Metodologia testowania multipleksowego fluorometrycznego testu immunologicznego i rozwiązywanie problemów
December 12th, 2011
Korzystając z technologii mikrosfery xMAP firmy Luminex Corporation, opracowaliśmy Multipleksowany Fluorometryczny Test Immunologiczny (MFIA) do seronadzoru różnych gatunków zwierząt laboratoryjnych. MFIA to mikromacierz zawiesinowa, w której antygen, kontrola tkanek lub immunoglobuliny są kowalencyjnie połączone z mikrosferami polistyrenu oznaczonymi kolorami. Omówiono metodę testowania MFIA, a także różne tematy związane z rozwiązywaniem problemów.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykrycie przeciwciał przeciwko przypadkowym czynnikom zakaźnym u zwierząt laboratoryjnych. Osiąga się to poprzez inkubację surowicy testowej z mikrosferami pokrytymi antygenem. Następnie surowicę inkubuje się z biotynylowaną, znakowaną gatunkowo antyimmunoglobuliną, która wykrywa wszelkie kompleksy immunologiczne przeciwciał antygenowych.
Następnie dodaje się znakowany streptawidyną roztwór siły fluoru FICO eryn w celu wykrycia wszelkich biotynylowanych immunoglobulin, uzyskuje się wyniki, które wykazują dodatni lub ujemny status przeciwciał dla powszechnych czynników u gryzoni laboratoryjnych na podstawie fluorescencji multipleksowej, wyniku testu immunologicznego, wartości próbki fluorescencyjnej. Główną zaletą stosowania tej techniki w porównaniu z istniejącą metodą, taką jak Eliza, jest to, że MFIA jest testem multipleksowym. Dzięki temu badacz może przebadać do stu różnych testów w jednym teście.
Cóż, technika ta zmniejsza ilość regionów surowicy i materiałów jednorazowego użytku stosowanych w istniejących metodach, jednocześnie zwiększając ilość informacji generowanych z pojedynczego testu. Cóż, po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł zastosowania tej metody, gdy testowaliśmy dużą liczbę próbek surowicy pod kątem wielu czynników i chcieliśmy skrócić nakład pracy, a także czas testowania. Procedurę zademonstruje Donna Cohen, starszy technolog z naszego laboratorium Na początek przygotuj dwa wymagane do procedury multipleksu, fluorescencji, testu immunologicznego lub MFIA.
Pierwszym z nich jest rozcieńczalnik pierwotny, który jest dostępny w Charles River i zawiera zastrzeżone środki blokujące w celu zmniejszenia niespecyficznych interakcji dla buforu do przemywania testu. Przygotować roztwór PBS o 1% BSA pH 7,4 w celu usunięcia cząstek stałych. Przefiltrować bufor przez górną jednostkę butelki o średnicy 0,2 mikrona do sterylnie oznakowanych pojemników za pomocą buforu do mycia testów.
Przygotować dwa stężenia biotynylowanych antyspektów, IGG lub BAG i paciorkowca AVID i FICO erything lub SPE, które zostaną użyte do oznakowania kompleksów przeciwciał antygenowych powstałych podczas etapu inkubacji surowicy testowej w celu przygotowania próbek następujących materiałów i materiałów jednorazowego użytku zmontowanych wielo- i jednokanałowych mikropipet i końcówek oraz 96 dołków mikromiareczkowych o niskim stopniu wiązania białek do rozcieńczania białek. Po pobraniu próbek krwi i wyizolowaniu surowicy, surowicę należy na krótko odwirować surowicę przed rozcieńczeniem w rozcieńczalniku pierwotnym na 96-dołkowej płytce do mikromiareczkowania, aby zapewnić prawidłowe i równomierne opróżnianie studni przed zwilżeniem. Każda studzienka z 96-dołkowej płytki testowej z buforem do przemywania testu powoli zasysa roztwór przez cały czas trwania testu.
Aspiracja powinna trwać od pięciu do 10 sekund, aby zapobiec agregacji kulek i zagęszczaniu kulek w membranie filtracyjnej, co może spowolnić czas odczytu pod koniec testu. Sprawdź, czy odpływ cieczy został zatrzymany, osuszając spód płytki testowej ręcznikami papierowymi. Ważne jest, aby osuszyć płytkę testową po każdym etapie mycia, aby zapobiec wydostawaniu się wody na zewnątrz podczas inkubacji.
Aby przygotować koraliki, zacznij od wirowania zawiesiny koralików sprzężonej z kolbą. Następnie krótko poddaj je sonikacji w kąpieli. Bardzo ważne jest, aby ponownie zawiesić koraliki, aby zapobiec zagregowanym skupiskom koralików, co może skutkować dłuższym czasem odczytu.
Następnie dozować 20 x zawiesinę podstawową do dwóch x roboczego roztworu kulek w rozcieńczalniku pierwotnym. Następnie dozować 50 mikrolitrów zawiesiny z dwoma kulkami x do każdego dołka testowego wstępnie zwilżonej płytki testowej. Odpipetować 50 mikrolitrów z każdych dwóch x surowicy testowej i kontrolnej na płytkę testową w oparciu o predefiniowaną mapę płytki.
