Name: Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Poznaj wielofotonowe obrazowanie poklatkowe do wizualizacji migracji komórek grzebienia nerwowego w zarodkach Danio rerio. Ta metoda umożliwia głębszą penetrację tkanek i zmniejszoną fototoksyczność w badaniach biologii rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Thomasowi Schillingowi za uprzejme podarowanie ryby Tg(sox10:eGFP) oraz Mary Halloran za uprzejme podarowanie ryby Tg(foxd3:GFP).

Opisany tutaj protokół został przeprowadzony zgodnie z wytycznymi dotyczącymi humanitarnego traktowania zwierząt laboratoryjnych, ustanowionymi przez Komitet ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Michigan (UCUCA).
1. Pobieranie zarodków do obrazowania poklatkowego
<ol>
	<li>Między godziną 15 a 21 umieść samce i samice dorosłego zerosłego Tg (sox10: EGFP) lub Tg (foxd3: GFP) transgenicznego danio pręgowanego w podzielonym zbiorniku hodowlanym do krycia parami. 
	UWAGA: Ryby Tg(sox10:EGFP) i Tg(foxd3:GFP), miłe prezenty od Thomasa Schillinga i Mary Halloran, odpowiednio, zostały skrzyżowane z tłem Casper (roy -/-, naft -/-) w celu zmniejszenia autofluorescencji i interferencji pigmentacji.
	<ol>
		<li>Zmontuj zbiornik hodowlany (szczelinowy zbiornik wewnętrzny + stały zbiornik zewnętrzny) i napełnij go wodą z systemu odwróconej osmozy (RO).</li>
		<li>Przenieś do 3 samic i 3 samców na przeciwległe strony zbiornika oddzielone przegrodą; w jednym zbiorniku hodowlanym można hodować do 6 ryb parami.</li>
		<li>Następnego ranka usuń przegrodę wkrótce po włączeniu świateł w wiwarium. 
		UWAGA: W niniejszym badaniu światła są w 14-godzinnym cyklu światła (włącza się o 9 rano) i 10-godzinnym ciemnym (wyłącza się o 23:00).</li>
		<li>Pozostawić niezakłócone krycie przez 20 minut lub do momentu, gdy zostanie wyprodukowana wystarczająca liczba zarodków; zarodki znajdą się na dnie zbiornika hodowlanego. Po zaobserwowaniu jaj wyjmij szczelinowy zbiornik wewnętrzny wraz z rybami i szybko umieść je (rybę i zbiornik wewnętrzny) w czystym, solidnym zbiorniku zewnętrznym wypełnionym wodą RO.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj standardowe podłoże 1X dla zarodków, dodając następujące ilości na 1 l wody RO: 0,287 g (4,9 mM) NaCl, 0,127 g (0,17 mM) KCl, 0,048 g (0,33 mM) CaCl2,2H 2O, 0,04 g (0,33 mM) MgSO4 (bezwodny). Mieszaj roztwór, aż sole całkowicie się rozpuszczą.
	<ol>
		<li>Dodaj 100 μl 0,1% błękitu metylenowego jako fungicydu. Dodaj 0,25 g wodorowęglanu sodu, aby dostosować pH do 7,75. Przechowywać podłoże w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz jaja z zewnętrznego zbiornika za pomocą sita do zbierania jaj i przenieś jaja na szalki Petriego (~ 50 zarodków na szalkę) zawierające 30 ml pożywki 1X dla zarodków. Inkubować zebrane jaja w temperaturze 28,5 °C.</li>
	<li>Przygotowanie zarodków
	<ol>
		<li>Zarodki Tg(sox10:EGFP).
		<ol>
			<li>W przypadku zarodków Tg(sox10:EGFP), po 12 godzinach od zapłodnienia (hpf), należy usunąć martwe komórki jajowe i ocenić stadium rozwojowe zarodków. Badanie przesiewowe w kierunku zarodków GFP-dodatnich przy użyciu preparacyjnego stereomikroskopu fluorescencyjnego ze standardowym filtrem wzbudzenia pasmowo-przepustowym 460-490 nm. Za pomocą kleszczy usuń kosmówkę z 3-4 zarodków, które wykazują ekspresję GFP, i przenieś te zarodki na oddzielną szalkę Petriego zawierającą 30 ml świeżej pożywki dla zarodków 1X.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zarodki Tg(foxd3:GFP). 
		<ol>
			<li>W przypadku zarodków Tg(foxd3:GFP), przy 22-24 hpf, należy usunąć martwe komórki jajowe i ocenić stadium rozwojowe zarodków. Badanie przesiewowe w kierunku dodatnich zarodków przy użyciu preparacyjnego stereomikroskopu fluorescencyjnego ze standardowym filtrem wzbudzenia pasmowo-przepustowym 460-490 nm. Za pomocą kleszczy usuń kosmówkę z 3-4 zarodków, które wyrażają GFP.</li>
			<li>Przygotować 1000X roztwór podstawowy fenylotiomocznika (PTU), rozpuszczając 0,75 g (3%) PTU w 25 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Podwielokrotnić i przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C. Dodać 30 μl roztworu podstawowego 1000X PTU (3%) do 30 ml pożywki 1X embryo, aby uzyskać 0,003% roztwór PTU.</li>
			<li>Umieść przebadane i zdekorionowane zarodki GFP-dodatnie w 0,003% roztworze PTU w celu zahamowania pigmentacji. Nie należy rozpoczynać leczenia zarodków PTU przed podaniem dawki 20 hpf, ponieważ wczesne leczenie (w dawce <20 hpf) może mieć niekorzystny wpływ na rozwój grzebienia nerwowego i nabłonka nerwowego. 28</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przed przeprowadzeniem eksperymentu poklatkowego należy monitorować zarodki za pomocą obrazowania na żywo za pomocą standardowego mikroskopu stereoskopowego w odstępach 12-24 godzin w porównaniach dopasowanych do wieku jako kontrolę dryfu temperatury.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Montaż zarodka do obrazowania poklatkowego
<ol>
	<li>Przygotowanie poklatkowych pożywek dla zarodków
	<ol>
