Przygotowanie i analiza morfologiczna kultur komórek grzebienia nerwowego czaszki piskląt

Komórki grzebienia nerwowego emigrują z fałdów nerwowych czaszki w zarodkach lub po umieszczeniu w hodowli. Zapewnia to wygodną metodę izolowania pierwotnych migrujących komórek grzebienia nerwowego bez dysocjacji komórek. Podczas gdy migracja grzebieni nerwowych zwykle zachodzi w trójwymiarowym środowisku embrionalnym, hodowla dwuwymiarowa umożliwia wizualizację i badanie procesów związanych z migracją.

Chociaż istnieją protokoły hodowli fałdów nerwowych czaszki, metoda ta wymaga treningu i kroków specyficznych dla organizmu. Ten film przedstawia techniki ułatwiające powtarzalne przygotowanie kultur fałdów nerwowych czaszki piskląt. Początkujący często zmagają się z preparowaniem i powlekaniem fałdów nerwowych oraz oceną wyników hodowli.

Postępowanie zgodnie z wytycznymi dotyczącymi sekcji i zastosowanie opisanej tutaj analizy morfometrycznej pozwala na uzyskanie spójnych, ilościowych wyników. Na początek umieść zapłodnione jaja w pozycji pionowej w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 38 stopni Celsjusza. Po wyjęciu jaj z inkubatora należy zdezynfekować skorupki, dokładnie spryskując je 70% etanolem i pozostawiając do wyschnięcia.

Do utrwalania i barwienia kultur należy użyć szklanych szkiełek nakrywkowych umieszczonych w wielodołkowym naczyniu do hodowli tkankowych i odpipetować wystarczającą ilość roztworu fibronektyny, aby pokryć dno studzienki. Następnie załóż pokrywkę i inkubuj płytkę z roztworem fibronektyny w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 38 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę, jednocześnie preparując fałdy nerwowe. Użyj kleszczy, aby zrobić mały otwór w skorupce na 1/4 do 1/3 długości jajka.

Ostrożnie włóż kleszcze do małego otworu, uważając, aby nie naruszyć żółtka. Następnie przetnij skorupkę jajka wokół jajka, usuń górną część skorupki jajka i umieść zarodek do izolacji. Przygotuj zarodek, delikatnie używając płaskiej krawędzi zamkniętych, kleszczy, aby zetrzeć nadmiar albuminy z powierzchni żółtka pokrywającego zarodek.

Za pomocą kleszczy umieść ramkę nośną z bibuły filtracyjnej nad zarodkiem, tak aby zarodek znajdował się w okienku ramki. Delikatnie dociśnij bibułę filtracyjną, aby przylegała do żółtka. Wytnij na zewnątrz ramy bibuły filtracyjnej nożyczkami do preparowania.

Użyj kleszczyków lub końcówek nożyczek, aby chwycić krawędź ramki i delikatnie oderwij zarodek od żółtka. Umieść zarodek papierową ramką do dołu na 60 lub 100-mililitrowej szalce Petriego wypełnionej tacką Ringera z paciorkowcem. Trzymaj naczynie z zarodkami na lodzie, jeśli zbierasz je do dalszej aplikacji wrażliwej na RNA lub białko.

Przenieś zarodek do czystego naczynia zawierającego roztwór wstrzykiwacza i paciorkowca Ringera. Delikatnie przesuwaj zarodek w przód iw tył, aby usunąć żółtko, które zasłania widok, i wymień roztwór paciorkowca Ringera lub przenieś go do świeżego naczynia, jeśli stanie się mętny. Umieść zarodek grzbietową i ramową stroną do góry pod mikroskopem preparacyjnym.

Pozostaw zarodek na papierowej ramce, aby był rozciągnięty i utrzymany na miejscu. Następnie usuń błonę witelinową, używając kleszczy, aby odsłonić fałdy nerwowe. Obejmują tkankę ogonową do rozszerzających się pęcherzyków wzrokowych i rostralną do tyłomózgowia, gdzie zwężenia rombomerów dopiero zaczynają się pojawiać.

Za pomocą nożyczek sprężynowych ostrożnie wytnij fałdy nerwowe śródmózgowia. Należy zwrócić uwagę, aby wyciąć najbardziej grzbietową część fałdu nerwowego przy minimalnym zanieczyszczeniu cewy nerwowej i ektodermy nienerwowej, a następnie przenieść fałdy nerwowe do czystego naczynia zawierającego roztwór paciorkowca Ringera za pomocą pipetora P20 lub sterylnej szklanej pipety Pasteura przepłukanej żółtkiem roztworu paciorkowca Ringera. Przechowuj zebrane fałdy na lodzie podczas preparowania dodatkowych fałd.

