Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego

Ogólnym celem wielofotonowego obrazowania poklatkowego jest uchwycenie trójwymiarowych obrazów w czasie rzeczywistym o wysokiej rozdzielczości migrujących populacji komórek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii rozwojowej, takie jak mapowanie szlaków migracji różnych populacji komórek. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z tradycyjną mikroskopią konfokalną jest to, że lasery wielofotonowe mają głębszą penetrację tkanek i zmniejszoną fototoksyczność.

Zwiększa to użyteczność w grubszych tkankach i pozwala na dłuższe okresy pozyskiwania obrazu. Aby przygotować się do pobierania zarodków między 15:00 a 21:00, zmontuj zbiorniki hodowlane i napełnij je odwróconą osmozą lub wodą RO.

Przenieś do trzech samic i trzech samców po przeciwnych stronach podzielonego zbiornika. Następnego ranka usuń przegrodę wkrótce po włączeniu świateł w wiwarium. Pozostawić niezakłócone krycie przez 20 minut lub do momentu, gdy zostanie wyprodukowana wystarczająca liczba zarodków.

Zarodki będą znajdować się na dnie zbiornika hodowlanego. Kiedy zaobserwuje się jaja, wyjmij szczelinowy zbiornik wewnętrzny wraz z rybami i szybko umieść je w czystym, solidnym zbiorniku zewnętrznym wypełnionym wodą RO. Użyj sita do zbierania jaj, aby zebrać jaja z zewnętrznego zbiornika i przenieść jaja na szalki Petriego zawierające 30 mililitrów pożywki 1X dla zarodków.

Wysiaduj zebrane jaja w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza. W przypadku zarodków transgenicznych, po 24 godzinach od zapłodnienia lub HPF, należy usunąć martwe komórki jajowe i ocenić etap rozwoju zarodków. Za pomocą kleszczy usuń kosmówkę z trzech do czterech zarodków, które wykazują ekspresję GFP.

Pod preparacyjnym stereoskopowym mikroskopem fluorescencyjnym ze standardowym filtrem wzbudzenia pasmowym o długości od 460 do 490 nanometrów, badanie przesiewowe w kierunku zarodków GFP. Przenieś te zarodki na oddzielną szalkę Petriego zawierającą 30 mililitrów świeżej pożywki dla zarodków 1X. Po 20 HPF umieść przesiewane i zdekorionowane zarodki GFP dodatnie w 0,003% roztworze PTU, aby zahamować pigmentację.

Należy unikać wcześniejszego rozpoczynania leczenia, ponieważ może ono mieć niekorzystny wpływ na rozwój grzebienia nerwowego i nabłonka nerwowego. Dodaj 0,4 grama proszku agarozy o niskiej temperaturze topnienia do 20 ml 1x pożywki dla zarodków. Podgrzewaj mieszaninę przez jedną do dwóch minut lub do momentu, gdy roztwór będzie klarowny i wszystkie cząstki się rozpuszczą.

Porcję około 1 ml roztworu agarozy przelać do świeżych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml w celu przechowywania. Aby ustawić otwartą komorę kąpieli, umieść niewielką ilość smaru wysokopróżniowego na podstawie otwartej komory kąpielowej. Umieść okrągłą szklaną szkiełko nasadkowe na podstawie i przykręć górną część otwartej komory kąpielowej do podstawy, aż będzie szczelna.

Odpipetować około 500-700 mikrolitrów 2% roztworu agarozy do otwartej komory kąpielowej, aż podstawa zostanie napełniona w około 3/4 s. Odczekaj 30 sekund, aby agaroza lekko ostygła bez całkowitej polimeryzacji, a następnie przenieś pojedynczy zarodek do środka podstawy. Pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym użyj końcówki mikropipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby zorientować zarodek i umieścić go w pobliżu dna agarozy, aby nie unosił się po dodaniu pożywki zarodkowej.

Krytycznym krokiem jest upewnienie się, że zarodek jest prawidłowo umieszczony w agarozie. W tych eksperymentach orientujemy zarodek bocznie, ale zarodek można również ustawić tak, aby skupiał się na obszarach grzbietowych i brzusznych. Monitoruj i zmieniaj położenie zarodka, aż agaroza zastygnie.

Następnie za pomocą pipety transferowej całkowicie wypełnij zmontowaną otwartą komorę pożywką poklatkową dla zarodków. Po umieszczeniu całego zestawu na stoliku mikroskopu, zgodnie z protokołem tekstowym, użyj pięciokrotnego obiektywu, aby zlokalizować zarodek. Następnie ręcznie podnieś stolik do najwyższej pozycji i użyj precyzyjnej ostrości, aby ustawić zarodek w środku zakresu mikroskopu.

