Name: Multipleksowana mikromacierz fluorescencyjna do analizy ludzkich białek śliny przy użyciu mikrosfer polimerowych i wiązek światłowodowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Poznaj metodę multipleksowej analizy białek śliny z wykorzystaniem fluorescencyjnych mikrosfer polimerowych i wiązek światłowodowych. Technika ta umożliwia jednoczesne wykrywanie wielu białek w próbkach biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (grant 08UDE017788-05). E.B.P. dziękuje również za wsparcie ze strony Hiszpańskiej Fundacji na rzecz Nauki i Technologii (FECYT). Autorzy dziękują Shondzie T. Gaylord i Pratyushy Mogalisetti za krytyczną lekturę rękopisu.

<img alt="Schemat kodowania mikrosfer, sprzęgania przeciwciał i znakowania fluoroforem w procesie biosensora." fo:content-width="5in" width="500" src="/files/ftp_upload/50726/50726fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat zastosowania światłowodowej macierzy mikrosfer z przeciwciałami do profilowania śliny.
 (1) Mikrosfery są kodowane wewnętrznie za pomocą dwóch barwników fluorescencyjnych; (2) zakodowane mikrosfery są modyfikowane zewnętrznie specyficznymi dla białek przeciwciałami monoklonalnymi; (3) zmiksowane mikrosfery w układzie multipleksowym są (4) rozmieszczane losowo w mikrowypustkach wytrawionych na końcu proksymalnym wiązki światłowodowej; (5) białka śliny są wychwytywane przez mikrosfery w za pomocą kanapkowego testu immunoenzymatycznego i (6) ilościowo oznaczane z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.
1. Kodowanie mikrosfer
<ol>
	<li>Odważ trihydrat tenoiltrifluoroacetonianu sodu i europu (III) (Eu-TTA, MW = 869,54 g/mol) do bursztynowej fiolki szklanej i przygotuj roztwór zapasowy o stężeniu 200 mM w tetrahydrofuranie (THF). Wymieszaj delikatnie za pomocą pipetowania; sprawdź wizualnie, czy barwnik jest całkowicie rozpuszczony.</li>
	<li>Odważ kumarynę 30 (C30, MW = 347,41 g/mol) do bursztynowej fiolki szklanej i przygotuj roztwór zapasowy o stężeniu 12 mM w THF. Wymieszaj delikatnie za pomocą pipetowania; sprawdź wizualnie, czy barwnik jest całkowicie rozpuszczony.</li>
	<li>Przygotuj 700 μl roztworu roboczego dla każdego typu mikrosfer, wykorzystując roztwory zapasowe oraz THF, aby uzyskać stężenie końcowe wymienione w Tabeli 1.</li>
	<li>Upewnij się, że mikrosfery (10% w/v) są dobrze zawieszone poprzez wstrząśnięcie w wortexie, a następnie przenieś 60 μl zawiesiny do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodaj 600 μl PBS do zawiesiny mikrosfer i wymieszaj, pipetując 20 razy. Wirowarkuj probówkę z prędkością 10 000 rpm przez 3 min i ostrożnie usuń nadsącz. Powtórz ten proces jeszcze 2 razy, aby wyprać mikrosfery.</li>
	<li>Przepłucz osad mikrosfer 3 razy THF, stosując procedurę analogiczną do kroku 1.5.</li>
	<li>Wirowarkuj zawiesinę mikrosfer w THF z prędkością 10 000 rpm przez 3 min, usuń nadsącz i ponownie zawieś osad w 600 μl roztworu roboczego wymienionego w Tabeli 1. Przenieś mieszaninę do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Uszczelnij probówkę do mikrowirówki Parafilmem i umieść ją na wytrząsarce. Wstrząsaj z prędkością 3 000 rpm i inkubuj przez 24 hr, chroniąc przed światłem poprzez przykrycie zestawu pudełkiem owiniętym folią aluminiową.</li>
	<li>Wirowarkuj zawiesinę mikrosfer z prędkością 10 000 rpm przez 3 min, aby utworzyć osad.</li>
	<li>Usuń nadsącz z roztworem barwnika, przemyj mikrosfery 6 razy 600 μl metanolu, a następnie kolejne 6 razy 600 μl PBS zawierającego 0,01% Tween-20, zgodnie z opisem w kroku 1.5.</li>
	<li>Przechowuj zakodowane mikrosfery w 600 μl PBS zawierającego 0,01% Tween-20 w temperaturze 4 °C do momentu użycia, chroniąc przed światłem.</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nazwa typu mikrosfer:</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eu-TTA (mM)</td>
			<td>100</td>
			<td>100</td>
			<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>10</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C30 (mM)</td>
			<td> </td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
			<td>1</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Stężenia roztworów roboczych Eu-TTA i C30.
2. Przygotowanie mikrosfer do wychwytywania białek
<ol>
	<li>Przygotować wcześniej w temperaturze pokojowej bufor MES [kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy (MES) 0.1 M, NaCl 0.9%, SDS 0.01%, pH 5.7] oraz bufor PBS/SDS (fosforan sodu 0.01 M, NaCl 0.154 M, SDS 0.01%, pH 7.4).</li>
	<li>Dodać 200 μl zawiesiny zakodowanych mikrosfer (zawierającej ~2 mg mikrosfer) do probówki do mikrowirówki Safe-Lock 1.5 ml. Ważne jest użycie tego typu probówek, aby uniknąć wycieku podczas inkubacji w kroku 2.6.</li>
	<li>Przemyć mikrosfery 600 μl buforu MES 3x zgodnie z opisem w kroku 1.5. Dodać 700 μl MES do osadu mikrosfer i dobrze wymieszać za pomocą pipety.</li>
	<li>Przygotować w osobnych probówkach roztwory chlorku 1-etylo-3-[3-dimetyloaminopropyl]karbodiimidu (EDC, MW = 191.7 g/mol) o stężeniu 0.105 g/ml oraz sulfo-N-hydroksysulfosukcynimidu (sulfo-NHS, MW = 217.13 g/mol) o stężeniu 0.163 g/ml w buforze MES.</li>
	<li>Dodać 150 μl świeżo przygotowanego roztworu EDC kropla po kropli do zawiesiny mikrosfer. EDC hydrolizuje bardzo szybko, dlatego w celu zapewnienia wydajności immobilizacji niezbędne jest użycie świeżo przygotowanego roztworu. Natychmiast po dodaniu EDC dodać do mikrosfer 150 μl roztworu sulfo-NHS, dobrze wymieszać za pomocą pipety i sprawdzić, czy zawiesina jest jednorodna.</li>
	<li>Zakręcić probówkę, zabezpieczyć ją Parafilmem i umieścić na wytrząsarce. Mieszać przy 1,500 rpm przez 4 hr, chroniąc przed światłem za pomocą pudełka pokrytego folią aluminiową.</li>
	<li>Wirować zawiesinę mikrosfer przy 10,000 rpm przez 3 min do uzyskania osadu i usunąć nadsącz. Przemyć mikrosfery 500 μl buforu PBS/SDS 3x zgodnie z opisem w kroku 1.5.</li>
