Analiza migracji komórek grzbietowych neuralnych tułowia z wykorzystaniem zmodyfikowanego testu w komorze Zigmonda

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena zdolności danej cząsteczki do wywoływania chemotaksji oraz innych odpowiedzi migracyjnych w wyizolowanych komórkach grzbietu nerwu rdzeniowego z odcinka tułowia. Osiąga się to poprzez uprzednią izolację cewek nerwowych z odcinka tułowia o długości od około 8 do 15 somytów i inkubację każdej z cewek przez noc na osobnych szkiełkach nakrywkowych pokrytych fibronektyną, aby umożliwić emigrację komórek grzbietu nerwu. Następnie wybiera się optymalną hodowlę komórek grzbietu nerwu.

Rurkę neuralną usuwa się z hodowli, a szkiełko nakrywkowe z hodowlą montuje się w zmodyfikowanej komorze Zigmunda w taki sposób, aby najprostsza krawędź hodowli była równoległa do wektora gradientu molekularnego, który zostanie zastosowany w obrębie hodowli. Trzecim krokiem jest wytworzenie gradientu molekularnego w obrębie hodowli, a następnie sfilmowanie migracji obwodowych komórek grzebienia neuronalnego wzdłuż wcześniej wybranej prostej krawędzi hodowli. Ostatnim krokiem jest śledzenie i analiza migracji obwodowych komórek grzebienia neuronalnego rozmieszczonych wzdłuż wybranej krawędzi hodowli przy użyciu oprogramowania Image J.

Ostatecznie, na podstawie analizy uzyskanych danych o trajektorii komórek można określić, czy wybrana cząsteczka jest w stanie zmienić kierunkowość komórek lub inne charakterystyki migracyjne, takie jak prędkość. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak test w komorze Boydena, jest jej bardzo niski koszt. Metodę tę można wykorzystać do analizy migracji komórek już spolaryzowanych na obwodzie pierwotnych kultur eksplantów z wykorzystaniem obrazowania poklatkowego.

Po inkubowaniu jaj kurzych przez 56 godzin w temperaturze 38 °C, należy wyjąć jaja z inkubatora, delikatnie spryskać je 70% ethanol i pozostawić do wyschnięcia. Napełnić jedną sterylną plastikową szalkę Petriego roztworem Ringera dla kurcząt i wysterylizować tace szklanej promieniami UV. Napełnić pięciocentymetrową szklaną szalkę Petriego preparatami do wyświetlania.

Teraz rozbij jaja do sterylizowanego promieniami UV szklanego korytka. Wyjmij każdy zarodek z żółtka, najpierw wycinając obszar wokół wysepek krwi zarodka za pomocą zakrzywionych nożyczek. Następnie, używając pęsetytępej, chwyć zarodek za błonę pozazarodkową i przenieś go do przygotowanej szalki Petriego zawierającej roztwór Ringera.

Następnie należy wybrać około dziewięciu embrionów znajdujących się między stadiami hamburger a Hamilton 15–17. Za pomocą igły wolframowej odcina się wszelkie tkanki embrionalne przed 10. somitem, a następnie usuwa wszystkie kordalne tkanki embrionalne, zaczynając od okolic piątego z nowo powstałych somitów. Następnie przycina się błony pozazarodkowe do odległości około dwóch milimetrów od embrionu.

Umieść wyizolowane tułowia embrionów w dołkach i inkubuj je przez jedną godzinę i 15 minut w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide. W czasie inkubacji tułowi embrionów przygotuj sześć szkiełek nakrywkowych do hodowli, najpierw płucząc je w 70% ethanol i pozostawiając do wyschnięcia.

Następnie, używając markera laboratoryjnego, narysuj w centrum każdego szkiełka nakrywki okrąg o średnicy około jednego centymetra, aby umożliwić późniejszą identyfikację otoczki fibrynowej na tej samej stronie każdego szkiełka. Poza narysowanym okręgiem zapisz asymetryczne słowo lub symbol, który ułatwi rozróżnienie góry od dołu szkiełka nakrywki. Teraz umieść każde szkiełko nakrywki w oddzielnej sterylnej szalce o wymiarach 40 by 10 milimetrów stroną z oznaczeniami skierowaną w dół i pozostaw otwartą szalkę pod bakteriobójczą lampą UV przez 10 minut.