Ręcznie opuść stage i zmień pięciokrotny cel na 25-krotny cel zanurzenia w wodzie. Ostrożnie podnieś scenę, aby zarodek ponownie był ostry. W oprogramowaniu kliknij tryb XYTZ, aby uzyskać wiele obrazów w czasie lub w odstępach T w płaszczyźnie XY na głębokości Z. Użyj epifluorescencji lub jasnego pola view, aby znaleźć głębię ostrości w obszarze zainteresowania, który wyznaczy stos z.

W tych eksperymentach boczna krawędź oka jest początkiem stosu z. Po ustawieniu ostrości w tym miejscu w oprogramowaniu kliknij przycisk rozpoczęcia. Po ustawieniu ostrości w dół do linii środkowej zarodka, która jest końcem stosu z, kliknij przycisk końca.

Krytycznym krokiem jest upewnienie się, że krok Z obejmuje obszar zainteresowania. W naszym przypadku chcemy uchwycić szerokość oka od krawędzi bocznych do przyśrodkowych. Kliknij menu, aby dostosować czas akwizycji i częstotliwość obrazowania.

Aby zapewnić odpowiednią regenerację fluoru4 i przeżycie zarodka, należy przewidzieć stosunek co najmniej jeden do trzech między akwizycją z-stack, gdy moc lasera jest włączona, a czasem regeneracji, gdy moc lasera jest wyłączona. Mając odpowiedni czas na rekonwalescencję zarodków, ustaw czas między stosami z w wyznaczonym oknie. Następnie ustaw łączny czas trwania eksperymentu w odpowiednim oknie.

Teraz włącz ustawienie obrazu na żywo, aby dokonać ostatecznych korekt ustawień lasera. Dostosuj suwaki transmisji laserowej, wzmocnienia i przesunięcia w oprogramowaniu, aby zoptymalizować obraz fluorescencyjny. Dostosuj również orientację zarodka w razie potrzeby w zależności od długości eksperymentu, przewidywanego wzrostu zarodka i tak dalej.

Upewnij się, że obszar zainteresowania pozostaje w kadrze przez cały czas trwania eksperymentu. Podczas akwizycji poklatkowej wyłącz źródło światła epifluorescencyjnego, przykryj stolik laserowym bezpiecznikiem, który jest odpowiedni do ochrony przed światłem tła, a następnie naciśnij start. Uzyskaj dostęp do otwartej komory kąpieli przez przesuwne drzwi w laserowej skrzynce bezpieczeństwa, aby co 8-12 godzin napełniać ją pożywką poklatkową dla zarodków.

Po uzyskaniu obrazu otwórz files w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu, podświetl właściwą serię obrazów. W oprogramowaniu wybierz menu procesu, kliknij Dekonwolucja 3D i zastosuj, aby zdekonwolucjonizować każdy stos z. Zaimportuj pojedyncze pliki tif do oprogramowania do przetwarzania wideo, a następnie wybierz wszystkie pliki tif i przeciągnij je do edytora wideo.

Dostosuj długość każdego obrazu w filmie do 0,1 sekundy. Na koniec wyeksportuj wideo jako plik mov lub mp4. Za pomocą obrazowania fluorescencyjnego wielofotonowego widoczne są wzorce migracji komórek grzebienia nerwowego czaszki, które dają początek strukturom czaszki twarzy i przedniego segmentu oka w transgenicznych liniach zebryża sox10:EGFP i foxd3:GFP.

Sox 10 dodatnich komórek grzebienia nerwowego między 12 a 30 hpf migruje z krawędzi cewy nerwowej do obszaru czaszki twarzy. Komórki z prosencefalonu i śródmózgowia migrują grzbietowo i brzusznie do rozwijającego się oka, aby wypełnić mezencinę okołogałkową. Jak wskazano tutaj, komórki sox10 dodatnie tworzą przedni wyrostek nosowy.

Komórki grzebienia nerwowego z rombencefalonu migrują brzusznie i dają początek łukom gardłowym. Obrazowanie poklatkowe komórek grzebienia nerwowego foxd3 dodatnich między 30 a 60 hpf pokazuje, że komórki te migrowały między miseczką wzrokową a ektodermą powierzchniową i przez szczelinę oka oznaczoną strzałką i łączyły się wokół soczewki oznaczonej gwiazdką, tworząc zrąb tęczówki. Po opanowaniu tej techniki od początku do końca można ją wykonać w ciągu czterech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podejmując się tego zabiegu, należy pamiętać o tym, aby wybierać zarodki o dużej ilości fluorescencji. Początkowa konfiguracja oprogramowania może być trudna, ale po ustaleniu parametrów dodatkowe zmiany są zazwyczaj minimalne. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać wielofotonowej mikroskopii poklatkowej do obrazowania migrujących komórek w zarodku.