Multipleksowa ilościowa detekcja bakterii przy użyciu mikrosfer magnetycznych znakowanych barwnikiem

Weź płytkę testową zawierającą mieszaninę magnetycznych mikrosfer polistyrenowych barwionych wewnętrznie różnymi spektralnie fluoroforami.

Każdy zestaw mikrosfer jest kowalencyjnie sprzężony z odrębnymi przeciwciałami wychwytującymi specyficznymi dla bakterii chorobotwórczych.

Dodaj zabitą termicznie mieszaninę bakterii chorobotwórczych. Inkubować.

Wychwytywane przeciwciała wiążą docelowe antygeny bakteryjne, tworząc kompleksy mikrosfera-bakterie.

Użyj separatora magnetycznego do osadzania kompleksów. Wyrzuć niezwiązane bakterie i umyj buforem.

Dodaj buforowe i biotynylowane przeciwciała detekcyjne, które wiążą się specyficznie z bakteriami związanymi z mikrosferą.

Magnetycznie oddzielić kompleksy i przemyć buforem.

Ponownie zawieś kompleksy w buforze. Cząsteczki reporterowe pipety zawierające streptawidynę sprzężoną z fluoroforem, które wiążą się z biotynylowanymi przeciwciałami wykrywającymi.

Magnetycznie oddziel i umyj kompleksy. Zawieś ponownie w buforze.

Podczas analizy przepływowej pierwszy laser wzbudza wewnętrzne fluorofory mikrosfery, generując unikalne sygnatury spektralne i identyfikując unikalne zestawy mikrosfer.

Drugi laser wzbudza reportery fluoroforowe związane z bakteriami na mikrosferach, określając ilościowo bakterie w różnych zestawach mikrosfer, umożliwiając multipleksowane ilościowe wykrywanie bakterii.

W celu pobrania próbki zacznij od dodania pięćdziesięciu mikrolitrów mikrosfer lub kulek sprzężonych w celu wychwycenia przeciwciał do 96-dołkowej płytki. Następnie dodaj pięćdziesiąt mikrolitrów bakterii chorobotwórczych, a następnie pięćdziesiąt mikrolitrów PBS-TBN do studzienek tła.

Przykryć płytkę foliowym uszczelnieniem płytkowym i inkubować na wytrząsarce płytek z prędkością ośmiuset obrotów na minutę przez godzinę.

Następnie umieść płytkę na separatorze magnetycznym na 1 minutę, aby oddzielić koraliki. Usuń pozostały roztwór, trzymając płytkę na magnetycznym separatorze płytowym. Następnie postukaj, aby wysuszyć laboratoryjne ręczniki papierowe trzy do czterech razy. Dokładnie umyj studzienki dwukrotnie PBS-TBN.

W celu wykrycia próbki dodaj do studzienek pięćdziesiąt mikrolitrów buforu testowego, a następnie pięćdziesiąt mikrolitrów biotynylowanego przeciwciała detekcyjnego o stężeniu czterech mikrogramów na mililitr.

Inkubuj płytkę w ciemności przez godzinę, aby umożliwić skuteczną interakcję między bakteriami a przeciwciałami wykrywającymi. Następnie oddziel kulki za pomocą separatora magnetycznego i umyj je PBS-TBN, jak pokazano wcześniej.

Ponownie zawiesić kulki w pięćdziesięciu mikrolitrach buforu testowego i dodać pięćdziesiąt mikrolitrów streptawidyny-R-fikoerytryny lub SAPE, fluorescencyjnej cząsteczki reporterowej. Przykryć płytkę foliowym uszczelnieniem płytkowym i inkubować na wytrząsarce przez 30 minut.

Po umyciu studzienek ponownie zawieś kulki w 100 mikrolitrach PBS-TBN i załaduj płytkę do analizatora przepływowego.

Zapisuj odczyty za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Mediana intensywności fluorescencji netto dla każdego organizmu może być oceniana za pomocą krzywej standardowej w celu określenia obciążenia bakteryjnego obecnego w próbce.