		<li>Przygotować standardowy 0,4% roztwór podstawowy tricainy, dodając 0,004 g tricainy do 100 ml wody RO. Podwielokrotność (~1 ml) roztworu podstawowego przelać do świeżych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotuj pożywkę dla zarodków poklatkowych (50 ml pożywki dla zarodków 1X, 0,016% tricainy), dodając 2 ml roztworu 0,4% trikainy do 48 ml pożywki dla zarodków 1X. W przypadku stosowania zarodków >22 hpf, do podłoża zarodkowego należy również dodać 50 μl 3% roztworu podstawowego PTU (stężenie końcowe 003% PTU).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie 2% agarozy niskotopliwej
	<ol>
		<li>Dodaj 0,4 g niskotopliwego proszku agarozy do 20 ml pożywki 1X dla zarodków. Podgrzewaj przez 1-2 minuty lub do momentu, gdy roztwór będzie klarowny i wszystkie cząstki się rozpuszczą. 
		UWAGA: Zwiększenie zawartości procentowej żelu agarozowego zmniejsza porowatość matrycy, co może fizycznie utrudniać wzrost i rozwój zarodka. Dlatego roztwór agarozy można obniżyć do 1,5%, aby zminimalizować te skutki. Jednakże, gdy wiązka wzbudzająca jest utrzymywana nieruchomo podczas laserowej mikroskopii skaningowej, może wystąpić większe nagrzewanie, gwałtownie zwiększające się w logarytmicznej relacji z czasem. W tym protokole ogrzewanie spowodowane absorpcją fluoroforu jest silnie zlokalizowane w obszarze ogniskowym. W związku z tym w obszarze zainteresowania temperatura może wzrosnąć do wartości wystarczająco wysokiej (≥ 30 °C), aby stopić roztwory agarozy o zawartości procentowej niższej niż 1,5, wystawiając w ten sposób zarodek bezpośrednio na działanie lasera lub warunków sprzyjających, w których zarodek unosi się poza płaszczyzną ogniskową. Z tego powodu nie zaleca się stosowania roztworów agarozy mniejszych niż 1,5%.</li>
		<li>Podwielokrotność (~1 ml) roztworu agarozy przelać do świeżych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml w celu przechowywania. Nadmiar roztworu agarozy w postaci płynnej przechowywać na bloku grzewczym (60-70 °C) przez 2-3 tygodnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż zarodka
	<ol>
		<li>Aby ustawić otwartą komorę kąpieli, umieść niewielką ilość smaru wysokopróżniowego na podstawie otwartej komory kąpielowej. Umieść okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe na podstawie i przykręć górną część otwartej komory kąpieli do podstawy, aż będzie szczelna ( <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A, B).</li>
		<li>Odpipetować (~500-700 μL) 2% roztworu agarozy (60-70 °C) do otwartej komory kąpieli, aż baza zostanie wypełniona ~3/4 ( <klasa mocna = "xfig">Rysunek 1C). Należy zauważyć, że gdy roztwór agarozy znajdzie się w otwartej komorze kąpielowej na stole laboratoryjnym, temperatura roztworu spada o około 1 °C/s.</li>
		<li>Odczekaj 30 sekund, aby agaroza lekko ostygła (~30-40 °C), bez całkowitej polimeryzacji, a następnie przenieś pojedynczy zarodek do środka zasady ( <silna klasa = "xfig">Rysunek 1D, E).</li>
		<li>Pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym umieść zarodek za pomocą końcówki mikropipety o pojemności 1-10 μl, upewniając się, że zarodek jest umieszczony blisko dna agarozy, ponieważ zarodek może odpłynąć, gdy zostanie pokryty pożywką zarodkową, jeśli zostanie umieszczony zbyt blisko powierzchni agarozy. 
		UWAGA: W prezentowanych filmach (filmy 1-3) zarodki są zorientowane bocznie, ale w zależności od obszaru zainteresowania zarodki mogą być zorientowane brzusznie lub grzbietowo.</li>
		<li>Monitoruj i zmieniaj położenie zarodka, aż agaroza się zetnie. Gdy agaroza stwardnieje, użyj pipety transferowej, aby całkowicie wypełnić zmontowaną otwartą komorę pożywką poklatkową dla zarodków ( <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1F).</li>
		<li>Umieść otwartą komorę kąpieli w platformie szybkiej wymiany, która pasuje do adaptera stage ( <silna klasa = "xfig" > Rysunek 1G). Umieść cały zestaw (zarodek, otwarta komora kąpieli, platforma szybkiej wymiany i adapter stolika) na stoliku mikroskopu bezpośrednio nad kondensatorem ( <silna klasa = "xfig">Rysunek 1H).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Konfiguracja mikroskopu do obrazowania poklatkowego
<ol>
	<li>Określanie ustawień lasera
	<ol>
		<li>Określanie długości fali lasera do użycia. Użyć długości fali, która jest dwukrotnie większa od długości fali wzbudzenia fluoroforu będącego przedmiotem zainteresowania (np. długość fali od 880 do 940 nm dla GFP). 
		UWAGA: W niniejszym badaniu ustawienie długości fali dla GFP wynosiło od 880 do 940 nm. Im wyższa długość fali, tym mniejsza moc wyjściowa lasera.</li>
		<li>Określ transmisję laserową. Wysoki procent transmisji laserowej zabije zarodek, użyj najniższego poziomu transmisji (zalecane). W przypadku badań poklatkowych trwających od 24 do 48 godzin, jak przedstawiono w niniejszym dokumencie, należy utrzymać transmisję poniżej 5%.</li>
		<li>Określ systemy wykrywania mikroskopu i upewnij się, że zainstalowane są odpowiednie filtry do fluoroforu. 
		UWAGA: W przypadku mikroskopów wielofotonowych istnieje wiele systemów detekcji o różnej czułości na emitowaną fluorescencję. Ogólnie rzecz biorąc, wewnętrzny system wykrywania ma mniejszą czułość niż zewnętrzny system wykrywania. W przypadku linii transgenicznych o wysokim poziomie ekspresji GFP wewnętrzny system wykrywania jest odpowiedni. W przypadku linii transgenicznych o niskim poziomie ekspresji GFP lub z innymi fluoroforami (np. białkiem czerwonej fluorescencji) może być wymagany zewnętrzny system detekcji w celu utrzymania procentu transmisji laserowej na rozsądnym poziomie. Niezależnie od zastosowanego systemu detekcji, muszą być zainstalowane odpowiednie filtry dla fluoroforu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosowywanie ustawień oprogramowania w mikroskopie wielofotonowym
