Metodyka przeprowadzania i rozwiązywanie problemów w multipleksowym fluorometrycznym immunoprzebiegu
12 grudnia 2011
Wykorzystując technologię mikrosfer xMAP firmy Luminex Corporation, opracowaliśmy wielowiązkowy fluorometryczny test immunoenzymatyczny (MFIA) do nadzoru serologicznego różnych gatunków zwierząt laboratoryjnych. MFIA to zawiesinowa macierz mikrosfer, w której antygen, kontrola tkankowa lub immunoglobuliny są kowalencyjnie powiązane z kolorowo kodowanymi mikrosferami polistyrenowymi. Omówiono metodę testową MFIA oraz różne zagadnienia związane z rozwiązywaniem problemów.
Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wykrycie przeciwciał przeciwko przypadkowym czynnikom zakaźnym u zwierząt laboratoryjnych. Osiąga się to poprzez inkubację serum testowego z mikrosferami pokrytymi antygenem. Następnie serum inkubuje się z biotynilowanym, gatunkowo swoistym przeciwciałem przeciw immunoglobulinom, które wykrywa wszelkie kompleksy immunologiczne antygen-przeciwciało.
Następnie dodaje się roztwór Fluor force FICO eryn znakowany streptawidyną w celu wykrycia biotynilowanych immunoglobulin; otrzymane wyniki wskazują na pozytywny lub negatywny status przeciwciał przeciwko powszechnym czynnikom u gryzoni laboratoryjnych na podstawie multipleksowej fluorescencji, wyniku netto immunoanalizy oraz wartości fluorescencji próbki. Główną zaletą stosowania tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ELISA, jest to, że MFIA jest testem multipleksowym. Umożliwia to badaczowi przesiewowe wykonanie do stu różnych analiz w ramach jednego testu.
Ta technika zmniejsza ilość zużytych regionów surowicy oraz materiałów jednorazowych stosowanych w istniejących metodach, jednocześnie zwiększając ilość informacji generowanych z jednego testu. Pomysł zastosowania tej metody pojawił się podczas testowania dużej liczby próbek surowicy w kierunku wielu czynników, gdy chcieliśmy ograniczyć nakład pracy oraz czas testowania. Procedurę zademonstruje Donna Cohen, starsza technolog z naszego laboratorium. Na początek należy przygotować dwa bufory wymagane do przeprowadzenia procedury multipleksowego fluorescencyjnego testu immunoenzymatycznego (MFIA).
Pierwszym z nich jest rozcieńczalnik podstawowy, dostępny w ofercie firmy Charles River, który zawiera zastrzeżone środki blokujące w celu zmniejszenia nieswoistych oddziaływań dla buforu do płukania testu. Przygotować roztwór PBS z 1% BSA o pH 7.4 w celu usunięcia cząsteczek. Przefiltrować bufor przez jednostkę filtracyjną na korek butelki o rozmiarze 0.2 mikrona do sterylnych, oznakowanych pojemników, używając buforu do płukania testu.
Przygotować dwukrotne stężenia biotynilowanych przeciwciał antygatunkowych, IgG lub BAG oraz streptawidyny i fikerytyny lub SPE, które zostaną użyte do znakowania kompleksów antygen-przeciwciało utworzonych podczas etapu inkubacji surowicy testowej; w celu przygotowania próbek zgromadzić następujące materiały i materiały jednorazowe: wielokanałowe i jednokanałowe mikropipety wraz z końcówkami oraz płytki mikrotitracyjne 96-dołkowe o niskim wiązaniu białek do rozcieńczania białek. Po pobraniu próbek krwi i wyizolowaniu surowicy, krótko wymieszać surowicę w wirówce przed rozcieńczeniem próbek w rozcieńczalniku pierwotnym na płytce mikrotitracyjnej 96-dołkowej, aby zapewnić prawidłowe i jednorodne napełnienie dołków; każdy dołek płytki testowej 96-dołkowej należy uprzednio zwilżyć buforem płuczącym do analizy i powoli aspirować roztwór w trakcie całego badania.
Aspiracja powinna trwać od 5 do 10 sekund, aby zapobiec agregacji kulek oraz ich zbitym osadom na membranie filtra, co w obu przypadkach może wydłużyć czas odczytu na koniec analizy. Należy sprawdzić, czy drenaż cieczy ustał, osuszając spód płytki testowej ręcznikami papierowymi. Ważne jest, aby osuszać płytkę testową po każdym etapie płukania, aby zapobiec podsiąkaniu cieczy z dołków podczas inkubacji.
