue Fuse w celu kwantyfikacji intensywności w plikach obrazów.Zbadaj poszczególne plamki, aby wykluczyć plamki anormalne, które zazwyczaj powstają w wyniku drukowania płytek porowych lub manipulowania płytkami po hybrydyzacji. Do analizy i prezentacji danych wykorzystaj programy takie jak gene springing oraz excel w celu ponownego wykorzystania mikromacierzy. Usuń hybrydyzaty z płytki, płucząc ją w wodzie, a następnie zanurzając w kuwecie barwiącej z uprzednio podgrzanym 1 mM NaOH oraz 0,1 XSSC w temperaturze 62 °C przez 10 do 20 minut.Powtórz inkubację po raz drugi. Przemyj preparaty kilka razy w wodzie przez maksymalnie 60 minut, delikatnie wstrząsając przy temperaturze 22 °C. Osusz preparaty za pomocą wirówki i przechowuj w temperaturze 22 °C.Preparaty można wykorzystać bez wstępnej hybrydyzacji. Rycina przedstawia zeskanowany obraz mikromacierzy wykazujący bardzo precyzyjne i silne sygnały hybrydyzacyjne. Czerwone plamki są wynikiem hybrydyzacji referencyjnego DNA, zielone plamki pochodzą z próbki RNA znakowanej DY 5 47, a plamki żółte powstały w wyniku hybrydyzacji zarówno DNA, jak i RNA do tych samych sond.Współczynniki korelacji Pearsona pomiędzy powtórzeniami technicznymi hybrydyzacji mikromacierzy wynoszą około 0,99, co wskazuje na doskonałą powtarzalność. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przeprowadzania niestandardowego eksperymentu z użyciem mikromacierzy, nie tylko w celu ilościowego oznaczenia mikronukleaz, ale także innych rodzajów kwasów nukleinowych, takich jak mRNA.

performing-custom-microrna-microarray-experiments

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przeprowadzanie niestandardowych eksperymentów mikromacierzowych miRNA

Zaprezentujemy konfigurację i analizę tablic 96-dołkowych pre-microRNA do QPCR, przeprowadzonych zarówno przy użyciu robota, jak i ręcznie za pomocą wielokanałowej pipety Thermo Scientific Matrix.

Profilowanie pre-microRNA i microRNA z wykorzystaniem matryc ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany protokół multipleksowej ilościowej reakcji polimerazy w odwrotnej transkrypcji (qRT-PCR) w połączeniu z platformą mikroprzepływową, stanowiący efektywne pod względem kosztów i czasu narzędzie do wysokoprzepustowego przesiewowania poziomów ekspresji mikroRNA (miRNA), szczególnie w przypadku pracy z ograniczoną ilością materiału próbnego.

Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: zoptymalizowana wielokanałowa qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM

Ten film opisuje technikę badania ekspresji białek w transfekowanych komórkach raka płuc transfekowanych miRNA za pomocą mikromacierzy przeciwciał do pomiaru ekspresji określonych genów. W przedstawionym protokole wykonujemy mikromacierz przeciwciał w celu identyfikacji aktywności kombinatorycznego leczenia miRNA w zatrzymywaniu cyklu komórkowego i angiogenezie.

Mikromacierz przeciwciał: technika badania ekspresji białek w komórkach raka płuc leczonych miRNA

Obecność stabilnych mikroRNA (miRNA) w egzosomach wzbudziła ogromne zainteresowanie jako nowy sposób komunikacji międzykomórkowej, ze względu na ich potencjalną użyteczność jako biomarkery i jako droga do interwencji terapeutycznej. Tutaj demonstrujemy oczyszczanie egzosomów z krwi i pożywek hodowlanych, a następnie ilościowy PCR w celu identyfikacji transportowanych miRNA.

Oczyszczanie i profilowanie mikroRNA egzosomów pochodzących z krwi i pożywek hodowlanych

Sygnalizacja molekularna zarówno przez estrogen, jak i mikroRNA jest kluczowa dla rozwoju i wzrostu raka piersi. Estrogen aktywuje receptory estrogenowe, które są czynnikami transkrypcyjnymi. Wiele czynników transkrypcyjnych może regulować ekspresję mikroRNA, a mikroRNA regulowane estrogenem można profilować przy użyciu różnych technik na dużą skalę.

Profilowanie regulowanych estrogenem mikroRNA w komórkach raka piersi

Krążące mikroRNA pojawiły się ostatnio jako obiecujące i nowe biomarkery dla różnych nowotworów i innych chorób. Celem tego artykułu jest omówienie trzech różnych platform i metod PCR w czasie rzeczywistym opartych na sondach, które są dostępne do ilościowego określania i określania obfitości krążących mikroRNA.

Oparte na sondzie podejścia PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego pomiaru mikroRNA

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół przyjęty w badaniu przesiewowym BioMILD w celu przeprowadzenia testu klasyfikatora sygnatury krążącego mikroRNA do wczesnego wykrywania raka płuc.

Płynna biopsja na bazie mikroRNA: doświadczenia z klasyfikatorem sygnatury miRNA w osoczu (MSC) do badań przesiewowych w kierunku raka płuc

Tutaj opisujemy metodę oceny ekspresji miRNA w płucach, które zgodnie z przewidywaniami regulują geny zapalne, używając myszy wystawionych na działanie ozonu lub przefiltrowanego powietrza na różnych etapach cyklu rujowego.

Profilowanie mikroRNA płuc w cyklu rujowym u myszy narażonych na działanie ozonu

Ten protokół wykorzystuje opartą na sondzie reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR), test sulforodaminy B (SRB), klonowanie 3' nietranslowanych regionów (3' UTR) oraz test lucyferazy w celu weryfikacji docelowych genów interesującego miRNA i zrozumienia funkcji miRNA.

Protokół in vitro do oceny poziomów, funkcji i powiązanych genów docelowych w komórkach nowotworowych

Tutaj opisujemy krok po kroku strategię izolowania małych RNA, wzbogacania mikroRNA i przygotowywania próbek do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Następnie opisujemy, jak przetwarzać odczyty sekwencji i dopasowywać je do mikroRNA za pomocą narzędzi open source.

Kompletny potok do izolowania i sekwencjonowania mikroRNA oraz analizowania ich przy użyciu narzędzi open source

Opracowaliśmy test reporterowy biogenezy mikroRNA do wykorzystania w komórkach in vitro z czterema plazmidami: jeden z miRNA intronicznym, jeden z celem, jeden do nadekspresji białka regulatorowego i jeden dla lucyferazy Renilla. MiRNA zostało przetworzone i mogło kontrolować ekspresję lucyferazy poprzez wiązanie się z sekwencją docelową.

Test reporterowy do analizy dojrzewania intronowego mikroRNA w komórkach ssaków

Naucz się przeprowadzać niestandardowe eksperymenty z mikromacierzami mikroRNA, obejmujące izolację RNA, etykietowanie fluorescencyjne, hybrydyzację i analizę sygnałów. Ta metoda umożliwia kompleksowe badanie ekspresji mikroRNA na skalę genomową.

Przeprowadzanie niestandardowych eksperymentów z wykorzystaniem mikromacierzy mikroRNA

Przeglądaj więcej filmów