Name: Przygotowanie i analiza morfologiczna kultur komórek grzebienia nerwowego czaszki piskląt (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Poznaj izolację komórek grzebienia nerwowego z piskląt w kulturze 2D. Ta metoda umożliwia wizualizację migracji i analizę morfologiczną bez rozdzielania komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Corinne A. Fairchild i Katie L. Vermillion, które uczestniczyły w rozwoju naszej wersji protokołu hodowli fałdów nerwowych czaszki piskląt.

<ol><li>Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+border%3A+Induction%2C+specification+and+maturation+of+the+territory+that+generates+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells.</a> Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).</li>
<li>Tang, W., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+lineage+analysis%3A+From+past+to+future+trajectory%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural crest lineage analysis: From past to future trajectory.</a> Development. 147 (20), (2021).</li>
<li>Piacentino, M. L., Li, Y., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+and+different+migration+strategies+as+viewed+from+the+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition and different migration strategies as viewed from the neural crest.</a> Current Opinion in Cell Biology. 66, 43-50 (2020).</li>
<li>McLennan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+cells+bulldoze+through+the+microenvironment+using+Aquaporin+1+to+stabilize+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural crest cells bulldoze through the microenvironment using Aquaporin 1 to stabilize filopodia.</a> Development. 147 (1), 185231(2020).</li>
<li>Carmona-Fontaine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+fragment+C3a+controls+mutual+cell+attraction+during+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Complement fragment C3a controls mutual cell attraction during collective cell migration.</a> Developmental Cell. 21 (6), 1026-1037 (2011).</li>
<li>Giovannone, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slits+affect+the+timely+migration+of+neural+crest+cells+via+robo+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Slits affect the timely migration of neural crest cells via robo receptor.</a> Developmental Dynamics. 241 (8), 1274-1288 (2012).</li>
<li>Vermillion, K. L., Lidberg, K. A., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+protein+methylation+is+essential+for+neural+crest+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic protein methylation is essential for neural crest migration.</a> Journal of Cell Biology. 204 (1), 95-109 (2014).</li>
<li>Yang, X., Li, J., Zeng, W., Li, C., Mao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elongator+Protein+3+%28Elp3%29+stabilizes+Snail1+and+regulates+neural+crest+migration+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Elongator Protein 3 (Elp3) stabilizes Snail1 and regulates neural crest migration in Xenopus.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li>
<li>Gonzalez Malagon, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+synthase+kinase+3+controls+migration+of+the+neural+crest+lineage+in+mouse+and+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-15 (2018).</li>
<li>Bhattacharya, D., Azambuja, A. P., Simoes-Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+promotes+neural+crest+migration+via+yap%2Ftead+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming promotes neural crest migration via yap/tead signaling.</a> Developmental Cell. 53 (2), 199-211 (2020).</li>
<li>Jacques-Fricke, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+NSD3-dependent+neural+crest+gene+expression+reveals+known+and+novel+candidate+regulatory+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Profiling NSD3-dependent neural crest gene expression reveals known and novel candidate regulatory factors.</a> Developmental Biology. 475, 118-130 (2021).</li>
<li>Bronner-Fraser, M., García-Castro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+4+manipulations+of+neural+crest+cells+or+their+migratory+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 4 manipulations of neural crest cells or their migratory pathways.</a> Methods in Cell Biology. 87, 75-96 (2008).</li>
<li>Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+xenopus+laevis+neural+crest+for+in+vitro+explant+culture+or+in+vivo+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51118(2014).</li>
<li>Malagon, S. G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection%2C+culture+and+analysis+of+primary+cranial+neural+crest+cells+from+mouse+for+the+study+of+neural+crest+cell+delamination+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection, culture and analysis of primary cranial neural crest cells from mouse for the study of neural crest cell delamination and migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60051(2019).</li>
<li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+delamination+and+migration%3A+From+epithelium-to-mesenchyme+transition+to+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural crest delamination and migration: From epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration.</a> Developmental Biology. 366 (1), 34-54 (2012).</li>