Aby przygotować koraliki, należy rozpocząć od wymieszania zawiesiny koralików sprzężonych za pomocą wibratora vortex. Następnie należy je krótko poddać sonikacji w kąpieli ultradźwiękowej. Prawidłowe resuspensowanie koralików jest kluczowe, aby zapobiec powstawaniu agregatów, które mogą prowadzić do wydłużenia czasu odczytu.
Następnie przenieś zawiesinę stokową 20x do dwukrotnie stężonego (2x) roztworu roboczego kuleczek w rozcieńczalniku podstawowym. Potem odmień 50 µL dwukrotnie stężonej (2x) zawiesiny kuleczek do każdego dołka płyty testowej, która została uprzednio zwilżona. Pipetuj 50 µL każdego dwukrotnie stężonego (2x) surowicy testowej i kontrolnej na płytę testową zgodnie z wcześniej przygotowanym schematem rozmieszczenia próbek na płycie.
Zabezpiecz pokrywę płytki. Przykryj ją folią aluminiową i inkubuj płytkę testową przez 60 minut na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej, aby uniknąć odparowania roztworów, co mogłoby utrudnić przeprowadzenie analizy. Przez cały czas trwania etapów inkubacji płytka testowa powinna pozostać przykryta pokrywą.
Dodatkowo, prędkość wytrząsania powinna wynosić od 400 do 700 RPM, aby kuleczki pozostały w zawiesinie, co umożliwi przeciwciałom z surowicy dostęp do wszystkich powierzchni sprzężonych antygenów. Po przemyciu płytki w kolejnych inkubacjach kuleczek z BAG i SPE, ponownie przemyj próbki. Następnie resuspenduj kuleczki, dodając 125 µL buforu do mycia w teście i wytrząsając przez dwie minuty przed odczytem płytki.
Umieść próbkę w czytniku analizatora w ciągu 10 minut od resuspensji kulek; kulki przechodzą pojedynczo przez detektor, gdzie są poddawane działaniu dwóch laserów. Jeden laser wzbudza barwniki wewnętrzne identyfikujące zestaw kolorów kulek, a drugi wzbudza barwnik raportujący FICO erything. Intensywność fluorescencji FICO erything dla określonej liczby kulek jest raportowana jako wartość FM FI; odczytaj pierwszą studzienkę, aby zweryfikować, czy wybrany panel kulek odpowiada profilowi kulek w studzienkach testowych.
Jeśli na wyświetlaczu protokołu kuleczki wypadają poza wyznaczony dla nich obszar, oznacza to wybór nieprawidłowego profilu. Kuleczki, które zostały prawidłowo resuspendowane, wypełnią określone obszary zgodnie ze wskazaniami oprogramowania czytnika do analiz. W przypadku agregacji kuleczek, będą one wypełniać swoje obszary w wolnym tempie.
Płytkę testową można wyjąć z czytnika i ręcznie resuspendować zawartość dołków, aby rozdzielić kulki. Wyjmij płytkę testową z czytnika i za pomocą pipety wielokanałowej wymieszaj każdy dołek od trzech do czterech razy. Następnie umieść płytkę testową z powrotem w czytniku i kontynuuj analizę wyników.
Zgłaszaj błędy, takie jak niewystarczająca liczba kulek lub spadające wyniki dla kulek IgG anty-IgG, i powtórz analizę dla tych próbek. Po wyeksportowaniu danych do programu Excel i obliczeniu wartości netto MFI ustal, czy którykolwiek z testów kontrolnych analizy nie zawiódł, z wyłączeniem surowicy immunologicznej o wysokim zakresie. Wszelkie nieprawidłowe kontrole są nieakceptowalne i analiza musi zostać powtórzona.
Tabela ta przedstawia dane dla surowicy testowej i kontroli testu z typowej płytki analitycznej. Wszystkie kontrole IgG zostały zaliczone. Wyniki testów dla tej płytki wskazują, że liczne próbki reaktywne tkankowo oraz kontrole IgG nie przeszły weryfikacji, co zaznaczono pomarańczowymi studzienkami.
