Synteza submonomerów w fazie stałej polimerów peptydowych i ich samoorganizacja w wysoce uporządkowane nanoarkusze

Ogólnym celem tej procedury jest opisanie prostej i wydajnej metody syntezy peptydów w fazie stałej oraz wodnej samoorganizacji peptydów w wysoce uporządkowane nanoarkusze. Strukturalnie podobne do polipeptydów, peptydy znajdują się w podstawionych polimerach glicyny, w których łańcuchy boczne są przyłączone do azotu, a nie do węgla alfa. Proces rozpoczyna się od syntezy określonej sekwencji peptydowej za pomocą innej metody submonomeru.

Metoda submonomeru składa się z dwóch prostych etapów chemicznych, które wprowadzają każdy monomer do łańcucha sekwencyjnie. Po pierwsze, amina przyłączona do stałego nośnika jest acetylowana bromo. Po drugie, bromek jest wypierany przez aminę pierwszorzędową.

Kroki te są powtarzane aż do osiągnięcia pożądanej długości łańcucha Po wydłużeniu łańcucha peptyd jest odcinany od stałego podłoża, a powstały surowy olej peptydowy jest oczyszczany przez HPLC i charakteryzowany do inicjowania samoorganizacji peptydów w nano arkusze. Rozcieńczony wodny roztwór buforowy peptydu przygotowuje się w szklanej fiolce i delikatnie miesza. Na koniec.

Arkusze nano są badane pod mikroskopem. Wyniki pokazują, że iteracyjny cykl składający się z dwóch prostych etapów chemicznych może dać polimer specyficzny dla sekwencji, który spontanicznie samoorganizuje się w nanoarkusze. Peptydy to nowa klasa polimerów inspirowanych biologicznie, o właściwościach pośrednich między białkami a tradycyjnymi polimerami.

Są wytrzymałe i syntetycznie wszechstronne, jak tradycyjne polimery, ale są również wysoce dostrajalne i specyficzne dla sekwencji, takie jak białka i peptydy DNA, które pojawiają się jako zaawansowany materiał do rozwiązywania kluczowych problemów w biomedycynie i materiałoznawstwie, takich jak identyfikacja leków bioaktywnych lub projektowanie sztucznych białek. Do głównych zalet peptydów należy precyzyjna kontrola sekwencji, dostępność niezwykle różnorodnych elementów budulcowych, wydajna synteza i stabilność proteazy. Przedstawiono ogólną metodę ręcznej syntezy peptydów, obejmującą podstawowy sprzęt i dostępne na rynku odczynniki, umożliwiającą łatwą syntezę peptydów w większości laboratoriów.

Wizualna demonstracja etapów syntezy ma kluczowe znaczenie i służy jako cenne odniesienie dla osób rozpoczynających dziedzinę syntezy fazy stałej. Po raz pierwszy w tym przypadku opisano oczyszczanie i charakterystykę amfifilowego peptydu 36 merów, a także jego samoorganizację w wysoce uporządkowane nano arkusze. Rozpocznij ten protokół od ustawienia aparatury doświadczalnej zgodnie z opisem w pisemnym protokole.

Poniższe kroki zostaną wykonane w szklanym naczyniu reakcyjnym zamiast jednorazowego wkładu ze spiekanego polipropylenu dla przejrzystości. Po ustawieniu na 100 miligramów żywicy R amidu do spiekanego naczynia reakcyjnego, spęcznić żywicę, dodając dwa mililitry amidu formy dimetylowej lub mieszania DMF, bulgocząc przez 10 minut. Następnie odcedź roztwór próżniowo, aby wyizolować spęczniałą żywicę.

Następnie dodaj jeden mililitr 20% pełnej pirydyny metylowej do DMF, aby chronić grupę FM O. Mieszać przez dwie minuty i odcedzić. Powtarzaj ten proces przez 12 minut, a następnie spłucz żywicę, dodając dwa mililitry DMF, mieszając przez 15 sekund i odsączając.

Rozpocznij hodowlę łańcucha peptydowego od pierwszego cyklu submonomeru, który obejmuje acetylację bromo i etap przemieszczenia. W przypadku acetylacji bromo dodaj jeden mililitr 0,6 molowego kwasu bromooctowego w DMF i 86 mikrolitrów roztocza diizopropylowokarbokarbo. Po mieszaniu przez 30 minut odcedź i spłucz dwoma mililitrami DMF.

Następnie wykonaj przemieszczenie, dodając jeden mililitr jednej do dwóch amin molowych w końcowej inkubacji genonu pirometrycznego metylu przez 30 do 120 minut po inkubacji, odcedź i przepłucz dwoma mililitrami DMF. Ponownie kontynuuj wzrost łańcucha peptydowego, powtarzając cykl submonomeru. Po wykonaniu ostatecznego przemieszczenia spłucz dwoma mililitrami DMF.

Następnie nasadka do płukania metanu diora i przechowywać naczynie reakcyjne do momentu rozszczepienia. Aby rozpocząć rozszczepianie, przenieś całą wysuszoną żywicę do 20-mililitrowej fiolki ze szkła scyntylacyjnego pracującej wewnątrz kaptura i używając odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej, dodaj cztery mililitry kwasu trifluorooctowego lub koktajlu rozszczepienia TFA do fiolki ze szkła scyntylacyjnego i nakrętki. Mocno mieszaj przez 10 minut do dwóch godzin w temperaturze pokojowej.

Alternatywnie użyj wytrząsarki obrotowej, aby wymieszać roztwór. Zebrać roztwór do rozszczepienia TFA, filtrując żywicę przez jednorazowy wkład ze spiekanego polipropylenu do nowej, wstępnie zważonej 20-mililitrowej fiolki ze szkła scyntylacyjnego. Następnie dodaj jeden mililitr świeżego koktajlu z dekoltu, aby wypłukać żywicę i zebrać resztki peptydu.

Powtórz to, spłucz dwa razy. Odparować TFA, wdmuchując delikatny strumień azotu lub używając ładunku biotycznego. Parownik V 10 czerwony rozpuść ropę naftową w sześciu mililitrach acetonu nitrylu i wody jeden do jednego.

Następnie zamrozić i liofilizować próbkę. Proces ten należy powtórzyć jeszcze raz po drugiej liofilizacji. Zapisać masę produktu surowego przechowywanego w postaci suchego proszku w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza za pomocą kombinacji spleśniałego analitycznego HPLC i/lub elektrycznego rozpylania LCMS.

Czystość produktu surowego i to, czy występuje w nim pożądana masa cząsteczkowa, można określić, postępując zgodnie z procedurami opisanymi w tekście. Surowa mieszanina peptydów może być następnie oczyszczona za pomocą HPLC z odwróconą fazą przygotowawczą zgodnie z pisemną procedurą. W tej sekcji opisano protokół tworzenia arkuszy z pojedynczego łańcucha specyficznego dla amfifilowego peptydu 36 me.

Po zsyntetyzowaniu, oczyszczeniu i liofilizacji nici peptydowej, powstały biały proszek rozpuszcza się w DMSO w celu wytworzenia dwumilimolowego roztworu podstawowego. Następnie zdobądź jeden pilnik Dr.Glass, aby przygotować 20-mikromolowy roztwór peptydu. Najpierw dodaj 445 mikrolitrów wody mili Q i 50 mikrolitrów 10 x bufor do tworzenia arkuszy.

Odwirować fiolkę do wymieszania. Następnie dodaj pięć mikrolitrów dwumilimolowego roztworu podstawowego peptydu i delikatnie napęczniaj. Otrzymane arkusze roztworu są tworzone przez delikatne mieszanie rozcieńczonego wodnego roztworu peptydu.

Powoli przechylać szklaną fiolkę z nakrętką z pozycji poziomej do pozycji pionowej. Powoduje delikatne potrząsanie arkuszy, daje również arkusze. Jednak arkusze są zwykle mniejsze i mają mniej prostych krawędzi w przypadku wielu arkuszy wysokiej jakości.

Obracaj szklane fiolki powoli wokół osi poziomej przez jeden dzień za pomocą rotatora rurowego lub niestandardowego wahacza do fluorescencyjnego barwienia nano arkuszy, dodaj jeden mikrolitr 100 mikromolowej czerwieni Nilu do 100 mikrolitrów roztworu nano arkusza, aby uzyskać końcowe stężenie jednego mikromolowego Nilu. Czerwony jest barwnikiem wrażliwym na środowisko, którego intensywność fluorescencji wzrasta, gdy jest zlokalizowany w środowisku hydrofobowym. Następnie przygotuj 1% roztwór aros w gorącej wodzie i wlej do plastikowej szalki Petriego.

Upewnij się, że roztwór aros ma grubość około jednej ósmej cala i pozwól roztworowi ostygnąć bez przeszkód na płaskiej powierzchni. Po zastygnięciu aros użyj szpatułki, aby wyciąć kwadraty o wymiarach jeden centymetr na jeden centymetr. Następnie przenieś wycięte kwadraty na szkiełko podstawowe, aby zebrać arkusze w tym samym miejscu płaskim, jeden mikrolitr roztworu arkusza na kawałek aros.

Po dwóch minutach aros powinien wchłonąć bufor, pozostawiając arkusze na powierzchni. Zobrazuj arkusz w ciągu 15 minut. Alternatywnie, aby zobrazować arkusze i roztwór, załaduj 15 mikrolitrów do uszczelki o średnicy 0,12 milimetra o średnicy 20 milimetrów na szklanym szkiełku.

Przykryj próbkę szkiełkiem nakrywkowym i obrazem w ciągu kilku dni, aby wykonać SEM nano arkuszy. Pierwsze chipy krzemowe wytrawiające plazmowo, które wspomagają absorpcję nanoarkuszy. Następnie upuść 20 mikrolitrów roztworu peptydowego na podłoże krzemowe poddane obróbce plazmowej i pozostaw roztwór po trzech minutach, usuń nadmiar roztworu końcówką pipety Kim, przetrzyj 20 mikrolitrów wody na powierzchnię i ponownie odchodź nadmiar roztworu, aby usunąć bufor i sole.

Alternatywnie, roztwory arkuszy peptydowych są dializowane z wodą w celu usunięcia buforu i soli. W takim przypadku 20 mikrolitrów roztworu dializowanego arkusza można upuścić na podłoża krzemowe poddane obróbce plazmowej i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Po wyschnięciu roztworu arkusza na podłożach krzemowych poddanych obróbce plazmowej, arkusz można obrazować za pomocą SEM za pomocą detektora w soczewce przy energiach wiązki od jednego kilowolta do pięciu kilowoltów.

Przeprowadzono syntezę, charakterystykę i oczyszczanie specyficznego dla sekwencji peptydu o ładunku blokowym 36 me, który składa się w wysoce uporządkowany dwuwymiarowy arkusz nano. Aminy wykorzystujące syntezę peptydu ładunku blokowego 36 me będą przekształcać etylenodiaminę w fenetylo, aminę i beta alaninę t butylu. Po syntezie surowy peptyd został odcięty od żywicy za pomocą 95% wodnego TFA.

Po zebraniu i odparowaniu roztworu TFA. Surowy peptyd o natężeniu 36 m został oczyszczony za pomocą HPLC z odwróconą fazą. Masa oczyszczonego peptydu ładunku blokowego została następnie potwierdzona przez pleśń.

Obserwowana masa 4981,2 jest ściśle zgodna z masą obliczoną wynoszącą 4981,74. Liofilizowany proszek rozpuszczono w DMSO w celu uzyskania dwumilimolowego roztworu podstawowego i przechowywano w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Arkusze zostały przygotowane według ww. protokołu i obrazu za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii optycznej.

Obserwuje się różnorodne kształty o rozmiarach elementów do 300 mikronów, a zwłaszcza widoczne są proste krawędzie. SEM został również wykorzystany do zobrazowania arkuszy w podobny sposób, odsłaniając wyraźne proste krawędzie. Ten film opisuje prosty i skuteczny protokół syntezy peptydów w postaci stałej i samoorganizacji peptydów w wodzie wodnej w nano arkusze.

Ponieważ dosłownie setki bloków konstrukcyjnych am mean są łatwo dostępne i mogą być używane w tym protokole, przestrzeń projektowa dostępna za pomocą polipeptydów jest praktycznie nieograniczona. Peptydy są obiecującymi materiałami dla badań biomedycznych i nanobiologicznych ze względu na ich syntetyczną elastyczność, wytrzymałość i uporządkowanie. W szczególności na poziomie atomowym arkusze nano służą jako potencjalna platforma dla dwuwymiarowych rusztowań wyświetlających, mimetyki membranowej, czujników biologicznych, mimetyki białek i produkcji urządzeń.

Praca z odczynnikami, takimi jak kwas triorowy, octowy i kwas bromooctowy, jest niezwykle niebezpieczna, aby zapobiec obrażeniom, wykonuj wszystkie reakcje w dygestoriach i noś odpowiednie środki ochrony osobistej.