Multipleksowa detekcja bakterii w złożonych próbkach klinicznych i środowiskowych przy użyciu mikrosfer fluorescencyjnych sprzężonych z oligonukleotydami

Cześć, nazywam się Tim Duso z Agriculture and AgriFood Canada. W tym filmie zademonstrujemy protokół określania obecności i liczebności określonych mikroorganizmów w złożonej próbce klinicznej lub środowiskowej za pomocą instrumentu bioplex. Protokół ten wykorzystuje fluorescencyjne kulki polistyrenowe, które są chemicznie sprzężone ze specyficzną dla gatunku sondą oligonukleotydową.

Amplikon jest generowany z próbki przy użyciu uniwersalnych starterów PCR, a amplikon jest hybrydyzowany z kulkami sprzężonymi z sondą. Za pomocą instrumentu bio plex generowane są dwa sygnały. Jeden identyfikuje koralik, a drugi określa ilościowo sygnał hybrydyzacji.

Ogólnym celem zabiegu jest określenie profilu mikrobioty będącej przedmiotem zainteresowania w sposób szybki i półilościowy. Zastosowaliśmy tę technikę do określenia profili bakteryjnych w wymazach z pochwy i wykorzystania wygenerowanych danych do zdiagnozowania bakteryjnego zapalenia pochwy, stanu klinicznego, który charakteryzuje się zmianą mikrobioty, w której organizmy lactobacillus stają się mniej rozpowszechnione, a inne organizmy, takie jak Gardnerella, vais i apoian vae, stają się wykrywalne w wymazach z pochwy. Należy jednak pamiętać, że technikę tę można zastosować do każdej innej mikrobioty, dla której pożądany jest szybki test multipleksowy.

Zacznijmy od opisania, jak działa procedura. Profil mikrobiologiczny jest generowany przez amplifikację białka i białka opiekuńczego genu powlekającego w 60 ze wszystkich organizmów obecnych w ekstrakcie DNA A z wymazu. Jeden z uniwersalnych starterów amplifikacyjnych jest modyfikowany przez dodanie biotyny, a także włączenie zasad modyfikowanych fosfowanianem.

Na pięciu głównych końcach amplikon jest wytwarzany jako jednoniciowy za pomocą nukleazy T siedem egzonów, która degraduje tylko nić antysensowną. Ponieważ nić sensowna jest chroniona przez starter PCR modyfikowany fosfowaniem, sondy oligonukleotydowe komplementarne do pozostałej nici są kowalencyjnie sprzężone z fluorescencyjnymi kulkami polistyrenowymi. Ponieważ każdy unikalny kolor kulki zawiera sondę wykrywającą inny organizm, do jednej próbki można użyć nawet stu różnych kulek.

Jednoniciowy produkt PCR z wymazu z pochwy jest hybrydyzowany z mieszaniną kulek sprzężoną z sondą, zawierającą sondy dla wszystkich organizmów będących przedmiotem zainteresowania. Dodaje się fluorescencyjną reporterową etynę FICO, która wiąże się z biotynylowanymi sondami poprzez koniugat strep din. Na koniec mieszanina hybrydyzacyjna jest analizowana na instrumencie luminex lub bio plex, który bada każdy koralik indywidualnie pod kątem tożsamości i sygnału hybrydyzacji.

Wyniki tej analizy wskazują na obecność określonych mikroorganizmów, a intensywność sygnału hybrydyzacji koreluje z liczebnością tego organizmu. W próbce obecność organizmów związanych z BV może być wykorzystana do diagnozowania BV. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak wielka plama, jest to, że generowane są informacje o obecności określonych mikroorganizmów i ich liczebności.

Procedurę zademonstruje Jennifer Town, asystentka naukowa w naszym laboratorium, Ponownie zawiesić mikrosfery poprzez wirowanie przez około 20 sekund. Przenieś 400 mikrolitrów mikrosfer do wirówki z probówką einor o temperaturze 14 000 razy G przez jedną minutę, wyjmij i wyrzuć snat Resus. Zawiesić mikrosfery w 50 mikrolitrach o 0,1 molowym MES pH 4,5.

Dodaj jeden animo oligo wychwytywania do mikrosfer i wymieszaj przez wirowanie. Dodaj 2,5 mikrolitra świeżego roztworu EDC do mikrosfer. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności.

Wyrzuć przygotowany wcześniej roztwór EDC i przygotuj świeżą próbkę 10 miligramów na mililitr EDC w wodzie. Jak powyżej, dodaj kolejne 2,5 mikrolitra świeżego roztworu EDC do mikrosfer i wiruj przez pięć sekund. Ponownie inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności.

Umyj kulki, dodając jeden mililitr 0,02% wiru Tween 20, aby ponownie zawiesić kulki odwirować przy 14 000 razy G. Przez jedną minutę usuń i wyrzuć supernatant. Ponownie umyj koraliki, dodając jeden mililitr 0,1% SDS Resus. Zawieś kulki w 100 mikrolitrach bufora.