A1C 1 oraz F1 wskazują na błąd reaktywności tkanki TC, gdzie wynik TC podano w nawiasach; Wells B 1 oraz E 1 ilustrują dwa rodzaje błędów wewnętrznej kontroli IgG: niewystarczającą ilość przeciwciał testowych lub odczynników testowych, odpowiednio BAG lub SPE. Wyniki płytki testowej są interpretowane tylko wtedy, gdy kontrola przydatności systemu oraz kontrola surowicy spełniają przedstawione tutaj kryteria akceptacji. Mikrosfery pokryte gatunkowo swoistymi przeciwciałami przeciwko immunoglobulinom surowicy testowej mogą wykazywać wyniki negatywne z powodu dodania niewystarczającej ilości próbki, zbyt dużego rozcieńczenia próbki, zastosowania niewłaściwego gatunku lub badania surowicy pochodzącej od gospodarza z niedoborem odporności.
Jeśli wyniki kontrolne testu są satysfakcjonujące, indywidualne wyniki testów są klasyfikowane zgodnie z poniższymi wytycznymi. Po zastosowaniu tej procedury należy użyć dodatkowych metod, takich jak ELISA, IFA i/lub Western blot, aby potwierdzić początkowe nieoczekiwane lub pozytywne wyniki. Kluczowe jest zweryfikowanie tych wyników przed podjęciem jakiejkolwiek decyzji dotyczącej zarządzania zwierzętami.
Można to osiągnąć, stosując różne metodologie na tej samej próbce lub na dodatkowych próbkach pochodzących z tej samej kolonii. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania multipleksowego fluorescencyjnego testu immunoenzymatycznego oraz interpretacji wyników uzyskanych w Państwa placówce. Pozwoli to na zmniejszenie nakładu pracy przy jednoczesnym pozyskiwaniu większej ilości informacji z każdego dołka z próbką testową.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia opracowanie wielofunkcyjnego fluorescencyjnego testu immunoenzymatycznego (MFIA) z wykorzystaniem technologii xMAP firmy Luminex Corporation do nadzoru serologicznego zwierząt laboratoryjnych. MFIA umożliwia jednoczesne wykrywanie przeciwciał przeciwko wielu czynnikom zakaźnym, co zwiększa wydajność i zmniejsza zużycie zasobów podczas testowania.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Badania serologiczne
- Zdrowie zwierząt laboratoryjnych
Wstęp
- Tradycyjne metody serologiczne, takie jak ELISA, są czasochłonne i wymagają dużych nakładów zasobów.
- MFIA umożliwia multipleksowanie, co pozwala na jednoczesne przeprowadzanie licznych analiz.
- Celem tej metody jest usprawnienie wykrywania przeciwciał u zwierząt laboratoryjnych.
- Kluczową zaletą MFIA jest efektywne wykorzystanie próbek surowicy oraz materiałów jednorazowych.
Cel badania
- Opracowanie bardziej wydajnej metody wykrywania przeciwciał przeciwko czynnikom zakaźnym u zwierząt laboratoryjnych.
- Zmniejszenie nakładów pracy i czasu testowania związanego z metodami tradycyjnymi.
- Zapewnienie kompleksowej oceny statusu przeciwciał w ramach jednego testu.
Zastosowane metody
- Inkubacja surowicy badawczej z mikrosferami pokrytymi antygenem.
- Zastosowanie biotynilowanej przeciwciał antyimmunoglobulinowych w celu wykrycia kompleksów antygen-przeciwciało.
- Zastosowanie roztworów detekcyjnych znakowanych streptawidyną do pomiaru fluorescencji.
- Konfiguracja analizy multipleksowej z wykorzystaniem formatu 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej.
Główne wyniki
- Skuteczne wykrycie przeciwciał przeciwko różnym czynnikom zakaźnym u zwierząt laboratoryjnych.
- Wykazano zmniejszenie objętości surowicy oraz zużycia materiałów jednorazowych w porównaniu z tradycyjnymi testami.
- Uzyskano wyniki ilościowe dzięki multipleksowej analizie fluorescencyjnej.
- Zidentyfikowano potencjalne problemy z agregacją kulek, wpływającej na wydajność testu.
Wnioski
- MFIA stanowi praktyczną alternatywę dla tradycyjnych metod serologicznych.
- Technika ta zwiększa efektywność nadzoru serologicznego w warunkach laboratoryjnych.