	<li>Dodać 200 μl buforu PBS/SDS do osadu, dobrze wymieszać mikrosfery i przenieść roztwór do 300 μl buforu PBS/SDS zawierającego 60 μg przeciwciał wychwytujących. Ważne jest, aby najpierw zawiesić osad mikrosfer, a następnie dodać zawiesinę mikrosfer do roztworu przeciwciał.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę przeciwciał i mikrosfer na wytrząsarce przy 1,500 rpm przez 4 hr, chroniąc przed światłem za pomocą pudełka pokrytego folią aluminiową.</li>
	<li>Wirować zawiesinę mikrosfer przy 10,000 rpm przez 3 min do uzyskania osadu i usunąć nadsącz. Przemyć mikrosfery 500 μl buforu blokującego StartingBlock (TBS) 3x, zgodnie z opisem w kroku 1.5.</li>
	<li>Wymieszać mikrosfery z 1 ml buforu blokującego TBS i inkubować mikrosfery na wytrząsarce przy 1,500 rpm przez 1 hr, chroniąc przed światłem za pomocą pudełka pokrytego folią aluminiową.</li>
	<li>Wirować zawiesinę mikrosfer przy 7,000 rpm przez 3 min do uzyskania osadu i usunąć nadsącz. Przemyć osad 3x 500 μl buforu blokującego TBS, zgodnie z opisem w kroku 1.5.</li>
	<li>Wirować roztwór mikrosfer przy 7,000 rpm przez 3 min do uzyskania osadu i usunąć nadsącz. Dodać 500 μl buforu blokującego TBS i wymieszać za pomocą pipety.</li>
	<li>Przechowywać zmodyfikowaną zawiesinę mikrosfer w temperaturze 4 °C do momentu użycia, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Powtórzyć tę procedurę w celu przygotowania innych rodzajów mikrosfer przy użyciu odpowiednich przeciwciał.</li>
</ol>
3. Montaż światłowodowej mikromacierzy
<ol>
	<li>Wymieszać 50 μl każdego rodzaju mikrosfer do wychwytywania białek w nowej, autoklawowanej probówce do mikrowirówki. Odwirować pulę mikrosfer zapasowych przy 7,000 rpm przez 3 min i usunąć nadsącz, tak aby pozostała objętość wynosiła około 100 μl.</li>
	<li>Ręcznie przyciąć wiązki światłowodowe do długości około 5 cm i kolejno wypolerować oba końce na polerkarce, używając diamentowych folii polerskich o rozmiarach 30, 15, 9, 6, 3, 1, 0.5 oraz 0.05 μm. Poddać wypolerowaną wiązkę działaniu ultradźwięków w wodzie dejonizowanej przez 2 min w celu usunięcia wszelkich cząstek.</li>
	<li>Włożyć mały magnetyczny mieszadło do probówki do mikrowirówki o pojemności 0.5 ml, dodać 400 μl buforu PBS wolnego od białek i mieszać na magnetycznej płytce grzejno-mieszalnej przez 30 min w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Trawić jeden koniec wypolerowanej wiązki światłowodowej w 0.025 N roztworze HCl przez 150 sek10,16. Natychmiast zanurzyć i poddać działaniu ultradźwięków trawiony koniec w wodzie dejonizowanej przez 1 min. Osuszyć wiązki światłowodowe sprężonym powietrzem.</li>
	<li>Zamocować wiązkę światłowodową w uchwycie do światłowodów i zablokować trawiony koniec w buforze PBS wolnym od białek i pęcherzyków powietrza na 1 hr.</li>
	<li>Nanieść 1 μl alikwotu przechowywanej zawiesiny mikrosfer na trawiony koniec wiązki światłowodowej. Zabezpieczyć układ przed światłem pudełkiem z folii aluminiowej i odczekać 15 min. Objętość zawiesiny zmniejszy się wskutek odparowania, co wtłoczy mikrosfery do wytrawionych mikrownęk. Powtórzyć ten etap ładowania jeszcze raz.</li>
	<li>Użyć tamponu nasączonego roztworem próbki, aby usunąć mikrosfery, które nie zostały uwięzione w mikrownękach. Mikromacierze białkowa jest teraz gotowa do użycia. Przejść niezwłocznie do kroku 4.1 w celu analizy śliny.</li>
</ol>
4. Analiza próbek śliny z wykorzystaniem mikromacierzy mikrosfer
<ol>
	<li>Do autoklawowanej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 ml dodać 200 μl roztworu próbki (100 μl supernatantu śliny rozcieńczonego równą objętością buforu blokującego StartingBlock T20 (PBS). Protokół pobierania supernatantu śliny został opublikowany wcześniej10). Zanurzyć mikroarray białkowy naniesiony na włókno w roztworze i inkubować na wytrząsarce przy 600 rpm przez 2 h, chroniąc przed światłem za pomocą pudełka pokrytego folią aluminiową.</li>
	<li>Przygotować 20 ml buforu piorącego, dodając 200 μl 10% roztworu BSA oraz 200 μl 10% Tween-20 do 19,6 ml PBS, a następnie dokładnie wymieszać poprzez delikatne wstrząsanie.</li>
	<li>Zanurzyć mikroarray białkowy w nowej autoklawowanej probówce do mikrocentryfugi zawierającej 200 μl buforu piorącego i wstrząsać przy 600 rpm przez 2 min. Powtórzyć to przemywanie 3x.</li>
	<li>Inkubować mikroarray w 100 μl roztworze koktajlu przeciwciał detekcyjnych zawierającego 5 μg/ml biotynilowanych przeciwciał detekcyjnych przeciwko anti-VEGF, IP-10, IL-8, EGF, MMP-9 i IL-1β w buforze blokującym StartingBlock T20 (PBS) przez 30 min w temperaturze pokojowej na wytrząsarce przy 600 rpm, chroniąc przed światłem za pomocą pudełka pokrytego folią aluminiową.</li>
	<li>Przemyć mikroarray 3x buforem piorącym, zgodnie z opisem w kroku 4.3.</li>
	<li>Inkubować mikroarray w 200 μl roztworu koniugatu streptawidyny z R-fykoerytryną (SAPE) o stężeniu 20 μg/ml w PBS przy 600 rpm na wytrząsarce przez 10 min, chroniąc przed światłem za pomocą pudełka pokrytego folią aluminiową.</li>
	<li>Przemyć mikroarray 5x buforem piorącym, zgodnie z opisem w kroku 4.3.</li>
	<li>Oczyścić dystalny koniec wiązki włókna (t.j. koniec oddalony od mikrosfer) za pomocą tamponu nasączonego etanolem absolutnym.</li>
	<li>Osuszyć oba końce włókna sprężonym powietrzem. Zamocować włókno w mikroskopie epifluorescencyjnym i obrazować przez dystalny koniec włókna.</li>
	<li>Pozyskać obrazy mikrosfer odpowiadające intensywnościom emisji fluorescencji Eu-TTA, C30 oraz SAPE. Konfiguracja filtrów optycznych i czasy ekspozycji dla obrazowania fluorescencyjnego Eu-TTA, C30 oraz SAPE przedstawione są w Tabeli 2.</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kanał</td>
			<td>Eu-TTA</td>
			<td>C30</td>
			<td>SAPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wzbudnik</td>
			<td>365/10x</td>
			<td>350/50x</td>
			<td>546/10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dzielnik wiązki</td>
			<td>525DCLP</td>
			<td>400DCLP</td>
			<td>560LP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emiter</td>
			<td>620/60m</td>
			<td>460/50m</td>
			<td>580/30m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czas ekspozycji</td>
			<td>1 s</td>
			<td>0,3 s</td>
			<td>1 s</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Parametry dla trzech obrazów fluorescencyjnych mikromacierzy.

