Multipleksowana mikromacierz fluorescencyjna do analizy ludzkich białek śliny przy użyciu mikrosfer polimerowych i wiązek światłowodowych

Ogólnym celem tej procedury jest analiza wielu białek w próbkach ludzkiej śliny przy użyciu matryc fluorescencyjnych opartych na mikrosferach. Najpierw zakoduj mikrosfery różnymi ilościami dwóch barwników fluorescencyjnych. Sprzęgnij przeciwciała wychwytujące dla różnych białek z kodowanymi mikrosferami.

Następnie złóż multipleksowaną mikromacierz białkową na wiązce światłowodowej za pomocą warstwowych testów immunologicznych na zmontowanym teście mikromacierzy dla wielu białek w testowanych próbkach śliny. Ostatecznie analiza za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej może zmierzyć reakcje sygnałowe różnych białek w próbkach śliny. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak metoda Elizy, jest to, że umożliwia ona jednoczesną analizę wielu białek w złożonych płynach biologicznych.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w analizę ludzkiej śliny, może być również stosowana do innych biogryp, takich jak surowica, mocz i plwocina. Zważyć opium TTA w fiolce ze szkła bursztynowego i przygotować 200-milimolowy roztwór podstawowy w tetra hydro Furin. Delikatnie wymieszać pipetując i wizualnie sprawdzić, czy barwnik jest całkowicie rozpuszczony.

Podobnie, należy przygotować 12-milimolowy roztwór podstawowy kumaryny 30, delikatnie wymieszany przez pipetowanie. Wizualnie. Sprawdź, czy D jest całkowicie rozpuszczony wirowo do zawiesiny mikrosfery, a następnie przenieś 60 mikrolitrów do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Aby umyć mikrosfery, dodaj 600 mikrolitrów PBS zmieszanych przez pipetowanie 20 razy i odwiruj z prędkością 10 000 obr./min przez trzy minuty.

Po trzech przepłukaniach roztworem tetra hydrofuryny usunąć supernatant, ponownie zawiesić podniebienie w 600 mikrolitrach roztworu roboczego i przenieść mieszaninę do nowej 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Uszczelnij probówkę mikrowirówki folią par i umieść ją na shakerze. Chroń go przed światłem, przykrywając folią aluminiową.

Dodaj 200 mikrolitrów zakodowanej zawiesiny mikrosfery do bezpiecznej zamka, 1,5-mililitrowej mikrorurki wirówkowej. Kroplami dodaj 150 mikrolitrów, świeżo przygotowany roztwór EDC Natychmiast dodaj 150 mikrolitrów roztworu sulfonamidów NHS. Dobrze wymieszać pipetując i sprawdzić, czy zawiesina jest jednorodna.

Zakryj probówkę, uszczelnij ją paraformem i umieść na shakerze. Chroń go przed światłem, przykrywając folią aluminiową. Po trzech przemyciach bufora P-B-S-S-D-S zawiesić granulat w 200 mikrolitrach mieszanki buforowej P-B-S-S-D-S s.

Cóż, następnie przenieś roztwór do 300 mikrolitrów buforu P-B-S-S-D-S zawierającego 60 mikrogramów przeciwciał wychwytujących. Wymieszaj 50 mikrolitrów każdego rodzaju mikrosfer wychwytywania białek w nowej probówce wirówki do autoklawu. Odwirować podstawową pulę mikrosfer przy 7 000 obr./min przez trzy minuty i usunąć wszystkie oprócz 100 mikrolitrów supernatantu.

Teraz ręcznie przytnij wiązki światłowodowe do około pięciu centymetrów długości, sekwencyjnie wypoleruj oba końce za pomocą diamentowych folii docierających. Następnie poddaj sonikację wypolerowanemu wiązce w wodzie dejonizowanej przez dwie minuty. Aby usunąć wszelkie cząstki, umieść małe mieszadło magnetyczne w 0,5 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej.

Dodaj 400 mikrolitrów bezbiałkowego buforu PBS i mieszaj na magnetycznej płytce mieszającej przez 30 minut. Aby usunąć pęcherzyki powietrza, wytraw jeden koniec wiązki polerowanych włókien w 0,025 normalnego roztworu chlorowodoru na 150 sekund. Natychmiast zanurz i poddaj sonifikacji wytrawiony N w wodzie dejonizowanej na jedną minutę.

Następnie wysusz wiązki włókien sprężonym powietrzem, zamontuj wiązkę włókien na uchwycie światłowodu i zablokuj wytrawiony koniec w bezpęcherzykowym, wolnym od białka buforze PBS na jedną godzinę, zdeponuj jeden mikrolitrowy quad ALI przechowywanej zawiesiny mikrosfery na wytrawionym końcu wiązki światłowodowej. Chroń zestaw przed światłem za pomocą pudełka owiniętego folią aluminiową. Po 15 minutach objętość zawiesiny zmniejszy się w wyniku odparowania i wtłoczy mikrosfery do wytrawionych mikrostudzienek.

Użyj wacika nasączonego roztworem próbki, aby usunąć mikrosfery, które nie są uwięzione w mikrostudzienkach. Aby mikromacierz białkowa była gotowa do użycia, dodaj 200 mikrolitrów roztworu próbki do 0,5 mililitrowej probówki wirówkowej w autoklawie. Zanurz mikromacierz białkową załadowaną na włókno do roztworu i umieść na shakerze.

Chronić przed światłem, przykrywając folią aluminiową. Następnie zanurz mikromacierz białkową w nowej autoklawie mikrowirówkowej probówce zawierającej 200 mikrolitrów buforu do płukania i wstrząsaj z prędkością 600 obr./min przez dwie minuty. Teraz inkubuj mikromacierz w 100 mikrolitrowym roztworze koktajlu przeciwciał detekcyjnych zawierającego biotynylowane przeciwciała wykrywające i bufor blokujący PBS przez 30 minut.

W temperaturze pokojowej w ciemności wyczyść dystalny koniec wiązki włókien wacikiem nasączonym absolutnym etanolem. Następnie wysusz oba końce światłowodu sprężonym powietrzem, zamontuj włókno na mikroskopie fluorescencyjnym epi i zobrazuj przez dystalny koniec światłowodu, uzyskaj obrazy mikrosfery odpowiadające intensywności emisji fluorescencji opium TTAC 30 i SAP. Pokazano tutaj kodujące obrazy siedmiu typów mikrosfer

W obrazie kodującym UTTA obserwuje się dwa poziomy intensywności, które oznaczają mikrosfery kodowane różnymi ilościami matrycy UTTA Podobne wyniki obserwuje się w obrazie kodującym C 30. Analiza obrazu MATLAB pozwala na obliczenie intensywności fluorescencji różnych mikrosfer na obrazie sygnału. Wyniki dekodowania przedstawiono na rysunku 2D siódmym.

Różne mikrosfery są z powodzeniem dekodowane. Mikrosfery nie wykazują odpowiedzi podczas inkubacji z buforem testowym. Podczas inkubacji z próbkami ludzkiej śliny obserwuje się znaczące reakcje fluorescencyjne.

Dla lepszego porównania, kontrasty w tych dwóch figurach zostały dostosowane do tego samego poziomu. Po opanowaniu metoda ta umożliwia powtarzalną analizę różnych białek w próbkach ludzkiej śliny. Przedstawiono wyniki trzech niezależnych detekcji na tej samej próbce.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować mikropromieniowanie białkowe multipleksowe na bazie mikrosfery i wykorzystać je do złożonej analizy płynów biologicznych. Postępując zgodnie z tą procedurą. Można również analizować inne biomarkery białkowe w różnych złożonych płynach biologicznych.