Przymocuj pokrywkę do talerza. Przykryj folią aluminiową i inkubuj płytkę testową przez 60 minut na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej, aby uniknąć parowania roztworów, które mogą uniemożliwić powodzenie testu. Utrzymuj płytkę testową przykrytą pokrywką płytki podczas wszystkich etapów inkubacji.
Ponadto wstrząs z prędkością powinien być większy niż 400, ale mniejszy niż 700 obr./min, tak aby kulki pozostały w zawiesinie, aby umożliwić przeciwciałom surowicy dostęp do wszystkich powierzchni sprzężonych antygenów. Po umyciu płytki w sekwencyjnych inkubacjach kulek za pomocą BAG i SPE, należy ponownie umyć próbki. Następnie ponownie zawieś kulki, dodając 125 mikrolitrów testu, przemyj, buforuj i potrząsaj przez dwie minuty, aby odczytać płytkę.
Umieść go w czytniku testowym w ciągu 10 minut od resusu zawieszając kulki, kulki przechodzą pojedynczo przez detektor, gdzie są wystawione na działanie dwóch laserów. Jeden laser wzbudza wewnętrzne barwniki, które identyfikują zestaw kolorów koralików, a drugi wzbudza barwnik reporterowy FICO. Intensywność fluorescencji elementowej FICO dla z góry określonej liczby ściegów jest podawana, gdy FM FI odczytuje pierwszą studzienkę, aby sprawdzić, czy wybrany panel ściegu pasuje do profilu ściegu w dołkach testowych.
Jeśli na wyświetlaczu protokołu znajdują się koraliki wypadające poza wyznaczony dla nich obszar ściegu, oznacza to, że dokonano nieprawidłowego wyboru profilu. Koraliki, które zostały prawidłowo zawieszone, wypełnią określone obszary, jak wskazano w oprogramowaniu czytnika testów. Jeśli koraliki zostaną zagregowane, będą wypełniać swoje obszary w wolnym tempie.
Możesz wyjąć płytkę testową z czytnika i ręcznie zawiesić dołki, aby oddzielić koraliki. Wyjmij płytkę testową z czytnika i użyj pipetera wielokanałowego z trzema szybkościami do każdej studzienki trzy do czterech razy. Następnie zwróć płytkę testową do czytnika i kontynuuj sprawdzanie wyników.
Należy zgłosić błędy, takie jak niewystarczająca liczba kulek lub spadające wyniki kulek IgG anty IgG, i powtórzyć test dla tych próbek. Po wyeksportowaniu danych do Excela i obliczeniu MFI netto określ, czy którykolwiek z testów gry kontrolnej wyklucza surowicę immunologiczną wysokiego zakresu. Wszelkie nieudane kontrole są niedopuszczalne i test należy powtórzyć.
Poniższa tabela przedstawia dane dotyczące surowicy testowej i kontroli testowej z typowej płytki testowej. Czy wszystkie kontrole IgG przeszły pomyślnie. Wyniki testów dla tej sztuki wskazują, że wiele próbek reaktywnych tkankowo i kontrolnych IgG zawiodło, co zaobserwowano w pomarańczowych studzienkach.
A1C jeden i F1 wskazują na niewydolność tkankową TC, gdzie wynik TC jest reprezentowany w nawiasach, studzienki B jeden i E jeden ilustrują dwa rodzaje niepowodzeń kontroli wewnętrznej IgG, niewystarczające przeciwciało testowe lub odczynniki testowe, odpowiednio BAG lub SPE. Wyniki badań na płytkach są interpretowane tylko wtedy, gdy kontrola przydatności systemu i kontrola surowicy spełniają przedstawione tutaj kryteria akceptacji. Mikrosfery pokryte specyficzną dla gatunku immunoglobuliną surowicy przeciwtestowej mogą wykazywać wyniki niezadowalające z powodu dodania zbyt dużej ilości niewystarczającej próbki, rozcieńczenia próbki, niewłaściwego gatunku lub badania surowicy od gospodarza z niedoborem odporności.
Jeżeli wyniki testu kontrolnego są zadowalające, poszczególne wyniki testu klasyfikuje się zgodnie z poniższymi zasadami. Postępując zgodnie z tą procedurą, powinniśmy użyć dodatkowych metod, takich jak Eliza, IFA i/lub Western blot, aby potwierdzić początkowe nieoczekiwane lub pozytywne wyniki. Bardzo ważne jest, aby zweryfikować te wyniki przed podjęciem jakiejkolwiek decyzji dotyczącej zarządzania zwierzętami.
Można tego dokonać, stosując różne metodologie na tej samej próbce lub dodatkowych próbkach z tej samej kolonii. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać multipleksowy fluoro, metryczny test immunologiczny i zinterpretować wyniki uzyskane w Twojej placówce. Umożliwi to zmniejszenie nakładu pracy przy jednoczesnym zebraniu większej ilości informacji z każdej próbki testowej.
Przegląd
Badanie to prezentuje opracowanie Wielokrotnej Fluorometrycznej Odczynki Immunologicznej (MFIA) z wykorzystaniem technologii xMAP firmy Luminex Corporation do seroobserwacji u zwierząt laboratoryjnych. MFIA umożliwia jednoczesne wykrywanie przeciwciał skierowanych przeciwko wielu czynnikom zakaźnym, zwiększając wydajność i redukując zużycie zasobów podczas testowania.
Kluczowe Elementy Badania
Dział Obszaru Nauki
- Immunologia
- Badania serologiczne
- Zdrowie zwierząt laboratoryjnych
Wprowadzenie
- Tradycyjne metody serologiczne, takie jak ELISA, są czasochłonne i wymagają znacznych zasobów.
- MFIA umożliwia wielokrotność (multiplexing), umożliwiając jednoczesne przeprowadzanie wielu testów.
- Metoda ta ma na celu poprawę wykrywania przeciwciał u zwierząt laboratoryjnych.
- Wydajne wykorzystanie próbek surowicy i materiałów jednorazowych jest kluczową zaletą MFIA.
Cel Badania
- Opracowanie bardziej efektywnej metody wykrywania przeciwciał skierowanych przeciwko czynnikom zakaźnym u zwierząt laboratoryjnych.
- Redukcja nakładu pracy i czasu testowania związanych z tradycyjnymi metodami.
- Umożliwienie kompleksowej oceny statusu przeciwciał w pojedynczym teście.
Wykorzystane Metody
- Inkubacja testowanej surowicy z mikrokulkami pokrytymi antygenem.
- Wykorzystanie biolotynilowanego przeciwciała przeciwko immunoglobulin do wykrywania kompleksów antygen-przeciwciało.
- Zastosowanie roztworów detekcyjnych oznaczonych streptawidyną do pomiaru fluorescencji.
- Konfiguracja testu wielokrotnego z wykorzystaniem formatu płytki mikrotitra 96-dołowej.
Główne Wyniki
- Pomyślne wykrywanie przeciwciał skierowanych przeciwko różnym czynnikom zakaźnym u zwierząt laboratoryjnych.
- Zilustrowano zmniejszenie objętości surowicy i zużycia materiałów jednorazowych w porównaniu z tradycyjnymi testami.
- Dostarczenie wyników ilościowych dzięki wielokrotnej analizie fluorescencji.
- Zidentyfikowano potencjalne problemy z agregacją kulek wpływające na wydajność testu.
Wnioski
- MFIA jest wykonalną alternatywą dla tradycyjnych metod serologicznych.
- Technika ta zwiększa efektywność seroobserwacji w środowisku laboratoryjnym.
- Może być wymagana dalsza optymalizacja w celu rozwiązania problemów technicznych.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay (MFIA) addresses the need for high-throughput serosurveillance in preclinical research by enabling simultaneous detection of antibodies against multiple infectious agents. This capability reduces sample consumption, reagent use, and assay time while increasing data density per test well. For biopharma R&D, MFIA supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by providing reliable, quantitative immune status data from limited preclinical sample volumes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through broad pathogen exposure profiling in animal models.
- Operational Value: Supports functional target validation by clarifying confounding variables from adventitious infections.
- Predictive Confidence: Enhances portfolio triage by identifying models with compromised immunological integrity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows through rigorous health status verification.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility via internal control beads (tissue, IgG, and system suitability controls).
- Scalability: Enables screening readiness for up to 100 assays per well, improving platform reuse in antibody screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by ensuring animal models are free from confounding infectious agents that could skew phenotypic readouts.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by maintaining model integrity across study phases.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports go/no-go criteria based on serological health status before compound administration.
Pipeline & Workflow Integration
MFIA fits within the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification and Preclinical work, serving as a gatekeeping step for model suitability before compound screening or efficacy testing.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing by verifying that observed phenotypes are not driven by subclinical infections.
- Screening: Describes assay readiness through quantitative net MFI outputs and built-in controls that ensure data reliability.
- Analytics: Highlights multiplex fluorescence measurements and net score calculations that enable comparison across test conditions and antigen panels.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by ensuring that disease-relevant systems remain immunologically naive or appropriately characterized.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for ongoing colony health monitoring across multiple projects and sites.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity from infectious confounders.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via multiplexed bead-based detection and internal controls.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk from undetected pathogen exposure.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on verified animal model health.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in immunoassay principles, Luminex technology, and multiplex data interpretation.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including a Luminex reader, plate shaker, and fluorescence detection system.
- Cross-team standardization requirements for reagent preparation, bead handling, and wash protocol consistency.
- Adaptation considerations across model systems, including species-specific antigen selection and control bead validation.
- Practical limitations supported by source material: bead aggregation affecting read times and the necessity of proper resuspension to avoid false negatives or elevated background.