<ol><li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+monitoring+of+gene-expression+patterns+with+a+complementary-DNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray.</a> Science. 270, 467-470 (1995).</li>
<li>Schena, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchena%2C+M+%22Protein+Microarray%22">Protein Microarray</a>. , Jones and Bartlett Publishers. (2004).</li>
<li>Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+analysis+of+eight+human+Th1%2FTh2+cytokines+using+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays.</a> J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).</li>
<li>Wang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array-based+multiplexed+screening+and+quantitation+of+human+cytokines+and+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines.</a> J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).</li>
<li>de Jager, W., Velthuis, te, Prakken, H., Kuis, B. J., W,, Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+15+human+cytokines+in+a+single+sample+of+stimulated+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).</li>
<li>Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance+imaging+measurements+of+antibody+arrays+for+the+multiplexed+detection+of+low+molecular+weight+protein+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers.</a> Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).</li>
<li>Vignali, D. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+particle-based+flow+cytometric+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed particle-based flow cytometric assays.</a> J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).</li>
<li>Rissin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assay+detects+serum+proteins+at+subfemtomolar+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations.</a> Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).</li>
<li>Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oil-sealed+femtoliter+fiber-optic+arrays+for+single+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis.</a> Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).</li>
<li>Blicharz, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber-Optic+Microsphere-Based+Antibody+Array+for+the+Analysis+of+Inflammatory+Cytokines+in+Saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva.</a> Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).</li>
<li>Mukhopadhyay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Devices+to+drool+for%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Devices to drool for.</a> Anal. Chem. 78, 4255-4259 (2006).</li>
<li>Wong, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+diagnostics+powered+by+nanotechnologies%2C+proteomics+and+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Dent.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics.</a> J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).</li>
<li>Segal, A., Wong, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+diagnostics%3A+enhancing+disease+detection+and+making+medicine+better%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Dent.+Educ%22%5BJournal%5D)">Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better.</a> Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).</li>
<li>St John, M. A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+6+and+interleukin+8+as+potential+biomarkers+for+oral+cavity+and+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Otolaryngol.+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma.</a> Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).</li>
<li>Herr, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+immunoassays+as+rapid+saliva-based+clinical+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).</li>
<li>Pantano, P., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+nanowell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Mater%22%5BJournal%5D)">Ordered nanowell arrays.</a> Chem. Mater. 8, 2832-2835 (1996).</li>
<li>Schena, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchena%2C+M+%22Protein+Microarrays%22">Protein Microarrays</a>. , Jones and Bartlett Publishers. (2005).</li>
<li>Mouse IgG1 Isotype Control [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.rndsystems.com/Products/MAB002">http://www.rndsystems.com/Products/MAB002</a> (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Badacze powinni zwrócić szczególną uwagę na następujące kroki: Aby uzyskać lepszą dokładność dekodowania, konieczne jest sprawdzenie, czy mikrosfery były jednorodnie zawieszone na wszystkich etapach inkubacji i płukania podczas procedury kodowania mikrosfer. Ponadto zakodowane mikrosfery muszą być chronione przed światłem przez cały czas trwania eksperymentu. Po zastosowaniu odpowiednich procedur kodowania i przechowywania stwierdziliśmy, że ogólna dokładność dekodowania wynosiła ponad 99%. Zakodowane mikrosfery należy p...