- Dalsza optymalizacja może być niezbędna w celu rozwiązania problemów technicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Multipleksowy fluorometryczny immunoassay (MFIA) odpowiada na zapotrzebowanie na wysokoprzepustowy nadzór serologiczny w badaniach przedklinicznych, umożliwiając jednoczesne wykrywanie przeciwciał przeciwko wielu czynnikom zakaźnym. Zdolność ta ogranicza zużycie próbek, odczynników i czas analizy, zwiększając jednocześnie gęstość danych z każdej dołki testowej. W badaniach i rozwoju farmaceutycznym MFIA wspiera wczesną walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego, dostarczając wiarygodnych, ilościowych danych o statusie immunologicznym z ograniczonych objętości próbek przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez szerokie profilowanie ekspozycji na patogeny w modelach zwierzęcych.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez wykluczenie zmiennych zakłócających wynikających z przypadkowych infekcji.
- Pewność prognostyczna: Usprawnia selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację modeli z naruszoną integralnością immunologiczną.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych etapów analizy poprzez rygorystyczną weryfikację stanu zdrowotności.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie standaryzacji i powtarzalności testów za pomocą wewnętrznych kulek kontrolnych (kontrole tkankowe, IgG oraz kontrole przydatności systemu).
- Skalowalność: Umożliwienie przygotowania do przesiewu do 100 testów na studzienkę, co poprawia możliwość ponownego wykorzystania platformy w kampaniach przesiewowych przeciwciał.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Omówienie znaczenia dla badań nad chorobami poprzez zapewnienie, że modele zwierzęce są wolne od zakłócających czynników zakaźnych, które mogłyby zniekształcić odczyty fenotypowe.
- Wartość operacyjna: Opis ciągłości procesu od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez utrzymanie spójności modelu w poszczególnych fazach badania.
- Decyzje skorygowane o ryzyko: Wsparcie kryteriów go/no-go w oparciu o serologiczny stan zdrowia przed podaniem związku.
Integracja potoku i przepływu pracy
MFIA wpisuje się w kontinuum procesu badawczego, od wczesnego etapu odkrywania (Early Discovery) po identyfikację wiodących związków (Lead Identification) i prace przedkliniczne, pełniąc rolę etapu weryfikacyjnego w ocenie przydatności modelu przed rozpoczęciem przesiewania związków lub testowania ich skuteczności.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnia, w jaki sposób metoda ta wspiera testowanie hipotez poprzez weryfikację, że obserwowane fenotypy nie są wynikiem infekcji subklinicznych.
- Screening: Opisuje gotowość testu poprzez ilościowe wyniki netto MFI oraz wbudowane kontrole zapewniające niezawodność danych.
- Analityka: Podkreśla zastosowanie pomiarów fluorescencji multipleksowej oraz obliczeń wyników netto, które umożliwiają porównania między różnymi warunkami testowymi i panelami antygenowymi.
- Badania translacyjne: Łączy metodę z ciągłością przedkliniczną, zapewniając, że systemy istotne dla przebiegu choroby pozostają immunologicznie naiwne lub są odpowiednio zcharakteryzowane.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Przedstawia metodę jako możliwość ponownego wykorzystania w ramach bieżącego monitorowania stanu zdrowia kolonii w wielu projektach i ośrodkach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna, walidacja celu, ograniczenie niejednoznaczności mechanistycznej wynikającej z infekcyjnych czynników zakłócających.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność dzięki detekcji wielkoelementowej opartej na kuleczkach oraz kontrolom wewnętrznym.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), efektywność kapitałowa i zredukowane ryzyko biologiczne w późnych etapach wynikające z niewykrytej ekspozycji na patogeny.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja i decyzje o rozwoju skorygowane o ryzyko, w oparciu o zweryfikowany stan zdrowia modeli zwierzęcych.
Kwestie dotyczące implementacji
- Wymagana wiedza specjalistyczna z zakresu zasad immunoanaliz, technologii Luminex oraz interpretacji danych z pomiarów multipleksowych.
- Potrzeby w zakresie instrumentarium i infrastruktury analitycznej, w tym czytnik Luminex, potrząsarka do płytek oraz system detekcji fluorescencji.
- Wymogi standaryzacji międzyzespołowej w zakresie przygotowania odczynników, obchodzenia się z kuleczkami i spójności protokołu płukania.
- Uwagi dotyczące adaptacji w różnych systemach modelowych, w tym wybór antygenów specyficznych dla gatunku oraz walidacja kuleczek kontrolnych.
- Ograniczenia praktyczne opisane w materiale źródłowym: agregacja kuleczek wpływająca na czas odczytu oraz konieczność prawidłowej resuspensji w celu uniknięcia wyników fałszywie ujemnych lub podwyższonego tła.