Następnie nanieś 60 µL fibronektyny na nieoznaczoną powierzchnię szkiełka podstawowego w obrębie okręgu o średnicy jednego centymetra, upewniając się, że cały obszar okręgu został pokryty. Umieść naczynia w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 minut. Po zakończeniu inkubacji ostrożnie odessaj fibronektynę z każdego szkiełka podstawowego.

Następnie dodaj 250 µL pożywki hodowlanej do obszaru pokrytego przeciwciałami FI nin. Przykryj szkiełko podstawowe i ponownie inkubuj szkiełka do czasu wyizolowania cewek neuronalnych. Podczas inkubacji szkiełek napełnij pięciocentymetrową szklaną szalkę Petriego pożywką L 15.

Następnie przenieś wszystkie inkubowane tułowia embrionów do przygotowanej szalki Petriego. Używając precyzyjnej pęsety oraz ostrego kleszczyka i igły, wypreparuj rurkę nerwową, ostrożnie nacinając igłą wzdłuż granicy między rurką nerwową a somytami. Wyjmij szkiełka nakrywki z inkubatora.

Wybierz sześć najdłuższych i najprostszych cewek neuralnych, a następnie, używając końcówki mikropipety nasyconej pożywką hodowlaną, przenieś jedną cewkę neuralną na każdą z sześciu szkiełek nakrywkowych. Upewniając się za pomocą mikropipety, że każda cewka neuralna znajduje się w obszarze pokrytym fibronektyną na odpowiednim szkiełku nakrywkowym, inkubuj je przez noc w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2. Następnie wlej co najmniej 2 mL pożywki hodowlanej bez surowicy do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 mL.

Pozostaw nakrętkę lekko poluzowaną podczas inkubowania probówki przez noc w temperaturze 37°C i 5% dwutlenku węgla, aby umożliwić dostrojenie pH medium. Po nocnej hodowli wybierz trzy najlepsze hodowle komórek grzebienia neuronalnego, z których przynajmniej jedna posiada długą, prostą krawędź. Wybierz jedną z nich do załadunku do pierwszej komory, a pozostałe przenieś z powrotem do inkubatora do późniejszego użycia.

Następnie za pomocą patyczka bawełnianego nanieś cienką, równomierną warstwę wazeliny na obszary wokół zbiorników i mostka jednej zmodyfikowanej komory Sigmunda. Następnie za pomocą igły wolframowej delikatnie usuń rurkę neuralną z szkiełka nakrywkowego zawierającego wybraną kulturę komórek grzebienia neuralnego, pozostawiając otaczające komórki grzebienia neuralnego przytwierdzone do powłoki z fibronektyny. Oznacz szalkę markerem laboratoryjnym, aby zapamiętać orientację najprostszej krawędzi kultury komórek grzebienia neuralnego.

Następnie nanieś kilka kropli wstępnie inkubowanego medium na mostek zmodyfikowanej komory Zigmunda. Potem chwyć szkiełko nakrywkę za pomocą precyzyjnej pęsety. Osusz krawędź szkiełka nakrywką za pomocą chusteczki Kimwipe, aby usunąć większość starego medium hodowlanego, a następnie niezwłocznie umieść szkiełko nakrywkę na zmodyfikowanej komorze Zigmunda w taki sposób, aby prosta krawędź komórek grzebienia neuronalnego, która ma zostać sfilmowana, znajdowała się w centrum długości mostka i była mniej więcej prostopadła do krawędzi zbiorniczka mostka.

Używając mikroskopu odwróconego, przesuń prostą granicę komórek grzebienia neuronalnego na stronę mostka najbliższą zbiorniczkowi. Pozwoli to na zamknięcie domniemanego chemotakty i dokładniejsze ustawienie prostej granicy komórek grzebienia neuronalnego prostopadle do granicy zbiorniczka mostka. Teraz ostrożnie, lecz pewnie dociśnij szkiełko nakrywkę do wazeliny znajdującej się na komorze Zigmunda, upewniając się, że jest ona całkowicie uszczelniona na komorze.