<li>Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microscalpels+by+electrolysis+of+tungsten+wire+in+a+meniscus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 50 (1), 123-127 (1993).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li>
<li>Gammill, L. S., Jacques-Fricke, B., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryological+and+genetic+manipulation+of+chick+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryological and genetic manipulation of chick development.</a> Methods in Molecular Biology. 1920, 75-97 (2019).</li>
<li>Vandekerckhove, J., Deboben, A., Nassal, M., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phalloidin+binding+site+of+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The phalloidin binding site of F-actin.</a> The EMBO Journal. 4 (11), 2815-2818 (1985).</li>
<li>Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+early+stages+of+trunk+neural+crest+migration+in+avian+embryos+using+monoclonal+antibody+HNK-1%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of the early stages of trunk neural crest migration in avian embryos using monoclonal antibody HNK-1.</a> Developmental Biology. 115 (1), 44-55 (1986).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Soille, P., Vincent, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+watersheds+in+digital+pictures+via+flooding+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Communications+and+Image+Processing+%2790%3A+Fifth+in+a+Series%22%5BJournal%5D)">Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations.</a> Visual Communications and Image Processing '90: Fifth in a Series. (1360), 240-250 (1990).</li>
<li>Haupt, A., Minc, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cells+sense+their+own+shape+-+mechanisms+to+probe+cell+geometry+and+their+implications+in+cellular+organization+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">How cells sense their own shape - mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function.</a> Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).</li>
<li>Ezin, M., Fraser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+11+time-lapse+imaging+of+the+early+avian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 11 time-lapse imaging of the early avian embryo.</a> Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).</li>
<li>Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+ovo+live+imaging+of+avian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">In ovo live imaging of avian embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 5 (6), (2010).</li>
<li>McKinney, M. C., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+neural+crest+cell+epithelial-to-mesenchymal+transition+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the neural crest cell epithelial-to-mesenchymal transition in the chick embryo.</a> Methods in Molecular Biology. 2179, 107-114 (2021).</li>
<li>Gustafson, C. M., Roffers-Agarwal, J., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+cranial+neural+crest+cells+release+extracellular+vesicles+that+are+critical+for+their+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Chick cranial neural crest cells release extracellular vesicles that are critical for their migration.</a> Journal of Cell Science. , (2022).</li>
<li>Williams, R., Sauka-Spengler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+ovo+electroporation+of+early+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Ex ovo electroporation of early chicken embryos.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100424(2021).</li>
<li>Moulton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+morpholinos+to+control+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Nucleic+Acid+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Using morpholinos to control gene expression.</a> Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 68 (1), 4-30 (2017).</li>
<li>Gandhi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-plasmid+approach+for+genome+editing+coupled+with+long-term+lineage+analysis+in+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A single-plasmid approach for genome editing coupled with long-term lineage analysis in chick embryos.</a> Development. 148 (7), (2021).</li>
<li>Williams, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+the+Global+Neural+Crest+Gene+Regulatory+Network+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of the Global Neural Crest Gene Regulatory Network In Vivo.</a> Developmental Cell. 51 (2), 255-267 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Opisana tutaj technika zapewnia adaptowalną metodę izolowania fałdów nerwowych piskląt i posiewania ich w celu stworzenia kultur migrujących czaszkowych NCC. Kultury te zapewniają uproszczone warunki 2D do łatwej analizy migracji i morfologii NCC piskląt, które mogą uzupełniać bardziej wymagające technicznie metody obrazowania ovo 24,25,26. Chociaż ta metoda in vitro jest stosunkowo prosta, spójne wyniki zależą...

Komórki grzebienia neuronalnego (NCCs) stanowią przejściową populację komórek w embrionach kręgowców. NCCs są specyfikowane na granicach płytki neuralnej i przechodzą przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT), aby migrować z grzbietowej części cewy nerwowej1. Po EMT komórki NCCs rozprzestrzeniają się szeroko w całym embrionie, ostatecznie różnicując się i przyczyniając do powstania różnych struktur, w tym szkieletu czaszkowo-twarzowego, odcinka wypływowego serca oraz większości obwodowego układu nerwowego2. Zmiany w polaryzacji komórek, cytoszkielecie i właściwościach adhezyjnych leżą u podstaw tego przejścia z populacji komórek przedmigracyjnych w populację migrującą3. Badanie EMT i migracji NCCs pozwala zrozumieć fundamentalne mechanizmy ruchliwości komórek i dostarcza wiedzy niezbędnej w dążeniach do zapobiegania oraz leczenia wad wrodzonych i przerzutów nowotworowych.
Podczas gdy analizy in vivo są niezbędne do zrozumienia procesów rozwojowych NCC w kontekście embrionalnym, metody in vitro oferują dostęp wizualny i fizyczny, który ułatwia dodatkowe kierunki badawcze. W uproszczonym środowisku 2D można ocenić morfologię NCC, struktury cytoszkieletu oraz przebyty dystans migracji. Ponadto można analizować wpływ zaburzeń genetycznych lub czynników rozpuszczalnych na zachowania migracyjne ruchliwych NCC4,5,6,7,8,9,10. Dodatkowo izolowane premigracyjne lub migrujące NCC można zbierać, łączyć i wykorzystywać w metodologiach wysokoprzepustowych do badania regulacji rozwojowej NCC poprzez profilowanie proteomiczne, transkryptomiczne i epigenomiczne7,11. Chociaż dostępne są metody przygotowania czaszkowych NCC z różnych modelowych organizmów rozwojowych12,13,14, niniejszy artykuł przedstawia mechanikę podejścia dla osób, które po raz pierwszy uczą się hodować czaszkowe NCC z embrionów kurzych.
Niniejszy protokół opisuje wszechstronną technikę przygotowywania kultur komórek grzebienia neuronalnego (NCC) z czaszki kurczaka (Rysunek 1). Ponieważ NCC łatwo migrują z wyeksplantowanych fałdów neuronalnych na podłoże hodowlane, NCC kurczaka naturalnie oddzielają się od tkanki embrionalnej, co umożliwia łatwe generowanie kultur pierwotnych. Ze względu na to, że NCC śródmózgowia migrują en masse z czaszkowych fałdów neuronalnych (w przeciwieństwie do przedłużonej delaminacji komórka po komórce w pniu15), kultury te składają się głównie z migrujących komórek czaszkowego grzebienia neuronalnego, a wstępne wycięcie fałdu neuronalnego stanowi metodę pozyskiwania przedmigracyjnych NCC. Szczegółowo opisano podstawową metodę preparowania i hodowli czaszkowych fałdów neuronalnych kurczaka oraz przedstawiono sugestie dotyczące różnych zastosowań i modyfikacji tej metody.
<img alt="Proces różnicowania neuronów, schemat ilustrujący ekstrakcję komórek i hodowlę w szalce Petriego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63799/63799fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczny przegląd protokołu hodowli fałdów neuralnych głowy kurczaka. (A,B) Fałdy neuralne głowy (obrysowane na niebiesko) są wycinane z zarodka kurczaka z pięcioma somytami (widok grzbietowy na A). Szare pasma to półksiężyc sercowy. (C) Po wysianiu na fibronektynę, migrujące komórki grzebienia neuralnego wyłaniają się z fałdów neuralnych i rozprzestrzeniają się po podłożu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63799/63799fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>AxioObserver wyposażony w konfokalną głowicę skanującą LSM710 sterowaną za pomocą oprogramowania ZEN 3.0 SR&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Używany alfa Plan-Apochromat 100x/1.46 Olej DIC M27 obiektyw</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia komorowe (szklane dno, pojedyncze lub dzielone)</td><td>MatTek; Cell Vis</td><td>P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) X000NOK1OJ (Cellvis)</td><td>Pojedyncza komora 35 mm lub 4-komorowa 35 mm</td></tr><tr><td>Szkło osłonowe</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>633029, 633031, 633033, 633035, 633037</td><td>okręgi, 0,13&ndash; Grubość 0,17 mm, dostępna w średnicach 12-25 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11320033</td><td>Alternatywa dla podłoża L15</td></tr><tr><td>Inkubator jaj</td><td>Sportsman</td><td>1502</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40008A Bibuła</td><td></td></tr><tr><td>filtracyjna</td><td>Kleszcze chromatograficzne</td><td>Whatman</td><td></td> grade 3MM</tr><tr><td>()</td><td>Fisher Scientific; Thomas Scientific</td><td>08-890 (Fisher); 1141W97 (Thomas)</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze (drobne)</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>11252-20</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Obraz J</td><td>https://fiji.sc/</td><td></td> <td>Darmowe oprogramowanie do analizy obrazu</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>L15 media</td><td>Invitrogen</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Podłoża montażowe (Vectashield lub ProLong Gold)</td><td>Vector Laboratories; Thermofisher Scientific</td><td>H-1700 (Vectashield); P36930 (ProPrzedłuż Złoto)</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15140-148</td><td>10 000 jednostek/ml penicyliny; 10 000 mg/ml Streptomycyna</td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>VWR (lub podobne)</td><td></td><td>60 mm, 100 mm</td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td>dostępne wiele fluroforów</td></tr><tr><td>Uchwyt na szpilki</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td>Do igły wolframowej (alternatywa dla nożyczek sprężynowych)</td></tr><tr><td>Nożyczki (rozwarstwienie)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-10</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>Narzędzia</td> <td>do nauki15000-08</td><td>Krawędź tnąca 2,5 mm (alternatywa dla igły wolframowej)</td></tr>Filtry strzykawkowe <tr><td>Sylgard</td><td>Krayden</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLGVM33RS</td><td>Millex-GV Filtr strzykawkowy, 0,22 i mikro; m, PVDF, 33 mm, sterylizowane promieniami gamma</td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli tkankowych</td><td>Sarstedt</td><td>83-3900</td><td>Szalki hodowlane 35 mm do masowych kultur fałdów nerwowych</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Drut wolframowy</td><td>Różnorodność źródeł</td><td></td><td>Średnica 0,01" dla igły wolframowej (alternatywa dla nożyczek sprężynowych)</td></tr></tbody></table>

przygotowanie i analiza morfologiczna kultur komórek grzebienia nerwowego czaszki piskląt

Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

Podczas rozwoju kręgowców, komórki grzebienia nerwowego (NCC) intensywnie migrują i różnicują się w różne typy komórek, które przyczyniają się do powstania struktur takich jak szkielet twarzoczaszki i obwodowy układ nerwowy. Chociaż zrozumienie migracji NCC w kontekście zarodka 3D ma kluczowe znaczenie, wyizolowanie komórek migrujących w hodowli 2D ułatwia wizualizację i charakterystykę funkcjonalną, uzupełniając badania embrionalne. Niniejszy protokół demonstruje metodę izolowania fałdów nerwowych czaszki piskląt w celu wygenerowania pierwotnych kultur NCC. Migrujące NCC wyłaniają się z eksplantatów fałdów nerwowych pokrytych na podłożu pokrytym fibronektyną. Powoduje to powstawanie rozproszonych, przylegających populacji NCC, które można ocenić za pomocą barwienia i ilościowych analiz morfologicznych. To uproszczone podejście do hodowli jest wysoce elastyczne i można je łączyć z innymi technikami. Na przykład emigracja i zachowania migracyjne NCC mogą być oceniane za pomocą obrazowania poklatkowego lub badane funkcjonalnie poprzez włączenie inhibitorów lub eksperymentalnych manipulacji ekspresją genów (np. DNA, morfolino lub elektroporacja CRISPR). Ze względu na swoją wszechstronność, metoda ta zapewnia potężny system do badania rozwoju NCC czaszki.

Przegląd obecnego protokołu przedstawiono na Rysunku 1. Inkubowane jaja otwarto, a żółtko wraz z zarodkiem na powierzchni wyizolowano, delikatnie wlewając zawartość na dłoń w rękawiczce (Rysunek 2A,B). Po usunięciu albuminy (Rysunek 2C), do błony żółtka otaczającej zarodek przyłożono ramki z papieru filtracyjnego, aby ułatwić wycięcie i uniesienie zarodka z żółtka, które zaczyna wypływać po przecięciu błon żółtka (<...

Ten wszechstronny protokół opisuje izolację premigrujących komórek grzebienia nerwowego (NCC) poprzez wycięcie fałdów nerwowych czaszki z zarodków piskląt. Po posiewie i inkubacji migrujące NCC wyłaniają się z eksplantatów fałdów nerwowych, co pozwala na ocenę morfologii i migracji komórek w uproszczonym środowisku 2D.

Przygotowanie i analiza morfologiczna kultur komórek grzebienia nerwowego czaszki piskląt

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like ...

Komórki grzebienia nerwowego emigrują z fałdów nerwowych czaszki w zarodkach lub po umieszczeniu w hodowli. Zapewnia to wygodną metodę izolowania pierwotnych migrujących komórek grzebienia nerwowego bez dysocjacji komórek. Podczas gdy migracja grzebieni nerwowych zwykle zachodzi w trójwymiarowym środowisku embrionalnym, hodowla dwuwymiarowa umożliwia wizualizację i badanie procesów związanych z migracją.Chociaż istnieją protokoły hodowli fałdów nerwowych czaszki, metoda ta wymaga treningu i kroków specyficznych dla organizmu. Ten film przedstawia techniki ułatwiające powtarzalne przygotowanie kultur fałdów nerwowych czaszki piskląt. Początkujący często zmagają się z preparowaniem i powlekaniem fałdów nerwowych oraz oceną wyników hodowli.Postępowanie zgodnie z wytycznymi dotyczącymi sekcji i zastosowanie opisanej tutaj analizy morfometrycznej pozwala na uzyskanie spójnych, ilościowych wyników. Na początek umieść zapłodnione jaja w pozycji pionowej w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 38 stopni Celsjusza. Po wyjęciu jaj z inkubatora należy zdezynfekować skorupki, dokładnie spryskując je 70% etanolem i pozostawiając do wyschnięcia.Do utrwalania i barwienia kultur należy użyć szklanych szkiełek nakrywkowych umieszczonych w wielodołkowym naczyniu do hodowli tkankowych i odpipetować wystarczającą ilość roztworu fibronektyny, aby pokryć dno studzienki. Następnie załóż pokrywkę i inkubuj płytkę z roztworem fibronektyny w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 38 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę, jednocześnie preparując fałdy nerwowe. Użyj kleszczy, aby zrobić mały otwór w skorupce na 1/4 do 1/3 długości jajka.Ostrożnie włóż kleszcze do małego otworu, uważając, aby nie naruszyć żółtka. Następnie przetnij skorupkę jajka wokół jajka, usuń górną część skorupki jajka i umieść zarodek do izolacji. Przygotuj zarodek, delikatnie używając płaskiej krawędzi zamkniętych, kleszczy, aby zetrzeć nadmiar albuminy z powierzchni żółtka pokrywającego zarodek.Za pomocą kleszczy umieść ramkę nośną z bibuły filtracyjnej nad zarodkiem, tak aby zarodek znajdował się w okienku ramki. Delikatnie dociśnij bibułę filtracyjną, aby przylegała do żółtka. Wytnij na zewnątrz ramy bibuły filtracyjnej nożyczkami do preparowania.Użyj kleszczyków lub końcówek nożyczek, aby chwycić krawędź ramki i delikatnie oderwij zarodek od żółtka. Umieść zarodek papierową ramką do dołu na 60 lub 100-mililitrowej szalce Petriego wypełnionej tacką Ringera z paciorkowcem. Trzymaj naczynie z zarodkami na lodzie, jeśli zbierasz je do dalszej aplikacji wrażliwej na RNA lub białko.Przenieś zarodek do czystego naczynia zawierającego roztwór wstrzykiwacza i paciorkowca Ringera. Delikatnie przesuwaj zarodek w przód iw tył, aby usunąć żółtko, które zasłania widok, i wymień roztwór paciorkowca Ringera lub przenieś go do świeżego naczynia, jeśli stanie się mętny. Umieść zarodek grzbietową i ramową stroną do góry pod mikroskopem preparacyjnym.Pozostaw zarodek na papierowej ramce, aby był rozciągnięty i utrzymany na miejscu. Następnie usuń błonę witelinową, używając kleszczy, aby odsłonić fałdy nerwowe. Obejmują tkankę ogonową do rozszerzających się pęcherzyków wzrokowych i rostralną do tyłomózgowia, gdzie zwężenia rombomerów dopiero zaczynają się pojawiać.Za pomocą nożyczek sprężynowych ostrożnie wytnij fałdy nerwowe śródmózgowia. Należy zwrócić uwagę, aby wyciąć najbardziej grzbietową część fałdu nerwowego przy minimalnym zanieczyszczeniu cewy nerwowej i ektodermy nienerwowej, a następnie przenieść fałdy nerwowe do czystego naczynia zawierającego roztwór paciorkowca Ringera za pomocą pipetora P20 lub sterylnej szklanej pipety Pasteura przepłukanej żółtkiem roztworu paciorkowca Ringera. Przechowuj zebrane fałdy na lodzie podczas preparowania dodatkowych fałd.Po wyjęciu szalki hodowlanej z inkubatora użyj pipety lub pipety Pasteura, aby usunąć roztwór fibronektyny z szkiełek nakrywkowych, szalki lub studzienki. Po przepłukaniu podłoża pokrytego fibronektyną roztworem pióra i paciorkowca Ringera, dodaj odpowiednią ilość kompletnej pożywki hodowlanej do naczynia lub studzienki. Aby zablokować plastik i zapobiec przywieraniu chusteczki, użyj pipetora P20 lub P200 i przepłucz końcówkę pipety roztworem żółtka Ringera ze wstrzykiwaczem i paciorkowcem.Następnie przenieś izolowane fałdy nerwowe w kierunku środka szkiełka nakrywkowego pokrytego fibronektyną, uważając, aby przenieść jak najmniej roztworu pióra Ringera. Po pozostawieniu eksplantatów na 10 do 15 minut, umieść je w wilgotnej komorze o temperaturze 38 stopni Celsjusza, powoli i ostrożnie przenosząc naczynie hodowlane z platerowanymi fałdami nerwowymi. Usuń pożywkę hodowlaną za pomocą pipety Pasteura i przepłucz studzienki wysterylizowanym przez filtr PBS.Dodaj 4% paraformaldehydu i trzymaj go na wytrząsarce platformowej przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji usunąć paraformaldehyd, przepłukać studzienki trzykrotnie PBS i dodać PBST zawierający 5% surowicy. Teraz odpipetuj 30 mikrolitrów 200-nanomolowej zieleni Oregon Green sprzężonej falloidyny na gładką powierzchnię dla każdego szkiełka nakrywkowego.Za pomocą kleszczy usuń szkiełko nakrywkowe z PBST zawierającego 5% surowicy, upewniając się, że komórki są skierowane do góry. Odsączyć nadmiar płynu, krótko dotykając krawędzi szkiełka nakrywkowego delikatną wycieraczką zadaniową. Delikatnie umieść każdą komórkę szkiełka nakrywkowego stroną do dołu na kropli rozcieńczonej falloidyny i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Po okresie inkubacji wyjmij szkiełko nakrywkowe z roztworu barwiącego i umieść je z powrotem w naczyniu hodowlanym, odwracając je tak, aby komórka była skierowana do góry. Upewnij się, że szkiełko nakrywkowe jest pokryte PBST i umieść je na wytrząsarce platformy na 10 minut, trzymając szkiełka nakrywkowe przykryte i w ciemności. Usuń PBST i powtórz mycie szkiełek nakrywkowych dwukrotnie, co daje w sumie trzy 10-minutowe prania.Umieść jedną kroplę podłoża montażowego na szkiełku mikroskopowym. Zamontuj komórkę szkiełka nakrywkowej stroną do dołu, powoli opuszczając szkiełko nakrywkowe pod kątem na nośnik montażowy, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków, i poczekaj, aż nośnik zastygnie przed obrazowaniem. Na koniec zobrazuj poplamione komórki i wyeksportuj je jako pliki TIFF.Komórki grzebienia nerwowego zaczęły wyłaniać się z przylegających eksplantatów fałdów nerwowych w ciągu trzech do czterech godzin od inkubacji, a migracja została zakończona po około 20 godzinach. Migrujące komórki grzebienia nerwowego zostały oznaczone za pomocą HNK-1, a większość komórek wydawała się być HNK-1 dodatnia. Migrujące komórki grzebienia nerwowego uwidoczniono poprzez barwienie nitkowatej aktyny falloidyną.Obrazy komórek barwionych falloidyną przetworzono za pomocą ImageJ w celu uzyskania obrazu progowego, w którym komórki wydawały się czarne z białym tłem. Obraz progowy został przeanalizowany, a różne pomiary wyświetlone na kontrastowych wykresach słupkowych lub wykresach skrzypcowych. Na przykład średnia powierzchnia 69 analizowanych komórek wynosiła około 802,11 mikrometrów kwadratowych, w zakresie od 60,27 do 2 664,53 mikrometrów kwadratowych.Okrągłość odzwierciedla wystającą wartość ogniwa i waha się od 0,101 do 0,875. Niższe wartości wskazują wydłużony kształt, podczas gdy wartość jeden oznacza idealne koło. Większość komórek wykazywała wydłużony kształt, który najłatwiej dostrzec na wykresie skrzypcowym.Migrujące komórki grzebienia nerwowego w tej dziedzinie miały średni współczynnik proporcji około 2,13, a współczynnik proporcji jeden wskazuje na symetryczny kształt. Staranne wycinanie i posiewanie roślin ma kluczowe znaczenie dla udanych kultur. Pozwól, aby fałdy nerwowe osiadły ściętą stroną do dołu przez 10 do 15 minut, a następnie powoli przenieś do inkubatora, aby zwiększyć przyczepność.Wariacje tych technik obejmują przejściową manipulację genetyczną przed hodowlą i obrazowanie poklatkowe podczas inkubacji. Ponadto protokół ten pozwala na gromadzenie populacji premigrujących i migrujących komórek grzebienia nerwowego do analizy na poziomie omiki.

preparation-morphological-analysis-chick-cranial-neural-crest-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Do hodowli komórek macierzystych grzebienia neuronalnego (NCSC) in vitro wymagane jest specjalne medium (NCSCM). Niezbędnym składnikiem NCSCM jest ekstrakt z embrionu kurczaka (CEE). Opisujemy tutaj precyzyjne techniki pozwalające na uzyskanie maksymalnej ilości czystego i wysokiej jakości CEE, w tym szczegóły dotyczące procesów izolacji, maceracji, wirowania oraz filtracji.

Wytwarzanie ekstraktu z zarodka kurczaka do hodowli mysich komórek macierzystych grzebienia neuronalnego

Opisano metodę analizy migracji wyizolowanych komórek (komórek grzbietu neuronalnego tułowia). Metoda ta jest niedroga, łagodna i pozwala odróżnić chemotaksję zarówno od chemokinezy, jak i od innych czynników wpływających na polaryzację migracyjną, takich jak oddziaływania międzykomórkowe w pierwotnej kulturze komórek grzbietu neuronalnego tułowia.

Analiza migracji komórek grzbietowych neuralnych tułowia z wykorzystaniem zmodyfikowanego testu w komorze Zigmonda

Opisano podejście do analizy migracji i ostatecznego losu ptasich komórek grzebienia neuronalnego w embrionach chimerycznych przepiórnik-kurczak. Metoda ta stanowi prostą i przejrzystą technikę śledzenia komórek grzebienia neuronalnego podczas migracji i różnicowania, których w przeciwnym razie trudno byłoby odróżnić w niezmodyfikowanym embrionie kurczaka.

Analiza migracji i różnicowania grzebienia neuronalnego za pomocą transplantacji międzygatunkowej

Izolacja embrionalnej grzebieni neuralnej z rurki neuralnej umożliwia zastosowanie metod in vitro do badania migracji, samoodnawiania oraz multipotencji grzebieni neuralnej.

