Kompletny potok do izolowania i sekwencjonowania mikroRNA oraz analizowania ich przy użyciu narzędzi open source

Opracowaliśmy zdefiniowany, powtarzalny i długotrwały protokół sekwencjonowania małych RNA i analizy znormalizowanych odczytów przy użyciu narzędzi bioinformatycznych typu open source. Głównymi zaletami naszej strategii jest to, że dokładnie zbiera mikroRNA poprzez oczyszczanie żelu oraz to, że analiza bioinformatyczna może być stosowana niezależnie od tego, w jaki sposób mikroRNA są zbierane. Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie mikroRNA może ujawnić wgląd w mechanizmy chorobowe, przetwarzanie mikroRNA i dokładną kwantyfikację podejść do terapii genowej, które dostarczają małe RNA.

Upewnij się, że pracujesz w środowisku wolnym od RNaz i trzymasz wszystkie produkty RNA na lodzie przez cały czas trwania procedury. Wizualizacja etapów cięcia żelu pomoże widzom zidentyfikować właściwy rozmiar produktów wymaganych do dalszych zastosowań. W przypadku ligacji trzema głównymi adaptorami połącz 11 mikrolitrów RNA z 1,5 mikrolitra wolnego od ATP bufora reakcyjnego ligazy 10X T4RNA, jednym mikrolitrem glikolu polietylenowego i 0,5 mikrolitra trzech głównych łączników.

Podgrzewaj próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza na termocyklerze przez 30 do 40 sekund, a następnie schładzaj na lodzie przez minutę. Dodaj jeden mikrolitr ligazy T4RNA dwa i inkubuj reakcję w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Podczas inkubacji próbek wlej 15% żel poliacyrylamidowy między oddzielone od 0,8 milimetra szklane płytki w plastikowym odlewie i włóż grzebień.

Gdy żel stężeje, dodaj 0,5 5X TBE do zbiornika i energicznie pipetować, aby umyć studzienki z resztek mocznika. Po wstępnym uruchomieniu żelu poliakrylamidowego przez 25 minut pod napięciem 375 woltów, należy załadować próbki, pozostawiając co najmniej jeden pas między każdą próbką. Załaduj 20 mikrolitrów co najmniej dwóch zestawów markerów w asymetryczny wzór, aby śledzić orientację żelu i uruchomić żel ze stałym napięciem 375 woltów.

Po 15 minutach zwiększ do stałego 425 woltów przez resztę biegu i uruchamiaj żel przez około dwie godziny. Pod koniec cyklu użyj separatora płytkowego, aby usunąć żel ze szklanych płytek i umieść żel na plastikowej osłonie strony. Rozcieńczyć pięć mikrolitrów bromku etydyny w 500 mikrolitrach wody destylowanej i dodać barwnik na pasy znaczników tuż nad górnym jasnoniebieskim znacznikiem.

Następnie użyj czystej żyletki, aby przeciąć żele od górnego do dolnego znacznika na każdym pasie w świetle ultrafioletowym i przenieś kawałki na kwadrat o wymiarach cztery na cztery centymetry laboratoryjnej folii uszczelniającej. Pokrój żel z około trzema nacięciami w poziomie i dwoma nacięciami w pionie, aby uzyskać 12 małych kwadratów. Dodaj 400 mikrolitrów 0,3-molowego chlorku sodu na folię uszczelniającą i poprowadź kawałki żelu do 1,5 mililitra silikonowanych probówek.

Mieszać próbki na nutatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka przenieś 400 mikrolitrów każdego supernatantu do nowych probówek. Dodaj jeden mililitr 100% etanolu i jeden mikrolitr 15 miligramów na mililitr glikogenu współstrącającego na probówkę.

Następnie przechowuj probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez godzinę. W przypadku podwiązania pięciu głównych łączników, najpierw odwiruj rozmrożone próbki i ponownie zawieś granulki w wodzie. Następnie dodaj 0,5 mikrolitra 100-mikromolowego łącznika pięciogłównego, jeden mikrolitr bufora ligazy T4RNA, jeden mikrolitr 10-milimolowego ATP i jeden mikrolitr glikolu polietylenowego do każdej próbki.

Podgrzej reakcje w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez 30 sekund przed umieszczeniem ich na lodzie. Następnie dodaj jeden mikrolitr ligazy T4RNA po jednym do każdej probówki i inkubuj reakcje w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. W celu odwrotnej transkrypcji należy pobrać próbki przez odwirowanie i ponownie zawiesić wysuszone na powietrzu osady w 8,25 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz.

Dodaj 0,5 mikrolitra 100-mikromolowego startera odwrotnej transkryptazy i pięć mikrolitrów 2-krotnej mieszanki reakcji odwrotnej transkryptazy z komplementarnego zestawu do syntezy DNA. Po trzech minutach w temperaturze 42 stopni Celsjusza dodaj 1,5 mikrolitra enzymu 10X odwrotnej transkryptazy do każdej próbki na 30-minutową inkubację w temperaturze 42 stopni Celsjusza w termocyklerze. Po neutralizacji przygotuj reakcję PCR z 29,5 mikrolitrami wody, pięcioma mikrolitrami buforu 10X taq, jednym mikrolitrem trifosforanu nukleozydu, dwoma mikrolitrami 25 mikromolowego startera do przodu, dwoma mikrolitrami 25 mikromolowego startera wstecznego, 0,5 mikrolitra polimerazy taq i 10 mikrolitrami odwrotnie transkrybowanego komplementarnego DNA.

Następnie przeprowadź dwie reakcje PCR. Do oczyszczenia żelu agarozowego przygotuj 4% żel agarozowy z niskotopliwą agarozą i załaduj 40 mikrolitrów lub więcej produktu PCR na żel z barwnikiem ładującym i 100 parami zasad i 25 znacznikami wielkości pary zasad. Po uruchomieniu żelu przeciąć opaskę powyżej pasma 125 par zasad i użyć zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta.

Wstrząsnąć w celu rozpuszczenia opaski żelowej w buforze w temperaturze pokojowej przed użyciem odpowiedniego sprzętu do ilościowego określenia końcowej biblioteki sekwencji. Następnie użyj odpowiednich narzędzi bioinformatycznych typu open source, aby przeanalizować dane sekwencji. W tej reprezentatywnej reakcji PCR na niskotopliwym żelu agarozowym można zaobserwować nabycie właściwego sklonowanego produktu w porównaniu z uzyskanym produktem łącznikowym oraz próbkami nienasyconymi w porównaniu z nasyconymi.

Po dopasowaniu do ludzkich spinek do włosów mikroRNA można zaobserwować silną zgodność między liczbą odczytanych mikroRNA w każdej kontrpróbie. Wykryto łącznie 306 gatunków mikroRNA, przy czym największa liczba odczytów odwzorowywała mikroRNA 122. Ważne jest, aby pamiętać o pocięciu żeli na odpowiednią wielkość, aby umożliwić dokładne odzyskanie mikroRNA.

Po sekwencjonowaniu mikroRNA użytkownicy mogą zastosować analizę bioinformatyczną w celu scharakteryzowania rozmieszczenia mikroRNA w tkankach będących przedmiotem ich zainteresowania. Technika ta została wykorzystana do określenia, w jaki sposób przetwarzane są mikroRNA i które zestawy mikroRNA są zmienione w niektórych nowotworach. Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z bromkiem etydyny i podczas patrzenia na żele w świetle ultrafioletowym.