	<ol>
		<li>Korzystając z obiektywu 5X, zlokalizuj zarodek. Ręcznie podnieś stolik do najwyższej pozycji i użyj precyzyjnej ostrości, aby ustawić zarodek w środku zakresu mikroskopu.</li>
		<li>Ręcznie opuść stolik i zmień obiektyw 5X na obiektyw zanurzeniowy 25X (apertura numeryczna NA, 0.95). Ostrożnie podnieś scenę, aby zarodek ponownie był ostry.</li>
		<li>W software kliknij na tryb "xyzt" dla uzyskania wielu obrazów w odstępach czasu (t) w płaszczyźnie x-y na głębokości "z". Użyj widoku epifluorescencji lub jasnego pola, aby znaleźć głębię ostrości w obszarze zainteresowania, który wyznaczy stos Z.
		<ol>
			<li>W oprogramowaniu kliknij przycisk "rozpocznij"; w tych eksperymentach boczna krawędź oka była początkiem stosu Z. Kliknij przycisk "koniec"; linia środkowa zarodka była końcem stosu Z. 
			UWAGA: Rozmiar kroku wynosił 0,3-0,6 μm i w sumie było ~200 kroków dla rozmiaru stosu z od 60 do 120 μm).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Kliknij menu, aby dostosować czas akwizycji i częstotliwość obrazowania. W przypadku obecnego systemu ~200 kroków wymaga około 5 minut na każde przejęcie z-stack. W celu odpowiedniego odzyskania fluoroforu i przeżycia zarodka, należy przewidzieć stosunek co najmniej 1:3 między akwizycją z-stack (włączenie lasera) a czasem rekonwalescencji (wyłączenie lasera). 
		UWAGA: Na przykład stosy z są pozyskiwane co 20 minut, z 5 minutami pozyskiwania stosu z i 15 minutami odzyskiwania. W przypadku tego protokołu można uzyskać większe stosy z, ale odpowiednio wydłużyłoby to czas między akwizycjami stosu z, co skutkowałoby mniejszą liczbą obrazów w trakcie poklatkowym.
		<ol>
			<li>Mając odpowiedni czas na rekonwalescencję zarodków, ustaw czas między stosami z w wyznaczonym oknie. Ustaw łączny czas trwania eksperymentu w odpowiednim oknie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Końcowe korekty oprogramowania, lasera i zarodków.
		<ol>
			<li>Włącz ustawienie obrazu na żywo, aby dokonać ostatecznych korekt ustawień lasera. Dostosuj transmisję laserową (patrz 3.1.2), suwaki wzmocnienia i przesunięcia w oprogramowaniu, aby zoptymalizować obraz fluorescencyjny. W razie potrzeby dostosuj również orientację zarodka, w zależności od długości eksperymentu, przewidywanego wzrostu zarodka itp. Upewnij się, że obszar zainteresowania pozostaje w kadrze przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
			<li>Wyłącz epifluorescencyjne źródło światła, ponieważ nie jest już potrzebne podczas akwizycji poklatkowej. Przykryj scenę laserowym bezpiecznikiem ( <silna klasa = "xfig" > Rysunek 1I). W przypadku korzystania z wewnętrznego systemu detekcji laserowa skrzynka bezpieczeństwa jest wystarczająca do ochrony przed światłem tła. Naciśnij "start". 
			UWAGA: Jednak w przypadku bardziej czułych zewnętrznych systemów detekcji laserowa skrzynka bezpieczeństwa nie blokuje wystarczającej ilości światła tła i wymagane są dodatkowe osłony, aby zapobiec zakłóceniom w akwizycji obrazu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Podczas akwizycji poklatkowej
<ol>
	<li>Napełniaj otwartą komorę kąpieli pożywką poklatkową co 8-12 godzin (co najmniej 2 razy dziennie) podczas akwizycji poklatkowej przez przesuwane drzwi w laserowej skrzynce bezpieczeństwa ( <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1I).</li>
	<li>Przed otwarciem drzwiczek skrzynki bezpieczeństwa lasera upewnij się, że mikroskop nie rejestruje aktywnie obrazu. 
	UWAGA: Stosowanie grzałek i systemów mediów obiegowych nie jest konieczne w przypadku eksperymentów z obrazowaniem poklatkowym trwających od 24 do 48 godzin. Rzeczywiście, temperatury zarówno podgrzewaczy etapowych, jak i liniowych są trudne do kontrolowania, a podczas akwizycji obrazu zarodek wykazuje odpowiednie tempo rozwoju w zakresie temperatur od 25 do 28 °C. Co więcej, systemy mediów obiegowych mają tendencję do przepełniania się i potencjalnego uszkodzenia sprzętu. W związku z tym wszystkie zarodki są rutynowo inscenizowane po nabyciu.</li>
</ol>
5. Przetwarzanie po przejęciu
<ol>
	<li>W oprogramowaniu kliknij menu "plik" i wybierz "zapisz".</li>
	<li>Otwórz plik w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu (patrz tabela materiałów). Wyróżnij właściwą serię obrazów. W oprogramowaniu wybierz menu "Proces". Kliknij Dekonwolucja 3D i "Zastosuj", aby zdekonwoluować każdy stos z. 
	UWAGA: Plik jest duży; Dlatego ten krok może zająć wiele godzin.</li>
	<li>W oprogramowaniu, w menu "Proces", kliknij "maksymalna projekcja". Kliknij "Zastosuj", aby zainicjować maksymalną projekcję w celu wygenerowania 1 obrazu na stos z. Eksportuj każdy maksymalny rzutowany plik (1 obraz na stos z) jako tiff.</li>
	<li>Importuj poszczególne pliki tiff do oprogramowania do przetwarzania wideo. Zaznacz wszystkie pliki tiff i przeciągnij je do edytora wideo. Dostosuj długość każdego obrazu w filmie do 0,1 s. Eksportuj wideo jako plik mov lub mp4.</li>
</ol>