Izolacja i hodowla komórek grzebienia neuronalnego z zarodkowej rurki nerwowej myszy

Mezenchyma czaszki ulega gwałtownym ruchom morfogenetycznym, które prawdopodobnie stanowią siłę napędową dla uniesienia fałdów neuronalnych.1,2W niniejszym opracowaniu opisujemy prostą ex vivo test z eksplantem w celu charakterystyki zachowań komórkowych mezenchymy czaszki podczas neurulacji. Metoda ta znajduje liczne zastosowania, w tym możliwość wprowadzania manipulacji farmakologicznych oraz przeprowadzania analiz z wykorzystaniem obrazowania na żywo.

Test eksplantacyjny do oceny zachowania komórkowego mezenchymy czaszki

Ten film ilustruje technikę izolowania fałdów nerwowych czaszki od śródmózgowia zarodków piskląt. Przedstawiono szczegółowy proces rozwarstwiania fałdów nerwowych, ich rozmieszczenia i mocowania na szkiełkach nakrywkowych pokrytych fibronektyną, a następnie obserwację migracji komórek grzebienia nerwowego z fałdów nerwowych.

Izolowanie fałdów nerwowych czaszki od zarodka kurcząt w celu hodowli komórek grzebienia nerwowego

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić preparację premigracyjnego grzebienia nerwowego czaszki (NC) od Xenopus laevis neurulas. Te eksplantaty można posiewać na fibronektynie i hodować in vitro lub przeszczepiać z powrotem do zarodków gospodarza. Technika ta pozwala na badanie mechanizmów przejścia, migracji i różnicowania nabłonka NC do mezenchymy.

Rozwarstwienie grzebienia nerwowego Xenopus laevis do hodowli eksplantatów in vitro lub przeszczepu in vivo

Komórki grzebienia nerwowego (NC) pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) mają ogromny potencjał w modelowaniu rozwoju i chorób człowieka oraz w terapiach zastępczych komórek. W tym artykule przedstawiono bezżywieniową adaptację obecnie powszechnie stosowanego protokołu różnicowania in vitro do wyprowadzania komórek NC z hPSC.

Bezkarmowe wyprowadzanie komórek progenitorowych grzebienia nerwowego z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje sekcję i hodowlę komórek grzebienia nerwowego czaszki z modeli mysich, głównie do badania migracji komórek. Opisujemy stosowane techniki obrazowania na żywo oraz analizę zmian prędkości i kształtu komórek.

Sekcja, hodowla i analiza pierwotnych komórek grzebienia nerwowego czaszki od myszy w celu zbadania delaminacji i migracji komórek grzebienia nerwowego

Ten protokół przedstawia eksperyment migracji in vitro odpowiedni do analizy funkcjonalnej cząsteczek biorących udział w migracji in vivo komórek grzebienia nerwowego do bogatej w hialuronian macierzy zewnątrzkomórkowej.

In vitro Badanie wpływu bogatej w hialuronian macierzy zewnątrzkomórkowej na migrację komórek grzebienia nerwowego

Prezentujemy trójwymiarowy (3D) protokół różnicowania in vitro, generujący neurosfery o powtarzalnych rozmiarach do produkcji komórek grzebienia nerwowego czaszki z embrionalnych komórek macierzystych myszy. Pokazujemy, że ta metodologia zmniejsza zmienność w porównaniu z poprzednimi protokołami i jak można ją wykorzystać do testu multipleksowego do badania rozwoju komórek grzebienia nerwowego czaszki.

Komórki grzebienia nerwowego czaszki Trójwymiarowy protokół różnicowania in vitro do testu multipleksowego

Poznaj izolację komórek grzebienia nerwowego z piskląt w kulturze 2D. Ta metoda umożliwia wizualizację migracji i analizę morfologiczną bez rozdzielania komórek.

Przygotowanie i analiza morfologiczna kultur komórek grzebienia nerwowego czaszki piskląt

Przeglądaj więcej filmów