Następnie nanieś dodatkową warstwę wazeliny wzdłuż krawędzi szkiełka cover slip, aby dodatkowo zapewnić szczelność. Ponownie skoryguj kąt krawędzi komórek grzebienia neuronalnego, aby zrekompensować ewentualne przesunięcia podczas procesu uszczelniania. Następnie pobierz około 300 µL wstępnie inkubowanego medium do strzykawki o pojemności 1 mL.

Używając dołączonej igły o rozmiarze 25 G i długości 1,5 cala, wstrzyknij medium do zbiornika, który nie będzie zawierał chemoatraktanta, aż zostanie on całkowicie wypełniony. Należy uważać, aby nie wytworzyć pęcherzyków powietrza w zbiorniku.

Następnie uszczelnij zbiornik po obu stronach odpowiednią ilością wazeliny przed napełnieniem kolejnego zbiornika. Teraz nabierz do drugiej strzykawki 300 µL wstępnie inkubowanego medium zawierającego pożądany chemoatraktant. Następnie wstrzyknij medium do przeciwległego zbiornika w ten sam sposób.

Ponownie należy starannie uszczelnić zbiornik wazeliną. Przed rozpoczęciem filmowania inkubuj załadowaną komorę Sigmunda w temperaturze 37°C przez jedną godzinę. Następnie, podczas inkubacji w temperaturze około 37°C, obrazuj najprostszą krawędź hodowli komórek grzebienia neuronalnego przez trzy godziny w odstępach 92 sekund dla grup kontrolnych; w analogiczny sposób załaduj komory Sigmunda zawierające każdą z dwóch pozostałych najlepszych hodowli komórek grzebienia neuronalnego.

Należy zastosować odpowiednie kontrole podczas napełniania zbiorników i przygotowywania mostka. Do śledzenia migracji peryferyjnych komórek grzebienia neuronalnego wzdłuż prostej krawędzi hodowli należy użyć wtyczki ImageJ Manual Tracking. Do analizy różnych parametrów uzyskanych trajektorii migracyjnych należy wykorzystać wtyczkę Chemotaxis and Migration Tool.

Kultury komórek grzebienia neuronalnego z wydłużonego pnia przygotowano poprzez inkubację rurek neuronalnych przez noc; do eksperymentu wybrano kultury komórek grzebienia neuronalnego posiadające co najmniej jedną długą, prostą krawędź. Najdłuższą prostą krawędź wybranej kultury ustawiono prostopadle do krawędzi zbiornika mostka, a tym samym równolegle do wektora przyszłego gradientu. W pierwszej kolejności napełniono i uszczelniono zbiornik, który nie zawierał podejrzewanego chemoatraktanta, oznaczonego tutaj znakiem minus.

Następnie drugi zbiornik wypełniono domniemanym chemoatraktantem, oznaczonym znakiem plus, a następnie wykonano obrazowanie i śledzenie komórek grzebienia neuronalnego położonych wzdłuż wcześniej wybranej granicy, wykorzystując wtyczkę manual tracking do programu ImageJ. Na podstawie uzyskanych danych z procesu śledzenia można ocenić liczne cechy migracji w odpowiedzi na zastosowany gradient, co zilustrowano na tym wykresie. Na przykład wskaźnik chemotaksji można obliczyć, dzieląc przemieszczenie komórki wzdłuż osi x przez całkowity dystans, jaki ta komórka przebyła. Atrakcyjna odpowiedź wszystkich śledzonych komórek została przedstawiona na poniższym wykresie trajektorii komórkowych.

Każdy czerwony ślad przedstawia trajektorię komórki, która migrowała w stronę zbiornika z domniemanym chemoatraktantem. Na tej rysunku liczba czerwonych śladów jest znacznie większa niż liczba śladów czarnych. W innym badaniu zwalidowano zdolność zmodyfikowanej komory Sigmunda do utrzymania gradientu molekularnego.

Do lewego zbiornika dodano koniugat Alexa Fluor 488 IGM, a następnie mierzono intensywność fluorescencji w obrębie mostka w różnych odstępach czasu. Gradient utrzymywał się przez co najmniej 26 godzin. Po obejrzeniu filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak analizować zdolność cząsteczki do wywoływania chemotaksji i innych zachowań migracyjnych w kulturach wyizolowanych komórek grzbietu neuronalnego tułowia przy użyciu zmodyfikowanego testu w komorze Zigmunda.