<ol><li>Barembaum, M., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+steps+in+neural+crest+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Sem+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Early steps in neural crest specification.</a> Sem Cell Dev Biol. 16, 642-646 (2005).</li>
<li>Gage, P. J., Rhoades, W., Prucka, S. K., Hjalt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+maps+of+neural+crest+and+mesoderm+in+the+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Fate maps of neural crest and mesoderm in the mammalian eye.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (11), 4200-4208 (2005).</li>
<li>Minoux, M., Rijli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+cranial+neural+crest+cell+migration+and+patterning+in+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of cranial neural crest cell migration and patterning in craniofacial development.</a> Development. 137, 2605-2621 (2010).</li>
<li>Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+neural+crest+cell+formation+and+migration+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Sem+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Specification of neural crest cell formation and migration in mouse embryos.</a> Sem Cell Dev Biol. 16, 683-693 (2005).</li>
<li>Johnston, M. C., Noden, D. M., Hazelton, R. D., Coulombre, J. L., Coulombre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+avian+ocular+and+periocular+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Origins of avian ocular and periocular tissues.</a> Exp Eye Res. 29, 27-43 (1979).</li>
<li>Bohnsack, B. L., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+hormone+and+retinoic+acid+interact+to+regulate+zebrafish+craniofacial+neural+crest+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Thyroid hormone and retinoic acid interact to regulate zebrafish craniofacial neural crest development.</a> Dev Biol. 373, 300-309 (2013).</li>
<li>Chawla, B., Schley, E., Williams, A. L., Bohnsack, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+and+pitx2+regulate+early+neural+crest+survival+and+migration+in+craniofacial+and+ocular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+B+Dev+Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid and pitx2 regulate early neural crest survival and migration in craniofacial and ocular development.</a> Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol. , (2016).</li>
<li>Trainor, P. A., Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranial+paraxial+mesoderm+and+neural+crest+cells+of+the+mouse+embryo-codistribution+in+the+craniofacial+mesenchyme+but+distinct+segregation+in+branchial+arches%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cranial paraxial mesoderm and neural crest cells of the mouse embryo-codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in branchial arches.</a> Development. 121 (8), 2569-2582 (1995).</li>
<li>Hong, C. S., Saint-Jeannet, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox+proteins+and+neural+crest+development%5BTitle%5D)+AND+%22Sem+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Sox proteins and neural crest development.</a> Sem Cell Dev Biol. 16, 694-703 (2005).</li>
<li>Steventon, B., Carona-Fontaine, C., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+network+during+neural+crest+induction%3A+from+cell+specification+to+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Sem+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival.</a> Sem Cell Dev Biol. 16, 647-654 (2005).</li>
<li>Dressler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+and+craniofacial+anomalies+associated+wth+Axenfeld-Rieger+syndrome+with+PITX2+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Case+Report+Med%22%5BJournal%5D)">Dental and craniofacial anomalies associated wth Axenfeld-Rieger syndrome with PITX2 mutation.</a> Case Report Med. , 621984(2010).</li>
<li>Ozeki, H., Shirai, S., Ikeda, K., Ogura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anomalies+associated+with+Axenfeld-Rieger+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Anomalies associated with Axenfeld-Rieger syndrome.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 237 (9), 730-734 (1999).</li>
<li>Strungaru, M. H., Dinu, I., Walter, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype-phenotype+correlations+in+Axenfeld-Rieger+malformation+and+glaucoma+patients+with+FOXC1+and+PITX2+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Genotype-phenotype correlations in Axenfeld-Rieger malformation and glaucoma patients with FOXC1 and PITX2 mutations.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 228-237 (2007).</li>
<li>Tumer, Z., Bach-Holm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axenfeld-Rieger+syndrome+and+spectrum+of+Pitx2+and+Foxc1+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Axenfeld-Rieger syndrome and spectrum of Pitx2 and Foxc1 mutations.</a> Eur J Hum Genet. 17, 1527-1539 (2009).</li>
<li>Schoner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrocephalus%2C+agenesis+of+the+corpus+callosum%2C+and+cleft+lip%2Fpalate+represent+frequent+associations+in+fetuses+with+Peters+plus+syndrome+and+B3GALTL+mutations.+Fetal+PPS+phenotypes%2C+expanded+by+Dandy+Walker+cyst+and+encephalocele%5BTitle%5D)+AND+%22Prenat+Diagn%22%5BJournal%5D)">Hydrocephalus, agenesis of the corpus callosum, and cleft lip/palate represent frequent associations in fetuses with Peters plus syndrome and B3GALTL mutations. Fetal PPS phenotypes, expanded by Dandy Walker cyst and encephalocele.</a> Prenat Diagn. 33 (1), 75-80 (2013).</li>
<li>Aliferis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+nonsense+B3GALTL+mutation+confirms+Peters+plus+syndrome+in+a+patient+with+multiple+malformations+and+Peters+anomaly%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel nonsense B3GALTL mutation confirms Peters plus syndrome in a patient with multiple malformations and Peters anomaly.</a> Ophthalmic Genet. 31 (4), 205-208 (2010).</li>
<li>Lesnik Oberstein,, S, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peters+Plus+syndrome+is+caused+by+mutations+in+B3GALTL%2C+a+putative+glycosyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Peters Plus syndrome is caused by mutations in B3GALTL, a putative glycosyltransferase.</a> Am J Hum Genet. 79 (3), 562-566 (2006).</li>
<li>Brittijn, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+development+and+regeneration%3A+new+tools+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research.</a> Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).</li>
<li>Bohnsack, B. L., Kasprick, D., Kish, P. E., Goldman, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+model+of+Axenfeld-Rieger+Syndrome+reveals+that+pitx2+regulation+by+retinoic+acid+is+essential+for+ocular+and+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">A zebrafish model of Axenfeld-Rieger Syndrome reveals that pitx2 regulation by retinoic acid is essential for ocular and craniofacial development.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (1), 7-22 (2012).</li>
<li>Williams, A. L., Eason, J., Chawla, B., Bohnsack, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyp1b1+regulates+ocular+fissure+closure+through+a+retinoic+acid-independent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Cyp1b1 regulates ocular fissure closure through a retinoic acid-independent pathway.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1084-1097 (2017).</li>
<li>Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxd3+controls+melanophore+specification+in+the+zebrafish+neual+crest+by+regulation+of+Mitf%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neual crest by regulation of Mitf.</a> Dev Biol. 332 (2), 408-417 (2009).</li>
<li>Dutton, K., Dutton, J. R., Pauliny, A., Kelsh, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+morpholino+phenocopy+of+the+colourless+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A morpholino phenocopy of the colourless mutant.</a> Genesis. 30 (3), 188-189 (2001).</li>
<li>Dutton, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+colourless+encodes+sox10+and+specifies+non-ectomesenchymal+neural+crest+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish colourless encodes sox10 and specifies non-ectomesenchymal neural crest fates.</a> Development. 128 (21), 4113-4125 (2001).</li>
<li>Kucenas, S., Takada, N., Park, H. C., Woodruff, E., Broadie, K., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS-derived+glia+ensheath+peripheral+nerves+and+mediate+motor+root+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CNS-derived glia ensheath peripheral nerves and mediate motor root development.</a> Nat Neurosci. 11, 143-151 (2008).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16299478">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Denk, W., Delaney, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+functional+imaging+of+neurons+using+2-photon+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy.</a> J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).</li>
<li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0022991">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle developmnt to changes in retinoic acid and insulin-like growth factor signaling.</a> PLoS ONE. 6, e22991(2011).</li>
<li>Gfrerer, L., Dougherty, M., Laio, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+craniofacial+development+in+the+sox10%3Akaede+transgenic+zebrafish+line+using+time-lapse+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of craniofacial development in the sox10:kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy.</a> J Vis Exp. (79), e50525(2013).</li>
<li>Lopez, A. L. R., Garcai, M. D., Dickinson, M. E., Larina, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+confocal+microscopy+of+the+developing+mouse+embryonic+yolk+sac+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Live confocal microscopy of the developing mouse embryonic yolk sac vasculature.</a> Methods Mol Biol. 1214, 163-172 (2015).</li>
<li>McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+craniofacial+morphogenesis+in+zebrafish+using+4D+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4D confocal microscopy.</a> J Vis Exp. (83), e51190(2014).</li>
<li>Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mouse+development+with+confocal+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods Enzymol. 476, 351-377 (2010).</li>
</ol>