Od czasu pierwszej mikromacierzy zgłoszonej przez Marka Schenę i współpracowników w połowie lat 90., to potężne narzędzie jest wykorzystywane w wielu dziedzinach badań biologicznych1. Mikromacierze przeciwciał zdolne do jednoczesnego wykrywania wielu białek w płynach diagnostycznych, takich jak krew, mają ważne zastosowanie w diagnostyce klinicznej i badaniach przesiewowych biomarkerów2-10. Ślina, zawierająca wiele takich samych analitów jak krew, została uznana za preferowaną alternatywę dla krwi, ponieważ pobieranie śliny jest bezpieczne, nieinwazyjne i może być przeprowadzane przez minimalnie przeszkolony personel medyczny11-13. Obecnie multipleksowana analiza białek przy użyciu próbek śliny jest ograniczona przez kilka ważnych czynników, w tym niskie stężenie docelowego analitu14 i szeroki zakres stężeń różnych biomarkerów15.
Tutaj demonstrujemy analizę sześciu białek: ludzkiego czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), białka 10 indukowanego interferonem gamma (IP-10), interleukiny-8 (IL-8), naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), metallopeptydazy macierzy 9 (MMP-9) i interleukiny-1 beta (IL-1β). Skuteczność metody została wstępnie zweryfikowana przy użyciu roztworów wzorcowych stanowiących rekombinowane białka analitowe i bufor blokujący. Rzeczywiste próbki śliny pobrane od pacjentów z różnymi przewlekłymi chorobami układu oddechowego, a także od zdrowych osób z grupy kontrolnej zostały również przetestowane z zadowalającą wydajnością. Protokół powinien mieć zastosowanie do innych analitów białkowych i innych testów opartych na mikrosferach. Platforma ta oferuje znaczne korzyści w dziedzinie chemii analitycznej, ponieważ umożliwia szybką, dokładną i powtarzalną jednoczesną analizę niskich stężeń kilku białek o szerokim zakresie dynamiki, minimalnych interakcjach niespecyficznych, zmniejszonym zużyciu próbki i niskich kosztach w porównaniu z analogicznym testem immunoenzymatycznym (ELISA).

