Analiza migracji komórek in vivo przy użyciu przeszczepów komórek i obrazowania poklatkowego w zarodkach danio pręgowanego

Ogólnym celem tej procedury jest analiza funkcji genu kandydującego w kontrolowaniu migracji komórek in vivo za pomocą przeszczepu komórek w połączeniu z obrazowaniem na żywo w zarodku danio pręgowanego. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych pytań w dziedzinie migracji komórek, takich jak określenie roli i znaczenia nowych genów kandydujących w migracji komórek in vivo. Główną zaletą tej techniki jest to, że tworzy ona mozaikowe zarodki, co umożliwia dobre obrazowanie i adenomiozę komórkową.

Aby przygotować igły do przeszczepu komórek, użyj ściągacza do mikropipet, aby wyciągnąć szklaną końcówkę. Następnie za pomocą mikrokuźni odetnij końcówkę igły w miejscu, w którym średnica wewnętrzna wynosi 35 mikrometrów. Za pomocą mikroszlifierki ukosuj odcięty koniec kapilary pod kątem 45 stopni.

Aby usunąć resztki szkła, włóż igłę do uchwytu igły zamontowanego na strzykawce, a następnie użyj 2% kwasu fluorowodorowego, aby trzykrotnie przepłukać wnętrze igły, wciągając i wyjmując roztwór. Następnie trzykrotnie przepłucz igłę acetonem. Aby przygotować potrawy do wstrzykiwań lub przeszczepu komórek, przygotuj 1% agarozy, podgrzewając 50 mililitrów pożywki zarodkowej zawierającej 0,5 grama agarozy w kuchence mikrofalowej przez jedną minutę z pełną mocą.

Schłodzić żel agarozowy do około 60 stopni Celsjusza i wlać całą objętość do 90 milimetrowej szalki Petriego. Włóż formę, aby utworzyć linie do wstrzykiwania lub stworzyć studzienki do przeszczepu komórek. Po ustawieniu żelu agarozowego użyj kleszczyków, aby usunąć pleśń.

Aby wstrzyknąć zarodki dawcy, pod mikroskopem stereoskopowym użyj kleszczy, aby delikatnie ścisnąć pobrane transgeniczne zarodki w linie naczynia iniekcyjnego wypełnionego pożywką zarodkową. Za pomocą kleszczy ustaw zarodki tak, aby komórki były skierowane ku górze, a następnie inkubuj naczynie w temperaturze 28 stopni Celsjusza, aż zarodki osiągną stadium czterech komórek. Następnie załadować igłę do wstrzykiwań dwoma mikrolitrami wcześniej przygotowanego roztworu do wstrzykiwań zawierającego domenę wiążącą aktynę białka 140 wiążącego aktynę drożdży związanego z mcherry.

Następnie włóż igłę do uchwytu igły przymocowanego do mikromanipulatora i podłączonego do transjektora powietrznego. Otwórz igłę za pomocą cienkich kleszczyków, aby delikatnie dotknąć końcówki igły lub ściskając jej koniec. Następnie włóż igłę do jednej z czterech komórek i wstrzyknij roztwór, aby wypełnić 70% objętości komórki.

W podobny sposób wstrzyknij 30 zarodków. Gdy zarodki osiągną stadium kuli, użyj plastikowej pipety pastwiskowej, aby przenieść transgeniczne zarodki GFP gospodarza i wcześniej wstrzyknięte zarodki dawcy na oddzielne 35-milimetrowe szalki Petriego, pokryte jedną milimetrową agarozą w pożywce zarodkowej i wypełnione pożywką dla zarodków Pen/Strep. Za pomocą cienkiej pęsety ręcznie wyekstrahuj zarodki z ich kosmówki.

Następnie umieść zarodki w inkubatorze w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Gdy zarodki osiągną stadium osłonki pod mikroskopem fluorescencyjnym, wybierz zarodki dawcy wykazujące ekspresję ABP140 mcherry w zielonej tarczy. Za pomocą wypolerowanej ogniowo pipety pastwiskowej przenieś zarodki gospodarza do rzędu studzienek w naczyniu do przeszczepu komórek wypełnionym Pen/Strep EM. Następnie umieść zarodki dawcy w sąsiednim rzędzie.

Następnie rzęsą ostrożnie ustaw zarodki tarczą do góry. Następnie za pomocą uchwytu na igłę dołączonego do strzykawki wypłucz końcówkę igły, wciągając i usuwając 70% etanolu. Osuszyć igłę, zasysając do niej powietrze.

Gdy igła wyschnie, włóż ją do uchwytu igły połączonego ze strzykawką Hamilton skosem skierowanym do góry. Aby wykonać przeszczep od tarczy do osłony, należy wprowadzić igłę do przeszczepu zarodka dawcy i pobrać około 10 do 20 komórek oznaczonych ABP140 mcherry. Ostrożnie unikaj rysowania żółtka.