Prace te były wspierane finansowo przez granty z National Eye Institute of the National Institutes of Health (K08EY022912-01) i Vision Research Core (P30 EY007003).

Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe umożliwia śledzenie in vivo przejściowych i migrujących populacji komórek. Ta potężna technika może być wykorzystana do badania procesów embrionalnych w czasie rzeczywistym, a w niniejszym badaniu wyniki tej metody poszerzyły obecną wiedzę na temat migracji i rozwoju komórek grzebienia nerwowego. Wcześniejsze badania obrazowania poklatkowego zazwyczaj wykorzystują konfokalną laserową mikroskopię skaningową. 29,30,31,32 W tym miejscu przedstawiamy zast...

Wrodzone choroby oczu mogą powodować ślepotę u dzieci i często są spowodowane nieprawidłowościami grzebienia nerwowego czaszki. Komórki grzebienia nerwowego to przejściowe komórki macierzyste, które powstają z cewy nerwowej i tworzą liczne tkanki w całym ciele. 1,2,3,4,5 Komórki grzebienia nerwowego, wywodzące się z prosencephalonu i śródmózgowia, dają początek kości i chrząstki w środkowej części twarzy i okolicy czołowej, a także tęczówce, rogówce, siatku beleczkowemu i twardówce w przednim segmencie oka. 4,6,7,8 Komórki grzebienia nerwowego z rombencefalonu tworzą łuki gardłowe, szczękę i drogę odpływu serca. 1,3,4,9,10 Badania podkreśliły wpływ grzebienia nerwowego na rozwój oka i okolic oczu, podkreślając znaczenie tych komórek w rozwoju oka kręgowców. Rzeczywiście, zakłócenie migracji i różnicowania komórek grzebienia nerwowego prowadzi do anomalii twarzoczaszki i oczu, co obserwuje się w zespole Axenfelda-Riegera i zespole Petersa Plusa. 11,12,13,14,15,16,17 Tak więc kompleksowe zrozumienie migracji, proliferacji i różnicowania tych komórek grzebienia nerwowego zapewni wgląd w złożoność leżącą u podstaw wrodzonych chorób oczu.
Danio pręgowany jest potężnym organizmem modelowym do badania rozwoju oka, ponieważ struktura oka danio pręgowanego jest podobna do ich ssaczych odpowiedników, a wiele genów jest ewolucyjnie zachowanych między danio pręgowanym a ssakami. 18,19,20 Ponadto zarodki danio pręgowanego są przezroczyste i jajorodne, co ułatwia wizualizację rozwoju oka w czasie rzeczywistym.
Rozwinięcie poprzednio opublikowanych prac,6,7,20 wzorzec migracji komórek grzebienia nerwowego został opisany za pomocą wielofotonowej fluorescencji poklatkowej na transgenicznych liniach ryb pręgowanych znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) pod kontrolą transkrypcyjną SRY (region determinujący płeć Y)-box 10 (sox10) lub Forkhead Box D3 (foxd3) Regiony regulatorowe genów. 21,22,23,24. Obrazowanie poklatkowe fluorescencji wielofotonowej to potężna technika, która łączy zaawansowane techniki optyczne laserowej mikroskopii skaningowej z wzbudzeniem fluorescencji wielofotonowej o dużej długości fal w celu uchwycenia trójwymiarowych obrazów o wysokiej rozdzielczości próbek oznaczonych fluoroforami. 25,26,27 Zastosowanie lasera wielofotonowego ma wyraźne zalety w porównaniu ze standardową mikroskopią konfokalną, w tym zwiększoną penetrację tkanek i zmniejszone wybielanie fluoroforem.
Korzystając z tej metody, wyróżniono dwie odrębne populacje komórek grzebienia nerwowego różniące się czasem migracji i szlakami migracyjnymi, a mianowicie foxd3-dodatnie komórki grzebienia nerwowego w mezenchymie okołogałkowej i rozwijające się komórki grzebienia nerwowego sox10-dodatnie w mezenchymie twarzoczaszki. Dzięki tej metodzie wprowadzono podejście do wizualizacji migracji grzebienia nerwowego oka i twarzoczaszki u danio pręgowanego, co ułatwia obserwację regulowanej migracji grzebienia nerwowego w czasie rzeczywistym podczas rozwoju.
Ten protokół dostarcza informacji do generowania filmów poklatkowych podczas wczesnego rozwoju oka u transgenicznych ryb pręgowanego Tg(sox10:EGFP) i Tg(foxd3:GFP), na przykład. Protokół ten może być dalej stosowany do trójwymiarowej wizualizacji w czasie rzeczywistym o wysokiej rozdzielczości wczesnego rozwoju dowolnej struktury oka i twarzoczaszki pochodzącej z komórek grzebienia nerwowego u danio pręgowanego. Co więcej, metoda ta może być dalej stosowana do wizualizacji rozwoju innych tkanek i narządów u danio pręgowanego i innych modeli zwierzęcych.