<table><tbody><tr><td>Barwnik Eu-TTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC42319-0010</td><td></td></tr><tr><td>THF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34865-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka ze szkła bursztynowego</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-339-23B</td><td></td></tr><tr><td>Kumaryna 30 barwnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>546127-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosfery</td><td>Bangslabs</td><td>PC05N/6698</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówki do mikrowirówek</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x koncentrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493-1L</td><td></td></tr><tr><td>Woda</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tw-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>BupH MES buforowana sól fizjologiczna</td><td>Thermo Scientific</td><td>28390</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05030-500ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS256-500</td><td></td></tr><tr><td>Probówka mikrowirówkowa z bezpiecznym zamkiem</td><td>VWR labshop</td><td>53511-997</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie przeciwciało wychwytujące VEGF</td><td>R& D Systems</td><td>MAB293</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie przeciwciało wychwytujące IP-10</td><td>R& D Systems</td><td>MAB266</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie przeciwciało wychwytujące IL-8</td><td>R& D Systems</td><td>MAB208</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie przeciwciało wychwytujące EGF</td><td>R& D Systems</td><td>MAB636</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie przeciwciało wychwytujące MMP-9</td><td>R& D Systems</td><td>MAB936</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka IL-1 i beta wychwytywanie przeciwciał</td><td>R& D Systems</td><td>MAB601</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IgG1 przeciwciało kontrolujące izotyp</td><td>R& D Systems</td><td>MAB002</td><td></td></tr><tr><td>Bufor StartingBlock (TBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>37542</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wzorcowy HCl 1,0 N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318949-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml probówki mikrowirówkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>Bufor bez białka (PBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>37572</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki VEGF 165</td><td>R& D Systems</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki IP-10</td><td>R& D Systems</td><td>266-IP</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka IL-8</td><td>R& D Systems</td><td>208-IL</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki EGF</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki MMP-9</td><td>R& D Systems</td><td>911-MP</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka IL-1&beta;</td><td>R& D Systems</td><td>201-LB</td><td></td></tr><tr><td>Bufor StartingBlock T20 (PBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>37539</td><td></td></tr><tr><td>Bloker BSA w PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>37525</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowane przeciwciało wykrywające VEGF</td><td>R& D Systems</td><td>BAF293</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowane przeciwciało wykrywające IP-10</td><td>R& D Systems</td><td>BAF266</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowane przeciwciało wykrywające IL-8</td><td>R& D Systems</td><td>BAF208</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowane przeciwciało wykrywające EGF</td><td>R& D Systems</td><td>BAF236</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowane przeciwciało wykrywające MMP-9</td><td>R& D Systems</td><td>BAF911</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowane przeciwciało detekcyjne IL-1 i beta</td><td>R& D Systems</td><td>BAF201</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna, R-fikoerytryna</td><td>Invitrogen</td><td>S-21388</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (200 dowodów)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr></tbody></table>

multipleksowana mikromacierz fluorescencyjna do analizy ludzkich białek śliny przy użyciu mikrosfer polimerowych i wiązek światłowodowych

Multiplexed Fluorescent Microarray for Human Salivary Protein Analysis Using Polymer Microspheres and Fiber-optic Bundles

Tutaj opisujemy protokół jednoczesnego pomiaru sześciu białek w ślinie za pomocą światłowodowego układu przeciwciał opartych na mikrosferach. Zastosowana technologia immuno-array łączy w sobie zalety wytwarzania matryc zawiesinowych na bazie mikrosfery z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej. Jak opisano w protokole wideo, dostępne na rynku mikrosfery polimerowe o wielkości 4,5 μm zostały zakodowane w siedmiu różnych typach, różniących się stężeniem dwóch barwników fluorescencyjnych fizycznie uwięzionych wewnątrz mikrosfer. Zakodowane mikrosfery zawierające powierzchniowe grupy karboksylowe zmodyfikowano przeciwciałami wychwytującymi monoklonalne za pomocą chemii sprzężenia EDC/NHS. Aby złożyć mikromacierz białkową, różne typy kodowanych i funkcjonalizowanych mikrosfer zmieszano i losowo zdeponowano w mikrodołkach o wielkości 4,5 μm, które zostały chemicznie wytrawione na bliższym końcu wiązki światłowodowej. Wiązka światłowodowa została wykorzystana zarówno jako nośnik, jak i do obrazowania mikrosfer. Po złożeniu mikromacierz została wykorzystana do wychwycenia białek w supernatance śliny pobranej z kliniki. Wykrycie oparto na teście immunologicznym typu sandwich z użyciem mieszaniny biotynylowanych przeciwciał detekcyjnych dla różnych analitów z sondą fluorescencyjną sprzężoną ze streptawidyną, R-fikoerytryną. Mikromacierz została zobrazowana za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w trzech różnych kanałach, dwóch do rejestracji mikrosfery i jednego do sygnału testowego. Mikrofotografie fluorescencyjne zostały następnie zdekodowane i przeanalizowane przy użyciu domowego algorytmu w MATLAB.

Obrazy fluorescencyjne z trzech kanałów przedstawiające niewielki odcinek wiązki światłowodowej pokazano na Rysunkach 2A-C. Obrazy te zostały przeanalizowane przy użyciu algorytmu napisanego w programie MATLAB (opisanego bardziej szczegółowo w sekcji Dyskusja). Analiza wykorzystuje informacje zarówno z obrazu kodującego Eu-TTA (Rysunek 2A), jak i z obrazu kodującego C30 (Rysunek 2B) w celu dekodowania mikrosfer, a następnie obliczono intensywności fluorescencji poszczegó...