Po wyjęciu szalki hodowlanej z inkubatora użyj pipety lub pipety Pasteura, aby usunąć roztwór fibronektyny z szkiełek nakrywkowych, szalki lub studzienki. Po przepłukaniu podłoża pokrytego fibronektyną roztworem pióra i paciorkowca Ringera, dodaj odpowiednią ilość kompletnej pożywki hodowlanej do naczynia lub studzienki. Aby zablokować plastik i zapobiec przywieraniu chusteczki, użyj pipetora P20 lub P200 i przepłucz końcówkę pipety roztworem żółtka Ringera ze wstrzykiwaczem i paciorkowcem.

Następnie przenieś izolowane fałdy nerwowe w kierunku środka szkiełka nakrywkowego pokrytego fibronektyną, uważając, aby przenieść jak najmniej roztworu pióra Ringera. Po pozostawieniu eksplantatów na 10 do 15 minut, umieść je w wilgotnej komorze o temperaturze 38 stopni Celsjusza, powoli i ostrożnie przenosząc naczynie hodowlane z platerowanymi fałdami nerwowymi. Usuń pożywkę hodowlaną za pomocą pipety Pasteura i przepłucz studzienki wysterylizowanym przez filtr PBS.

Dodaj 4% paraformaldehydu i trzymaj go na wytrząsarce platformowej przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji usunąć paraformaldehyd, przepłukać studzienki trzykrotnie PBS i dodać PBST zawierający 5% surowicy. Teraz odpipetuj 30 mikrolitrów 200-nanomolowej zieleni Oregon Green sprzężonej falloidyny na gładką powierzchnię dla każdego szkiełka nakrywkowego.

Za pomocą kleszczy usuń szkiełko nakrywkowe z PBST zawierającego 5% surowicy, upewniając się, że komórki są skierowane do góry. Odsączyć nadmiar płynu, krótko dotykając krawędzi szkiełka nakrywkowego delikatną wycieraczką zadaniową. Delikatnie umieść każdą komórkę szkiełka nakrywkowego stroną do dołu na kropli rozcieńczonej falloidyny i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Po okresie inkubacji wyjmij szkiełko nakrywkowe z roztworu barwiącego i umieść je z powrotem w naczyniu hodowlanym, odwracając je tak, aby komórka była skierowana do góry. Upewnij się, że szkiełko nakrywkowe jest pokryte PBST i umieść je na wytrząsarce platformy na 10 minut, trzymając szkiełka nakrywkowe przykryte i w ciemności. Usuń PBST i powtórz mycie szkiełek nakrywkowych dwukrotnie, co daje w sumie trzy 10-minutowe prania.

Umieść jedną kroplę podłoża montażowego na szkiełku mikroskopowym. Zamontuj komórkę szkiełka nakrywkowej stroną do dołu, powoli opuszczając szkiełko nakrywkowe pod kątem na nośnik montażowy, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków, i poczekaj, aż nośnik zastygnie przed obrazowaniem. Na koniec zobrazuj poplamione komórki i wyeksportuj je jako pliki TIFF.

Komórki grzebienia nerwowego zaczęły wyłaniać się z przylegających eksplantatów fałdów nerwowych w ciągu trzech do czterech godzin od inkubacji, a migracja została zakończona po około 20 godzinach. Migrujące komórki grzebienia nerwowego zostały oznaczone za pomocą HNK-1, a większość komórek wydawała się być HNK-1 dodatnia. Migrujące komórki grzebienia nerwowego uwidoczniono poprzez barwienie nitkowatej aktyny falloidyną.

Obrazy komórek barwionych falloidyną przetworzono za pomocą ImageJ w celu uzyskania obrazu progowego, w którym komórki wydawały się czarne z białym tłem. Obraz progowy został przeanalizowany, a różne pomiary wyświetlone na kontrastowych wykresach słupkowych lub wykresach skrzypcowych. Na przykład średnia powierzchnia 69 analizowanych komórek wynosiła około 802,11 mikrometrów kwadratowych, w zakresie od 60,27 do 2 664,53 mikrometrów kwadratowych.

Okrągłość odzwierciedla wystającą wartość ogniwa i waha się od 0,101 do 0,875. Niższe wartości wskazują wydłużony kształt, podczas gdy wartość jeden oznacza idealne koło. Większość komórek wykazywała wydłużony kształt, który najłatwiej dostrzec na wykresie skrzypcowym.

Migrujące komórki grzebienia nerwowego w tej dziedzinie miały średni współczynnik proporcji około 2,13, a współczynnik proporcji jeden wskazuje na symetryczny kształt. Staranne wycinanie i posiewanie roślin ma kluczowe znaczenie dla udanych kultur. Pozwól, aby fałdy nerwowe osiadły ściętą stroną do dołu przez 10 do 15 minut, a następnie powoli przenieś do inkubatora, aby zwiększyć przyczepność.

Wariacje tych technik obejmują przejściową manipulację genetyczną przed hodowlą i obrazowanie poklatkowe podczas inkubacji. Ponadto protokół ten pozwala na gromadzenie populacji premigrujących i migrujących komórek grzebienia nerwowego do analizy na poziomie omiki.