<table><tbody><tr><td>Zbiorniki hodowlane z przegrodami</td><td>Zestaw</td> zbiorników wodnych <td>ZHCT100</td><td>krzyżujących (1,0 litra) Przezroczysty poliwęglan z pokrywką i wkładką</td></tr><tr><td>M205 FA Combi-Scope</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td>Mikroskop stereofluorescencyjny - FusionOptics i TripleBeam</td></tr><tr><td>Millipore chlorku sodu</td><td>(EMD)</td><td>7760-5KG</td><td>Podwójny worek PE. Nr CAS 7647-14-5, numer WE 231-598-3</td></tr><tr><td>Milipor chlorku potasu</td><td>(EMD)</td><td>1049380500</td><td>Chlorek potasu 99.999 Suprapur. Numer CAS 7447-40-7, numer WE 231-211-8.</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>Butelka foliowa; 500 g. Nr CAS 10035-04-8</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (bezwodny)</td> <td>Milipor (EMD)</td> <td>MX0075-1</td><td>Butelka polietylenowa; 500 g. Numer CAS 7487-88-9, numer WE 231-298-2</td></tr><tr><td>Milipor błękitu metylenowego</td><td>(EMD)</td><td>284-12</td><td>Butelka szklana; 25 g. Proszek, certyfikowana plama biologiczna</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Milipore (EMD)</td><td>SX0320-1</td><td>Butelka polietylenowa; 500 g. Proszek, GR ACS. Numer CAS 144-55-8, numer WE 205-633-8</td></tr><tr><td>N-Phenylthiocea</td><td>Sigma</td><td>P7629-25G</td><td>>98%. Numer CAS 103-85-5, numer WE 203-151-2</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma</td><td>D8418-500ML</td><td>Klasa biologii molekularnej. Numer CAS 67-68-5, numer WE 200-664-3</td></tr><tr><td>Metanosulfonian trikainy</td><td>Western Chemical Inc.</td><td>MS222</td><td>Tricaine-S</td></tr><tr><td>Agaroza niskotopliwa</td><td>ISC Bioexpress</td><td>E-3112-25</td><td>GeneMate Sito GQA Agaroza niskotopliwa, 25 g</td></tr><tr><td>Otwarta komora kąpielowa</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-40HP</td><td>Wysokoprofilowe</td></tr><tr><td>szklane szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102</td><td>Okrągłe szkło nakrywkowe.</td></tr><tr><td>Smar wysokopróżniowy</td> o średnicy 25 mm <td>Fisher Scientific</td><td>14-635-5C</td><td>Rura o wadze 2,0 funta. DOW CORNING CORPORATION 1658832</td></tr><tr><td>Platforma szybkiej wymiany</td><td>Warner Instruments</td><td>QE-1</td><td>Adapter</td></tr><tr><td>stolika</td><td>35 mm Warner Instruments</td><td>SA-20LZ-AL</td><td>16,5 x 10 cm</td></tr><tr><td>Mikroskop wielofotonowy TC SP5 MP</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser</td><td>SpectraPhysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laserowy</td> <td>sejfLeica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pakiet aplikacji Leica X (LAS X)&nbsp; Oprogramowanie</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS 6 Wersja 13.0 x64 Oprogramowanie</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMovie Wersja 10.1.4 Oprogramowanie</td><td>Apple</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Wrodzone anomalie oczu i twarzoczaszki odzwierciedlają zakłócenia w grzebieniu nerwowym, przejściowej populacji migrujących komórek macierzystych, które dają początek licznym typom komórek w całym ciele. Zrozumienie biologii grzebienia nerwowego jest ograniczone, co odzwierciedla brak genetycznie wykonalnych modeli, które można badać in vivo i w czasie rzeczywistym. Danio pręgowany jest szczególnie ważnym modelem rozwojowym do badania populacji komórek wędrownych, takich jak grzebień nerwowy. Aby zbadać migrację grzebienia nerwowego do rozwijającego się oka, zastosowano połączenie zaawansowanych technik optycznych laserowej mikroskopii skaningowej z wzbudzeniem fluorescencji wielofotonowej o dużej długości fali, aby uchwycić wysokiej rozdzielczości, trójwymiarowe filmy w czasie rzeczywistym rozwijającego się oka w transgenicznych zarodkach danio pręgowanego, a mianowicie Tg(sox10:EGFP) i Tg(foxd3:GFP), jako sox10 i foxd3 wykazano w wielu modelach zwierzęcych, że regulują wczesne różnicowanie grzebieni nerwowych i prawdopodobnie reprezentują markery komórek grzebienia nerwowego. Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe wykorzystano do rozpoznania zachowania i wzorców migracji dwóch populacji komórek grzebienia nerwowego, które przyczyniają się do wczesnego rozwoju oka. Protokół ten dostarcza informacji do generowania filmów poklatkowych podczas migracji grzebienia neuronalnego danio pręgowanego, na przykład, i może być dalej stosowany do wizualizacji wczesnego rozwoju wielu struktur u danio pręgowanego i innych organizmów modelowych.

Wielofotonowa obrazowanie fluorescencyjne w trybie time-lapse pozwoliło na stworzenie serii filmów, które ujawniły wzorce migracji komórek grzebienia nerwowego czaszki, dających początek strukturom kraniofacjalnym oraz przedniemu odcinkowi oka w liniach zebrafish Tg(sox10:EGFP) i Tg(foxd3:GFP). Przykładowo, komórki grzebienia nerwowego wykazujące ekspresję sox10 między 12 a 30 hpf migrują z krawędzi rurki neuralnej do obszaru kraniofacjalnego (Video 1, <...

Kombinacja zaawansowanych technik optycznych laserowej mikroskopii skaningowej z wzbudzeniem fluorescencji wielofotonowej o długich falach została zaimplementowana do przechwytywania wysokiej rozdzielczości, trójwymiarowego obrazowania w czasie rzeczywistym migracji grzebieni nerwowych w zarodkach zebry pręgowanego Tg(sox10:EGFP) i Tg(foxd3:GFP).

Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Ogólnym celem wielofotonowego obrazowania timelapse jest uzyskanie trójwymiarowych obrazów populacji komórek migrujących w czasie rzeczywistym i z wysoką rozdzielczością. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak mapowanie szlaków migracji różnych populacji komórek. Główną zaletą tej techniki w stosunku do tradycyjnej mikroskopii konfokalnej jest to, że lasery wielofotonowe zapewniają głębszą penetrację tkanek i ograniczoną fototoksyczność.Zwiększa to użyteczność w przypadku grubszych tkanek i pozwala na dłuższy czas akwizycji obrazu. Aby przygotować się do zbierania embrionów między godziną 15:00 a 21:00, należy przygotować zbiorniki hodowlane i napełnić je wodą z odwróconej osmozy (RO).Przenieś do przeciwstawnych stron przedzielonego zbiornika do trzech samic i trzech samców. Następnego ranka, krótko po zapaleniu świateł w terrarium, usuń przedziałkę. Pozostaw zwierzęta bez zakłóceń na 20 minut lub do czasu powstania odpowiedniej liczby embrionów.Zarodki będą znajdować się na dnie zbiornika hodowlanego. Po zauważeniu jaj wyjmij perforowany zbiornik wewnętrzny wraz z rybami i szybko przenieś je do czystego, szczelnego zbiornika zewnętrznego wypełnionego wodą RO. Użyj sitka do zbierania jaj, aby zebrać je ze zbiorniki zewnętrznego i przenieść do naczyń Petri zawierających 30 mililitrów 1X medium dla zarodków.Inkubować zebrane jaja w temperaturze 28,5 °C. W przypadku embrionów transgenicznych, 24 godziny po zapłodnieniu (HPF), usunąć martwe jaja i ocenić stadium rozwoju embrionów. Za pomocą pęsety usunąć błony chorionowe z trzech do czterech embrionów wykazujących ekspresję GFP.Pod stereotypowym mikroskopem fluorescencyjnym z zastosowaniem standardowego filtra wzbudzenia z pasmem przepustności od 460 do 490 nanometrów, przeprowadź selekcję zarodków wykazujących ekspresję GFP. Przenieś te zarodki do oddzielnej czaszki Petriego zawierającej 30 ml świeżego 1X medium dla zarodków. Po 20 HPF umieść wyselekcjonowane i zdechorionowane zarodki GFP-dodatnie w 0,003% roztworze PTU w celu zahamowania pigmentacji.Należy unikać rozpoczynania leczenia wcześniej, ponieważ może ono mieć niekorzystny wpływ na rozwój grzebienia neuronalnego i neuroepitelium. Do 20mL 1x medium dla embrionów dodać 0,4 grama proszku LowMelt Agarose. Podgrzewać mieszaninę od jednej do dwóch minut lub do momentu, aż roztwór stanie się przejrzysty i wszystkie cząsteczki zostaną rozpuszczone.Przenieś aliczquoty około 1mL roztworu agarozy do nowych probówek wirówkowych o pojemności 1,5mL w celu przechowywania. Aby przygotować otwartą komorę kąpieli, nanieś niewielką ilość smaru próżniowego na podstawę komory. Umieść na podstawie okrągłe szkiełko nakrywowe i przykręć górną część otwartej komory kąpieli do podstawy, aż zostanie mocno dociśnięta.Pipetuj około 500-700 µL 2% roztworu agarozy do otwartej komory kąpieli, aż dno zostanie wypełnione w około 3/4. Odczekaj 30 sekund, aby agaroza lekko ostygła, nie polimeryzując całkowicie, a następnie przenieś pojedynczy embrion do centrum dna. Pod fluorescencyjnym mikroskopem stereo, używając końcówki mikropipety o objętości 10 µL, zorientuj embrion i umieść go blisko dna agarozy, aby nie wypłynął po dodaniu medium dla embrionów.Kluczowym krokiem jest upewnienie się, że embrion jest prawidłowo umieszczony w agarozie. W tych eksperymentach orientujemy embrion bocznie, jednak można go również ustawić tak, aby skupić się na obszarach grzbietowych i brzusznych. Monitoruj i koryguj położenie embrionu, dopóki agaroza nie stężeje.Następnie za pomocą pipety transferowej całkowicie napełnij zmontowaną otwartą komorę podłożem do hodowli embrionów w technice time-lapse. Po umieszczeniu całego zestawu na stoliku mikroskopu, zgodnie z protokołem tekstowym, użyj obiektywu o powiększeniu 5x, aby zlokalizować embrion. Następnie ręcznie podnieś stolik do najwyższej pozycji i użyj mikrometrycznego pokrętła ostrości, aby ustawić embrion w środku zakresu roboczego mikroskopu.Ręcznie obniż stoły i zmień obiektyw 5x na obiektyw imersyjny 25x. Ostrożnie podnieś stoły, aby ponownie ustawić embrion w polu widzenia. W oprogramowaniu wybierz tryb XYTZ, aby uzyskać wiele obrazów w odstępach czasowych T w płaszczyźnie XY na głębokości Z. Użyj widoku epifluorescencyjnego lub pola jasnego, aby określić głębokość ostrości w obszarze zainteresowania, co wyznaczy zakres stosu Z (z-stack).W tych eksperymentach boczna krawędź oka stanowi początek stosu z (z-stack). Po ustawieniu ostrości w tym miejscu należy kliknąć przycisk „begin” w oprogramowaniu. Po przesunięciu punktu ostrości w dół do linii środkowej embrionu, która stanowi koniec stosu z, należy kliknąć przycisk „end”.Kluczowym krokiem jest upewnienie się, że zakres kroku Z obejmuje obszar zainteresowania. W naszym przypadku chcemy uchwycić szerokość oka od krawędzi bocznej do przyśrodkowej. Kliknij menu służące do regulacji czasu akwizycji oraz częstotliwości obrazowania.Aby zapewnić odpowiednią regenerację fluoroforu 4 oraz przeżycie embrionu, należy zachować stosunek co najmniej jeden do trzech między czasem akwizycji stosu z (z-stack) przy włączonym laserze a czasem regeneracji przy wyłączonym laserze. Po wyznaczeniu odpowiedniego czasu regeneracji embrionu, ustaw czas pomiędzy stosami z w wyznaczonym oknie. Następnie w odpowiednim oknie ustaw całkowity czas trwania eksperymentu.Teraz należy włączyć ustawienie obrazu na żywo, aby dokonać końcowych korekt parametrów lasera. Dostosuj suwaki transmisji lasera, wzmocnienia (gain) oraz offsetu w oprogramowaniu, aby zoptymalizować obraz fluorescencyjny. Należy również, w zależności od czasu trwania eksperymentu, przewidywanego wzrostu zarodka itp., odpowiednio skorygować orientację zarodka.Upewnij się, że obszar zainteresowania pozostaje w kadrze przez cały czas trwania eksperymentu. Podczas akwizycji time-lapse wyłącz źródło światła epifluorescencyjnego, osłoń stolik odpowiednią do ochrony przed światłem tła skrzynką bezpieczeństwa laserowego, a następnie naciśnij start. Aby uzupełnić pożywkę do embrionów do time-lapse co 8-12 godzin, uzyskaj dostęp do otwartej komory kąpieli przez przesuwne drzwiczki w skrzynce bezpieczeństwa laserowego.Po wykonaniu akwizycji obrazowania otwórz pliki w oprogramowaniu do przetwarzania obrazów i zaznacz odpowiednią serię obrazów. W programie wybierz menu procesów, kliknij opcję dekonwolucji 3D i zastosuj ją, aby przeprowadzić dekonwolucję każdego stosu z (z-stack). Zaimportuj poszczególne pliki tif do oprogramowania do obróbki wideo, a następnie zaznacz wszystkie pliki tif i przeciągnij je do edytora wideo.Ustaw czas trwania każdego obrazu w filmie na 0,1 sekundy. Na koniec wyeksportuj film do pliku mov lub mp4. Przedstawione tutaj za pomocą wielofotonowego obrazowania fluorescencyjnego wzorce migracji komórek grzebienia neuronalnego czaszki, z których powstają struktury twarzoczaszki oraz przedni odcinek oka, w transgenicznych liniach rybek zebrafish sox10:EGFP oraz foxd3:GFP.Komórki grzebienia neuronalnego wykazujące ekspresję białka Sox 10 w okresie między 12 a 30 hpf migrują z brzegu cewy nerwowej do obszaru twarzoczaszki. Komórki z prosencefalonu i mezencefalonu migrują grzbietowo i brzusznie w kierunku rozwijającego się oka, aby zasiedlić mezenchym okołooczny. Jak tutaj wskazano, komórki Sox 10-dodatnie tworzą wypustek czołowo-nosowy.Komórki grzebienia neuronalnego z rombencefalonu migrują brzusznie i dają początek łukom gardzielowym. Obrazowanie poklatkowe komórek grzebienia neuronalnego wykazujących ekspresję foxd3 między 30 a 60 hpf pokazuje, że komórki te migrowały pomiędzy pucharkiem optycznym a ektodermą powierzchniową oraz przez szczelinę powiekową oznaczoną strzałką, a następnie skupiły się wokół soczewki oznaczonej gwiazdką, tworząc stroma tęczówki. Po opanowaniu tej techniki cały proces, od początku do końca, może zostać przeprowadzony w cztery dni, pod warunkiem prawidłowego wykonania.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wybierać zarodki o wysokiej fluorescencji. Początkowa konfiguracja oprogramowania może być wymagająca, ale po ustaleniu parametrów dodatkowe zmiany są zazwyczaj minimalne. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania wielofotonowej mikroskopii time-lapse do obrazowania migrujących komórek w zarodku.