Opisujemy procedurę profilowania białek śliny za pomocą multipleksowanych układów przeciwciał opartych na mikrosferach. Przeciwciała monoklonalne zostały kowalencyjnie połączone z mikrosferami polimerowymi o wielkości 4,5 μm kodowanymi barwnikiem fluorescencyjnym przy użyciu chemii karmodiimidu. Zmodyfikowane mikrosfery zdeponowano w mikrostudzienkach światłowodowych w celu zmierzenia poziomu białka w ślinie za pomocą fluorescencyjnych testów immunologicznych typu sandwich.

Multipleksowana mikromacierz fluorescencyjna do analizy ludzkich białek śliny przy użyciu mikrosfer polimerowych i wiązek światłowodowych

Herein, we describe a protocol for simultaneously measuring six proteins in saliva using a fiber-optic microsphere-based antibody array. The immuno-array ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest analiza wielu białek w próbkach ludzkiej śliny z wykorzystaniem fluorescencyjnych macierzy opartych na mikrosferach. W pierwszej kolejności należy zakodować mikrosfery za pomocą różnych ilości dwóch barwników fluorescencyjnych. Następnie należy sprzęgać przeciwciała wychwytujące dla różnych białek z zakodowanymi mikrosferami.Następnie należy złożyć multipleksową macierz białkową na wiązce światłowodowej, wykorzystując kanapkowe analizy immunologiczne w celu oznaczenia wielu białek w badanych próbkach śliny. Ostatecznie, analiza za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pozwala na pomiar odpowiedzi sygnałowej różnych białek w próbkach śliny. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ELISA, jest możliwość jednoczesnej analizy wielu białek w złożonych płynach biologicznych.Choć metoda ta może dostarczyć cennych informacji w analizie ludzkiej śliny, można ją również zastosować do innych płynów biologicznych, takich jak surowica, mocz i plwocina. Odważ opium TTA do bursztynowej szklanej fiolki i przygotuj 200 mM roztwór zapasowy w tetrahydrofuranie. Wymieszaj delikatnie poprzez pipetowanie i sprawdź wizualnie, czy ba

multiplexed-fluorescent-microarray-for-human-salivary-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Przetłumacz z en na pl. Zachowaj wszystkie tagi HTML i formatowanie dokładnie. Wypisz tylko tłumaczenie.

Multipleksowany fluorescencyjny mikroarray do analizy białek śliny u ludzi z wykorzystaniem polimerowych mikrokul i światłowodowych pęczków

Opisujemy metodę multipleksową do wykrywania mikroorganizmów w próbce z wykorzystaniem kulek fluorescencyjnych sprzężonych z oligonukleotydami. Amplikony wszystkich organizmów w próbce są hybrydyzowane z panelem kulek sprzężonych z sondami. Do analizy typu każdej kulki oraz sygnału hybrydyzacji wykorzystywany jest instrument Luminex lub Bio-Plex.

Multipleksowa detekcja bakterii w złożonych próbkach klinicznych i środowiskowych z wykorzystaniem mikrosfer fluorescencyjnych sprzężonych z oligonukleotydami

Opis tworzenia polimerowej mikrosieci przy użyciu techniki fotopolimeryzacji na chipie. Opisano również wysokoprzepustową charakterystykę powierzchni z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych, pomiarów kąta zwilżania wodą, rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronowej, spektrometrii mas jonów wtórnych czasu przelotu oraz testu adhezji komórek.

Polimerowe mikromacierze do wysokoprzepustowego odkrywania biomateriałów

Wykorzystując technologię mikrosfer xMAP firmy Luminex Corporation, opracowaliśmy wielowiązkowy fluorometryczny test immunoenzymatyczny (MFIA) do nadzoru serologicznego różnych gatunków zwierząt laboratoryjnych. MFIA to zawiesinowa macierz mikrosfer, w której antygen, kontrola tkankowa lub immunoglobuliny są kowalencyjnie powiązane z kolorowo kodowanymi mikrosferami polistyrenowymi. Omówiono metodę testową MFIA oraz różne zagadnienia związane z rozwiązywaniem problemów.

Metodyka przeprowadzania i rozwiązywanie problemów w multipleksowym fluorometrycznym immunoprzebiegu

Ten film demonstruje technikę multipleksowego testu immunologicznego opartego na koralikach, który jednocześnie wykrywa przeciwciała przeciwko wielu patogenom środowiskowym w ludzkiej ślinie. Kulki fluorescencyjne sprzężono z antygenami różnych patogenów, które wychwycono za pomocą przeciwciał w próbce ludzkiej śliny. Po znakowaniu przeciwciał za pomocą reportera fluorescencyjnego, kulki analizowano za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny obecności w ślinie różnych przeciwciał...

Multipleksowy test immunologiczny oparty na kulkach do identyfikacji przeciwciał specyficznych dla patogenu w ślinie

Ten protokół opisuje wytwarzanie wielkoskalowego, multipleksowanego dwuwymiarowego DNA lub matrycy przeciwciał, z potencjalnymi zastosowaniami w badaniach nad sygnalizacją komórkową i wykrywaniem biomarkerów.

Wytwarzanie mikromacierzy przeciwciał z kodami kreskowymi o dużej gęstości pod kontrolą przepływu

Wielokolorowa detekcja fluorescencji w mikrofluidyce kropelkowej zazwyczaj obejmuje nieporęczne i złożone systemy detekcji oparte na mikroskopie epifluorescencyjnym. Tutaj opisujemy kompaktowy i modułowy schemat detekcji wielokolorowej, który wykorzystuje szereg światłowodów do czasowego kodowania wielokolorowych danych zebranych przez pojedynczy fotodetektor.

Wielokolorowa detekcja fluorescencji dla mikrofluidyki kropelkowej z wykorzystaniem światłowodów

W obecnym klimacie ograniczonych zasobów, pojawiają się nowe technologie, które pozwalają badaczom prowadzić badania taniej, szybciej i z większą precyzją. W tym miejscu opisujemy rozwój multipleksowego testu immunologicznego na bazie przeciwciał ślinowych na bazie kulek do pomiaru narażenia ludzi na wiele patogenów środowiskowych jednocześnie.

Opracowanie testu immunologicznego Multiplex opartego na przeciwciałach ślinowych do pomiaru narażenia ludzi na patogeny środowiskowe

Demonstrujemy technologię chipową do wykonywania testów immunologicznych typu sandwich bez reaktywności krzyżowej, po prostu pstrykając dwa slajdy. Aparat zatrzaskowy służy do niezawodnego przenoszenia odczynników z mikromacierzy do mikromacierzy. Chip zatrzaskowy może być stosowany do wszelkich reakcji biochemicznych wymagających kolokalizacji różnych odczynników bez zanieczyszczenia krzyżowego.

Snap Chip do multipleksowanych testów immunologicznych typu sandwich wolnych od reaktywności krzyżowej i Spotterów

Tutaj prezentujemy protokół do badania mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych w celu identyfikacji nowych interakcji receptor-ligand w wysokiej przepustowości. Opisujemy również metodę usprawniającą wykrywanie przejściowych interakcji białko-białko za pomocą kompleksów białko-mikrogranulki.

Technologia zewnątrzkomórkowych mikromacierzy białkowych do wysokoprzepustowego wykrywania interakcji receptor-ligand o niskim powinowactwie

Opisujemy metodę szybkiego barwienia do wykonywania obrazowania wielospektralnego na zamrożonych tkankach.

Szybka metoda wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego zamrożonych skrawków tkanek

Ten raport opisuje zautomatyzowany protokół do multipleksowych testów immunofluorescencyjnych (mIF) na automatycznym barwniku do szkiełek. Wykazano wysoką odtwarzalność proteomiki przestrzennej na standardowych autostainerach tkankowych o wysokiej przepustowości i obrazach fluorescencyjnych na całych szkiełkach, co jest idealne do niestandardowych testów mIF na dużej liczbie szkiełek tkankowych w badaniach translacyjnych.

Wysokowydajne zautomatyzowane multipleksowe testy immunofluorescencyjne do badań translacyjnych

Poznaj metodę multipleksowej analizy białek śliny z wykorzystaniem fluorescencyjnych mikrosfer polimerowych i wiązek światłowodowych. Technika ta umożliwia jednoczesne wykrywanie wielu białek w próbkach biologicznych.

Multipleksowana mikromacierz fluorescencyjna do analizy ludzkich białek śliny przy użyciu mikrosfer polimerowych i wiązek światłowodowych (Wideo) | JoVE Journal

Multipleksowana mikromacierz fluorescencyjna do analizy ludzkich białek śliny przy użyciu mikrosfer polimerowych i wiązek światłowodowych

Przeglądaj więcej filmów