Przeszczepić komórki do osłony zarodka gospodarza i powtarzać transfer komórek, aż wszystkie zarodki gospodarza zostaną przeszczepione. Po zakończeniu przeszczepu użyj wypolerowanej ogniowo pipety pastwiskowej, aby usunąć wszelkie uszkodzone zarodki. Inkubuj przeszczepione zarodki w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez około 30 minut, aby mogły dojść do siebie.

Aby przeszczepić pojedyncze komórki pregenitorowe płytki przedstrunowej po dekorionacji zarodków, jak wykazano wcześniej, użyj wypolerowanej ogniowo pipety pastwiskowej, aby przenieść trzy zarodki dawcy do naczynia do przeszczepu komórek wypełnionego pierścieniami wolnymi od wapnia Pen/Strep. Za pomocą cienkiej pęsety dla każdego zarodka wypreparuj eksplant zawierający wstrzyknięte komórki znakowane ABP140 mcherry i szybko wyrzuć resztę zarodków. Za pomocą rzęsy delikatnie wymieszaj eksplantaty, aż komórki się rozdzielą.

Następnie narysuj pojedynczą, wyizolowaną komórkę w igle do przeszczepu i przeszczep ją do tarczy zarodka gospodarza, jak pokazano wcześniej w filmie. Aby zapewnić optymalną kontrolę aspiracji i przeszczepu, należy zachować odstęp między powietrzem a wodą w odległości około 20 centymetrów od końca igły. Aby zamontować zarodki, napełnij fiolkę ze szklanym dnem jednym milimetrem gorącej 0,2% agarozy w EM. Umieścić fiolkę w temperaturze 42 stopni Celsjusza w bloku grzewczym.

Przenieść wybrany zarodek do roztworu agarozy i wyrzucić nadmiar pożywki zarodkowej z pipety. Następnie należy pobrać zarodek do pipety z agarozą i przenieść go do wcześniej przygotowanej komory obrazowania wraz z kroplą agarozy. Przed ustawieniem agarozy użyj rzęsy, aby zorientować zarodek, umieszczając perspektywiczną płytkę przedstrunową do góry w przypadku obrazowania za pomocą mikroskopu pionowego lub na szklanym dnie w przypadku obrazowania za pomocą mikroskopu odwróconego.

Będzie około 40 sekund na orientację zarodka, zanim żel agarozowy stwardnieje, w zależności od temperatury pokojowej. Szybko zorientuj zarodek, manipulując blastodermą, a nie żółtkiem, które jest bardzo delikatne. Po zamontowaniu wszystkich zarodków i ustawieniu agarozy, użyj Pen/Strep EM, aby wypełnić komorę, aby zapobiec wysuszeniu zarodków.

Przeprowadzaj obrazowanie żywych komórek i eksperymenty dynamiki komórek zgodnie z protokołem tekstowym. Technika zademonstrowana w tym filmie została wykorzystana do analizy roli Sin1, jednego z podstawowych składników drugiego kompleksu TOR w kontrolowaniu migracji komórek in vivo. Ten film pokazuje migrację przeszczepionych komórek pregenitorowych płytki przedstrunowej.

Znakowanie aktyny umożliwia wizualizację cytoplazmatycznych wypukłości bogatych w aktynę. Poprzez analizę częstości i orientacji zaobserwowano, że komórki typu dzikiego często wytwarzają duże wypukłości cytoplazmatyczne, zorientowane w kierunku bieguna zwierzęcego i migracji. Jak widać na tym rysunku, utrata funkcji Sin1 prowadzi do drastycznego zmniejszenia liczby wypukłości i randomizacji pozostałych wypukłości, co pokazuje znaczenie Sin1 w kontrolowaniu tworzenia wypukłości bogatych w aktynę.

Co ciekawe, fenotyp Sin1 może zostać uratowany przez ekspresję konstytutywnie aktywnej formy Rac1, co silnie sugeruje, że TOR C2 kontroluje dynamikę aktyny i tworzenie się wypukłości komórek poprzez Rac1. Technika ta została również wykorzystana do analizy roli arpiny, inhibitora kompleksu ARP2/3 w migracji komórek. Jak pokazano tutaj, utrata funkcji arpiny prowadzi do wzrostu częstotliwości występów, z powodu częstszego tworzenia się wypukłości lub wzrostu stabilności występu.

Pomiar żywotności występów przy braku arpiny wykazał, że czasowa trwałość występów podwoiła się, co wskazuje na wzrost stabilności. Po opanowaniu przeszczepu około 30 zarodków można wykonać w ciągu 45 minut. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby mieć oko na rozwój zarodków, ponieważ wszystkie kroki są krytycznie określone w czasie.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak mikroskopia konfokalna na żywo, aby zapewnić lepsze obrazowanie i odpowiedzieć na pytania dotyczące organizacji subkomórek elementów cytokotycznych, markerów polarności, białek addycyjnych lub innych składników komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać przeszczepów pregenitorów płytki przedstrunowej do analizy roli dowolnego genu kandydującego w migracji komórek in vivo.