multi-photon-time-lapse-imaging-to-visualize-development-real-time

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy protokół opisuje obrazowanie poszczególnych neuronów lub komórek grzebienia neuronalnego w żywych embrionach danio pruzebrzuchego. Metoda ta jest wykorzystywana do badania zachowań komórkowych oraz lokalizacji aktyny przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse.

Obrazowanie na żywo ruchliwości komórek oraz cytoszkieletu aktynowego pojedynczych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w embrionach danio pręgowanego

W tym filmie przedstawiono techniki wielokolorowego konfokalnego obrazowania time-lapse oraz celowanej ablacji komórek. Obrazowanie time-lapse jest wykorzystywane do monitorowania zachowania wielu wybranych typów komórek in vivo. Celowana ablacja komórek ułatwia badanie funkcji obwodów neuronalnych oraz paradygmatów regeneracji neuronów specyficznych dla danej grupy komórek.

Wielokolorowe obrazowanie poklatkowe transgenicznych rybek zebrafish: wizualizacja komórek macierzystych siatkówki aktywowanych przez ukierunkowaną ablację komórek neuronalnych

Niniejszy film prezentuje metodę wykorzystującą połączenie elektroporacji i mikroskopii konfokalnej do obrazowania na żywo pojedynczych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego. W ten sposób można przeprowadzić analizę in vivo rozwoju komórek progenitorowych neuronów przedmózgowia na poziomie klonalnym.

Obrazowanie live w trybie time-lapse klonalnie powiązanych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego

Źródło: Williams, A. L., et al. Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia protokół obrazowania poklatkowego wielofotonowego w celu wizualizacji migracji komórek grzebienia nerwowego w zarodku danio pręgowanego w czasie rzeczywistym z wysoką rozdzielczością.

Wizualizacja migracji komórek grzebienia nerwowego w zarodku danio pręgowanego za pomocą wielofotonowego obrazowania poklatkowego

Wizualizacja danych eksperymentalnych stała się kluczowym elementem prezentacji wyników społeczności naukowej. Generowanie poklatkowych zapisów na żywo rosnących zarodków przyczynia się do lepszej prezentacji i zrozumienia złożonych procesów rozwojowych. Protokół ten jest przewodnikiem krok po kroku dotyczącym znakowania komórek poprzez fotokonwersję białka kaede u danio pręgowanego.

Wizualizacja rozwoju twarzoczaszki w sox10: transgeniczna linia danio pręgowanego kaede przy użyciu poklatkowej mikroskopii konfokalnej

Obrazowanie konfokalne w czasie jest potężną techniką przydatną do charakteryzowania rozwoju embrionalnego. W tym miejscu opisujemy metodologię i charakteryzujemy morfogenezę twarzoczaszki w zarodkach typu dzikiego, a także pdgfra, smad5 i zmutowanych smo.

Analiza morfogenezy twarzoczaszki u danio pręgowanego przy użyciu mikroskopii konfokalnej 4D

Tutaj prezentujemy uniwersalną metodę montażu, która pozwala na długoterminowe obrazowanie poklatkowe rozwoju tylnej części ciała żywych zarodków danio pręgowanego bez zakłócania normalnego rozwoju.

Uniwersalna metoda montażu do długoterminowego obrazowania rozwoju danio pręgowanego

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem, które może być użyte do zbadania mechanizmów komórkowych leżących u podstaw rozwoju układu nerwowego. W tym miejscu opisujemy technikę wykorzystania poklatkowej mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dużej liczby wielokolorowych komórek znakowanych Brainbow w czasie rzeczywistym w rozwijającym się układzie nerwowym danio pręgowanego.

Wizualizacja rozwijającego się mózgu u żyjących danio pręgowanych za pomocą Brainbow i poklatkowego obrazowania konfokalnego

Ten protokół opisuje podejście do etykietowania in toto i wielowymiarowego obrazowania wczesnego rozwoju oczu danio pręgowanego. Opisujemy znakowanie, osadzanie i obrazowanie czterowymiarowe (4D) za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej oraz rozważania dotyczące optymalizacji pozyskiwania zestawów danych do analizy mechanizmów morfogenezy panewki wzrokowej.

4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

Tutaj dostępny jest protokół do obrazowania poklatkowego morfogenezy oka za pomocą dostępnego na rynku mikroskopu lightsheet i stacji roboczej do przetwarzania obrazu w celu analizy uzyskanych danych. Protokół ten szczegółowo opisuje procedury znieczulenia zarodka, zatopienia w agarozie o niskiej temperaturze topnienia, zawieszenia w komorze obrazowania, ustawienia parametrów obrazowania i wreszcie analizy danych obrazowania za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

Wizualizacja morfogenezy oka za pomocą mikroskopii Lightsheet przy użyciu transgenicznego danio pręgowanego rx3:GFP

Pokazujemy metodę, która wykorzystuje szybką skaningową mikroskopię konfokalną do wykonywania na żywo obrazowania komórek mikrogleju w rozwijającym się tektum wzrokowym danio pręgowanego, umożliwiając analizę dynamiki tych komórek in vivo.

Obrazowanie na żywo i charakterystyka dynamiki mikrogleju w zarodku danio pręgowanego

Poznaj wielofotonowe obrazowanie poklatkowe do wizualizacji migracji komórek grzebienia nerwowego w zarodkach Danio rerio. Ta metoda umożliwia głębszą penetrację tkanek i zmniejszoną fototoksyczność w badaniach biologii rozwoju.

Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal

Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów