Analiza migracji komórek grzebienia nerwowego tułowia przy użyciu zmodyfikowanego testu komory Zigmonda
January 19th, 2012
Opisano podejście do analizy migracji eksplantowanych komórek (komórek grzebienia nerwowego tułowia). Ta metoda jest niedroga, delikatna i zdolna do odróżnienia chemotaksji zarówno od chemokinezy, jak i innych wpływów na polarność migracyjną, takich jak te pochodzące z interakcji komórka-komórka w obrębie hodowli komórek grzebienia nerwowego pierwotnego tułowia.
Ogólnym celem tej procedury jest ocena zdolności cząsteczki do wywoływania chemotaksji i innych reakcji migracyjnych w eksplantowanych komórkach grzebienia nerwowego tułowia. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie cewek nerwowych na poziomie pnia o długości od około ośmiu do 15 somitów i hodowlę każdej z cew nerwowych przez noc na oddzielnych szkiełkach nakrywkowych pokrytych fibronektyną, aby umożliwić emigrację grzebienia nerwowego. Następnie wybiera się optymalną kulturę grzebienia nerwowego.
Cewę neuronową wyjmuje się z hodowli, a szkiełko nakrywkowe zawierające kulturę montuje się na zmodyfikowanej komorze zygmuntowej tak, aby najprostsza granica kultury była równoległa do wektora gradientu molekularnego, który ma być zastosowany w poprzek kultury. Trzecim krokiem jest wygenerowanie gradientu molekularnego w poprzek hodowli, a następnie sfilmowanie migracji obwodowych komórek grzebienia nerwowego wzdłuż wcześniej wybranej prostej granicy hodowli. Ostatnim krokiem jest śledzenie i analizowanie migracji obwodowych komórek grzebienia nerwowego umieszczonych wzdłuż wybranej granicy kultury za pomocą oprogramowania Image J.
Ostatecznie można określić, czy wybrana cząsteczka może zmienić kierunkowość komórki lub inne cechy migracji, takie jak prędkość, poprzez analizę uzyskanych danych o trajektorii komórki. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi technikami, takimi jak test z komorą Boydena, jest to, że jest ona dostępna przy bardzo niskich kosztach. Metoda ta może być wykorzystana do analizy migracji już spolaryzowanych komórek na obrzeżach pierwotnych kultur explan za pomocą obrazowania poklatkowego.
Po inkubacji jaj piskląt przez 56 godzin w temperaturze 38 stopni Celsjusza wyjmij jaja z inkubatora, delikatnie spryskaj je 70% etanolem, a następnie pozostaw jaja do wyschnięcia podczas suszenia. Napełnij jedną sterylną plastikową szalkę Petriego roztworem dzwonka Chick i wysterylizuj UV szklaną tacę. Napełnij pięciocentymetrową szklaną szalkę Petriego wyświetlaczami dis.
Teraz rozbij jajka na szklanej tacy sterylizowanej promieniami UV. Wyciągnij każdy zarodek z żółtka, najpierw przecinając wyspy krwi zarodka zakrzywionymi nożyczkami. Następnie kleszczami podnieś zarodek za jego dodatkową błonę zarodkową i umieść zarodek na przygotowanej szalce Petriego zawierającej obrączki.
Następnie wybierz około dziewięciu zarodków, które znajdują się między hamburgerem a Hamiltonem. Etapy od 15 do 17 za pomocą wolframowej igły odcina wszelkie tkanki embrionalne przed roztoczem 10 i usuwają wszystkie tkanki embrionalne rdzenia, zaczynając od około piątego najbardziej nowo powstałego roztocza. Następnie odetnij dodatkowe błony zarodkowe do około dwóch milimetrów od zarodka.
Umieść izolowane pnie zarodków w komorach i inkubuj je przez godzinę i 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, podczas gdy pnie zarodkowe są w trakcie inkubacji. Przygotuj sześć szkiełek nakrywkowych do hodowli. Najpierw płucz je w 70% etanolu i pozwól im wyschnąć.
Następnie za pomocą markera laboratoryjnego narysuj okrąg na środku każdego szkiełka nakrywkowego o średnicy około jednego centymetra, aby później zidentyfikować warstwę łączącą fibrynę na tej samej stronie każdego szkiełka nakrywkowego. Napisz asymetryczne słowo lub symbol poza narysowanym okręgiem, aby ułatwić identyfikację górnej i dolnej części szkiełka nakrywkowego. Teraz umieść każde szkiełko nakrywkowe w osobnym sterylnym naczyniu o wymiarach 40 na 10 milimetrów oznaczoną stroną skierowaną w dół i pozostaw naczynie otwarte pod bakteriobójczą lampą UV przez 10 minut.
Następnie nałóż 60 mikrolitrów fibronektyny na nieoznaczoną powierzchnię szkiełka nakrywkowego w obrębie jednego centymetrowego koła, upewniając się, że cały obszar koła jest pokryty. Umieść naczynia w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut. Po okresie inkubacji ostrożnie odessać płetwę z każdego szkiełka nakrywkowego.
Następnie dodaj 250 mikrolitrów pożywki hodowlanej do obszaru pokrytego FI nin. Szkiełko nakrywkowe, a następnie ponownie inkubować szkiełka nakrywkowe, aż cewy nerwowe zostaną wyizolowane. Podczas inkubacji szkiełek nakrywkowych napełnij pięciocentymetrową szklaną szalkę Petriego pożywką L 15.
Teraz przenieś wszystkie inkubowane pnie zarodków na przygotowaną szalkę Petriego. Użyj cienkich kleszczyków oraz ostrych języków i igły, aby wyciąć cewę nerwową, ostrożnie przecinając igłą wzdłuż granicy cewy nerwowej i somitów. Zdejmij szkiełka pokrywy z inkubatora.
Wybierz sześć najdłuższych i najprostszych rurek neuronowych, a następnie za pomocą końcówki mikropipety zagruntowanej pożywką hodowlaną przenieś jedną rurkę neuronową na każde z sześciu szkiełek nakrywkowych. Upewnij się, że każda rurka neuronowa znajduje się w obszarze pokrytym fibronektyną odpowiedniego szkiełka nakrywkowego za pomocą mikropipety i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnie umieść co najmniej dwa mililitry pożywki hodowlanej bez surowicy w sterylnej 15-mililitrowej probówce wirówkowej.
Pozostaw cielę lekko odkręcone podczas inkubacji probówki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby umożliwić dostosowanie pH pożywki. Po nocnej hodowli wybierz trzy najlepsze hodowle komórek grzebienia nerwowego, które mają co najmniej jedną długą prostą krawędź z trzech kultur. Wybierz jedną z nich do załadowania pierwszej komory, a pozostałe włóż z powrotem do inkubatora w celu późniejszego wykorzystania.
Następnie za pomocą naszego bawełnianego wacika nałóż cienką, równą warstwę wazeliny na obszary otaczające zbiorniki i most jednej zmodyfikowanej komory zygmunta. Następnie za pomocą wolframowej igły delikatnie wyjmij rurkę nerwową z szkiełka nakrywkowego zawierającego wybraną hodowlę komórek grzebienia nerwowego, pozostawiając otoczone komórki grzebienia nerwowego przyczepione do płaszcza fibronektyny. Oznacz naczynie markerem laboratoryjnym, aby zapamiętać orientację najprostszej granicy hodowli komórek grzebienia nerwowego.
Następnie umieść kilka kropli wstępnie inkubowanej pożywki na grzbiecie zmodyfikowanej komory zigmunda. Następnie podnieś szkiełko nakrywkowe za pomocą cienkich kleszczyków. Przetrzyj krawędź szkiełka nakrywkowego o chusteczkę Kim, aby usunąć większość starej pożywki hodowlanej, i natychmiast umieść szkiełko nakrywkowe na zmodyfikowanej komorze zygmunta, tak aby prosta granica komórki grzebienia nerwowego, która ma być sfilmowana, była wyśrodkowana na całej długości mostu i mniej więcej prostopadła do granicy zbiornika mostu.
Za pomocą odwróconego mikroskopu przesuń prostą granicę komórki grzebienia nerwowego na stronę mostu najbliżej zbiornika. To powstrzyma podejrzaną chemioterapię i dokładniej wyrówna prostą granicę komórki grzebienia nerwowego prostopadłą do granicy zbiornika mostu. Teraz ostrożnie, ale pewnie dociśnij pokrywę, wsuń ją do wazeliny znajdującej się w komorze zygmunta, upewniając się, że jest całkowicie uszczelniona w komorze
.Następnie umieść dodatkową wazelinę wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego, aby upewnić się, że będzie ono szczelne. Ponownie dostosuj kąt obramowania komórki grzebienia neuronowego, aby skorygować wszelkie ruchy podczas procesu sufitu. Następnie załaduj około 300 mikrolitrów wstępnie inkubowanej pożywki do strzykawki o pojemności jednego mililitra.
Z dołączoną igłą o rozmiarze 25 na 1,5 cala. Wstrzyknąć pożywkę do zbiornika, który nie będzie zawierał żadnej chemioterapii aż do napełnienia. Uważaj, aby nie wytworzyć żadnych pęcherzyków w zbiorniku.
Następnie zatkaj zbiornik z obu stron odpowiednią ilością wazeliny przed załadowaniem następnego zbiornika. Teraz załaduj drugą strzykawkę 300 mikrolitrami wstępnie inkubowanej pożywki zawierającej pożądany takt chemiczny. Następnie w ten sam sposób wstrzyknąć pożywkę do przeciwległego zbiornika.
Ponownie, ostrożnie uszczelniając zbiornik wazeliną. Po inkubacji załadowanej komory Zygmunta w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę przed filmowaniem. Następnie, podczas inkubacji w temperaturze około 37 stopni Celsjusza, najprostszej granicy hodowli komórek grzebienia nerwowego przez trzy godziny w 92. odstępach czasu dla kontroli, załaduj komory zygmuntowe zawierające każdą z dwóch innych najlepszych kultur komórek grzebienia nerwowego, jak pokazano.
Stosowanie odpowiednich zabiegów kontrolnych do napełniania zbiorników i gruntowania mostu. Użyj wtyczki ręcznego śledzenia obrazu J, aby śledzić migrację obwodowych komórek grzebienia nerwowego wzdłuż prostej granicy hodowli. Użyj wtyczki chemotaksji i narzędzia do migracji, aby przeanalizować różne parametry uzyskanych trajektorii migracyjnych.
Hodowle komórek grzebienia nerwowego wydłużonego tułowia przygotowano przez nocne hodowle cewek nerwowych, a do eksperymentów wybrano powstałe hodowle komórek grzebienia nerwowego z co najmniej jedną długą prostą obwódką. Najdłuższa prosta granica jednej wybranej kultury została następnie ustawiona prostopadle do granicy zbiornika mostowego, a więc równolegle do wektora przyszłego zastosowanego gradientu. Zbiornik, w którym nie znajdował się podejrzany atraktant chemioterapii, oznaczony tutaj znakiem minus, został najpierw załadowany i uszczelniony.
Następnie drugi zbiornik został załadowany podejrzanym atraktantem chemioterapii reprezentowanym przez znak plus, a zapieczętowane obwodowe komórki grzebienia nerwowego wzdłuż wcześniej wybranej granicy zostały następnie zobrazowane i śledzone za pomocą wtyczki do ręcznego śledzenia obrazu J. Liczne cechy migracyjne w odpowiedzi na zastosowany gradient można ocenić na podstawie uzyskanych danych śledzenia, jak pokazano na tym wykresie. Na przykład wskaźnik chemotaksji można uzyskać, dzieląc przemieszczenie komórki wzdłuż osi x przez całkowitą odległość, jaką przebyły. Atrakcyjna odpowiedź wszystkich śledzonych komórek jest pokazana na wykresie trajektorii komórek pokazanym tutaj.
Każdy czerwony ślad to trajektoria komórki, która migrowała w kierunku zbiornika załadowanego podejrzanym atraktantem chemioterapii. Na tym rysunku znajduje się znacznie większa liczba czerwonych ścieżek w porównaniu z czarnymi. W innym teście potwierdzono zdolność zmodyfikowanej komory Zygmunta do utrzymywania gradientu molekularnego.
Do lewego zbiornika dodano koniugat Alexa Fluor 4 88 IGM, a intensywność fluorescencji na moście mierzono w różnych momentach. Gradient utrzymywał się przez co najmniej 26 godzin Po obejrzeniu filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować zdolność cząsteczki do wywoływania chemotaksji i innych zachowań migracyjnych w hodowlach komórek grzebienia nerwowego pnia przy użyciu zmodyfikowanego testu komory zygmunta.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę analizy migracji wysiedlonych komórek grzbietowych rdzenia kręgowego. Podejście to jest opłacalne i pozwala na rozróżnienie chemotaksji od innych wpływów migracyjnych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Biologia rozwoju
Tło
- Komórki grzbietowe rdzenia kręgowego są krytyczne dla różnych procesów rozwojowych.
- Rozumienie ich migracji może dostarczyć wglądu w biologię rozwoju.
- Obecne metody badania migracji komórek mogą być drogie lub skomplikowane.
- To badanie przedstawia prostszą alternatywę dla naukowców.
Cel badania
- Ocenić zdolność cząsteczek do indukowania chemotaksji w komórkach grzbietowych rdzenia kręgowego.
- Rozłączyć różne typy reakcji migracyjnych.
- Dostarczyć niezawodną metodę badania dynamiki migracji komórek.
Stosowane metody
- Izolacja rurek nerwowych na poziomie tułowia z zarodków.
- Kultura rurek nerwowych na pokrywkach pokrytych fibronektyną.
- Montowanie kultur w zmodyfikowanej komorze Zigmunda.
- Generowanie gradientów molekularnych i filmowanie migracji komórek.
- Śledzenie i analizy migracji przy użyciu oprogramowania Image J.
Główne wyniki
- Metoda z powodzeniem odróżniła chemotaksję od innych wpływów migracyjnych.
- Uzyskano jasne wizualne przedstawienie wzorców migracji komórek.
- Oprogramowanie Image J zapewniło efektywną analizę danych migracyjnych.
- Podejście jest powtarzalne i dostępne dla naukowców.
Wnioski
- Ta metoda oferuje nowy sposób badania migracji komórek grzbietowych rdzenia kręgowego.
- Może być zastosowana do różnych pytań badawczych w biologii rozwoju.
- Wyniki mogą mieć implikacje dla zrozumienia zachowania komórek w różnych kontekstach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables cost-effective evaluation of chemotactic responses in primary neural crest cells without requiring homogenous distribution or harsh dissociation, preserving physiological relevance. It supports early-stage target validation by quantifying directional migration in response to molecular gradients, informing mechanistic de-risking of guidance cues. The approach enhances predictive confidence in lead identification for neurodevelopmental and regenerative biology programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by assessing whether candidate molecules alter neural crest cell directionality or speed.
- Operational Value: Uses minimal biological material (two neural tube explants per replicate) and avoids enzymatic dissociation, reducing variability and preserving native cell state.
- Predictive Value: Enables quantification of chemotaxis index and trajectory analysis to prioritize compounds with genuine directional activity over random motility.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates stable, measurable molecular gradients across a defined interface for consistent chemotactic stimulation.
- Quantitative Output: Produces trackable migratory parameters (displacement, velocity, persistence) via ImageJ plugins for objective comparison.
- Scalability: Compatible with time-lapse imaging and multi-condition testing using control and experimental reservoirs.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models a developmental system where aberrant migration contributes to neurocristopathies, supporting phenotypic screening relevance.
- Translational Continuity: Maintains cells in a native-like spatial arrangement, improving extrapolation to in vivo migration pathways.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes chemotactic from chemokine or haptotactic effects by isolating gradient-dependent responses.
Pipeline & Workflow Integration
Fits within early discovery workflows following target engagement and preceding phenotypic screening, providing functional validation of migratory modulation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking molecular guidance cues to directional cell movement in a primary stem cell-derived system.
- Screening: Delivers reproducible, gradient-based stimulation enabling reliable compound evaluation in a primary cell context.
- Analytics: Outputs chemotaxis index and trajectory data to quantify directional bias and compare conditions objectively.
- Translational Research: Connects to preclinical validity by using a disease-relevant cell system whose migration mirrors embryonic patterning.
- Enterprise Reuse: Establishes a low-cost, reusable platform for screening multiple guidance cues across projects without reformatting.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating gradient-directed migration from general motility in a primary cell model.
- Operational Value: Standardizes assay conditions through controlled gradient generation and time-lapse imaging, enhancing reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying compounds with authentic chemotactic activity early, reducing investment in false positives.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads based on functional migration data in a developmentally relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in avian embryo handling, neural tube dissection, and primary cell culture maintenance.
- Depends on inverted microscopy with environmental control and ImageJ with manual tracking and chemotaxis analysis plugins.
- Necessitates standardization of gradient application timing and chamber sealing to prevent medium exchange or evaporation artifacts.
- Adaptation to mammalian systems may require optimization of explant culture conditions and substrate coating.
- Limited to adherent, migratory cell populations at culture edges; not applicable to non-polarized or suspension cultures.