Wylicz kulki w hemocytometrze Aby określić stężenie zapasów. Przygotować główną mieszankę mikrosfery, rozcieńczając każdą kulkę do końcowego stężenia 100 kulek na mikrolitr w puli buforowej, sprzężone kulki zgodnie z pożądanym pleksem testu Przechowywać główną mieszankę mikrosfery w temperaturze czterech stopni w ciemności. Mieszanina ta może być przechowywana przez miesiące, jeśli jest przechowywana w tych warunkach, generuje produkt PCR dla każdej próbki.

Dołącz zmodyfikowany fosfolianem i biotyną zestaw pięciu podstawowych starterów natychmiast po zakończeniu PCR. Dodaj dwa mikrolitry egzonukleazy T seven do każdej probówki PCR, inkubuj w temperaturze pokojowej przez 40 minut. Pod koniec tej inkubacji dodać 12,5 mikrolitra 0,5 molowego E-D-T-A-P-H 8,0 w mieszance.

Daje to w sumie około 64,5 mikrolitrów jednoniciowego produktu PCR. Mieszanka główna Resus Bend Microsphere z pipetą. Dozuj odpowiednią ilość do probówki einor.

Zakryj rurkę i sonikuj w łaźni wodnej sonica przez dwie minuty. Dozować 17 mikrolitrów jednoniciowego produktu PCR do odpowiednich studzienek o niskim profilu 96. Na płytce studzienkowej dodać 33 mikrolitry mieszaniny z zawieszonymi kulkami Sonikated do każdego.

Dobrze przykryj płytkę silikonową osłoną i dotknij. Delikatnie włóż płytkę do termocyklera z programem 95 stopni przez pięć minut, 60 stopni przez 10 minut, 60 stopni przytrzymaj lub zatrzymaj 60 stopni na pięć minut. Zakończ, uruchom program.

Zrób świeży roztwór etylu paciorkowca Aden FICO. Będziesz potrzebował 25 mikrolitrów na studzienkę. Zrób paciorkowca i etynę FICO, rozcieńczając łodygę w ilości jednego miligrama na mililitr.

Jeden na 50 do 20 mikrogramów na mililitr z jednorazowym buforem tmac. Gdy termocykler dojdzie do kroku utrzymywania o 60 stopni, otwórz pokrywę, zdejmij silikonową osłonę i dodaj roztwór etyny strep din FICO bezpośrednio do każdego. Cóż, załóż silikonową osłonę, zamknij pokrywę termocyklera i wznów program.

Po zakończeniu programu wyjmij płytkę i szybko przenieś ją do maszyny bio plex w celu odczytania. Tabliczkę należy odczytać w ciągu 10 minut. Odczytaj tabliczkę pod kątem 60 stopni.

Upewnij się, że bio plex został wstępnie rozgrzany do tej temperatury. Pokazuje to wyniki odpowiednich barwień metodą Grama i profili lumineksowych próbek podłużnych pobranych od pojedynczego osobnika w czasie zero. Barwienie metodą Grama jest zgodne z kliniczną diagnozą bv, co potwierdza test Fiveplex Luminex, który wykazuje pozytywne sygnały hybrydyzacji dla organizmów związanych z BV, w tym reliktu Gardnera, vais i Apoian Vae.

Lactobacillus Iners jest również wykrywany w niskich stężeniach w miarę upływu czasu. Osoba ta przechodzi od mikrobioty BV do normalnej mikrobioty, o czym świadczą barwienia metodą Grama. Analiza Luminex tych samych próbek pokazuje, że liczebność Gardnerella Vaginalis osiąga szczyt i słabnie, podczas gdy Lactobacillus iners wzrasta, aby stać się organizmem dominującym w końcowym punkcie czasowym.

Za pomocą tej metody do profilowania mikrobioty generowane są informacje na temat obecności określonych organizmów, a także ich liczebności. Ponieważ metoda jest oparta na sekwencji, konstrukcja sondy może być oparta na głębokiej analizie sekwencjonowania, a mikroorganizmy identyfikowane za pomocą metod sekwencjonowania nowej generacji mogą być śledzone w próbkach w szybki i stosunkowo tani sposób. Obejrzenie tego filmu powinno dać ci dobre zrozumienie, jak wygenerować profil mikrobiologiczny z próbki za pomocą instrumentu Luminex lub Bio Plex.

Pokazaliśmy, jak połączyć sondy oligonukleotydowe z kulkami fluorescencyjnymi, wygenerować jednoniciowy alikon z próbki klinicznej lub środowiskowej, przeprowadzić hybrydyzację i określić wyniki na instrumencie Luminex lub Bio Plex. Powodzenia w eksperymentach.