Name: Synteza submonomerów w fazie stałej polimerów peptydowych i ich samoorganizacja w wysoce uporządkowane nanoarkusze (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Poznaj syntezę peptydów w fazie stałej metodą submonomerową i ich samoorganizację w nanoarkusze. Protokół umożliwia tworzenie sekwencyjnie zdefiniowanych polimerów o zastosowaniu w nanonauce i biomedycynie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Byoung-Chul Lee, Philip Choi oraz Samuel Ho za cenny wkład i pomoc. Praca ta została zrealizowana w Molecular Foundry w Lawrence Berkeley National Laboratory, przy wsparciu Office of Science, Office of Basic Energy Sciences Departamentu Energii USA w ramach kontraktu nr DE-AC02-05CH11231 oraz Defense Threat Reduction Agency w ramach kontraktu nr IACRO-B0845281.

<ol><li>King, D. S., Fields, C. G., Fields, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cleavage+method+which+minimizes+side+reactions+following+Fmoc+solid+phase+peptide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pept.+Pro.+Res%22%5BJournal%5D)">A cleavage method which minimizes side reactions following Fmoc solid phase peptide synthesis.</a> Int. J. Pept. Pro. Res. 36, 255-266 (1990).</li>
<li>Sanii, B., Kudirka, R., Cho, A., Venkateswaran, N., Oliver, G. K., Olson, A. M., Tran, H., Harada, R. M., Tan, L., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaken%2C+not+stirred%3A+Collapsing+a+peptoid+monolayer+to+produce+free-floating%2C+stable+nanosheets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Shaken, not stirred: Collapsing a peptoid monolayer to produce free-floating, stable nanosheets.</a> J. Am. Chem. Soc. , (2011).</li>
<li>Kudirka, R., Tran, H., Sanii, B., Nam, K. T., Choi, P. H., Venkateswaran, N., Chen, R., Whitelam, S., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+a+single-chain%2C+information-rich+polypeptoid+sequence+into+a+highly-ordered+nanosheet%5BTitle%5D)+AND+%22Bioploymers%3A+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">Folding of a single-chain, information-rich polypeptoid sequence into a highly-ordered nanosheet.</a> Bioploymers: Peptide Science. 96, 586-595 (2011).</li>
<li>Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Zuckermann, R., Pohl, N., Kirshenbaum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+multistep+synthesis+of+a+bioactive+peptidomimetic+oligomer+for+the+undergraduate+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Ed%22%5BJournal%5D)">Rapid multistep synthesis of a bioactive peptidomimetic oligomer for the undergraduate laboratory.</a> J. Chem. Ed. 87, 637-639 (2010).</li>
<li>Fowler, S. A., Blackwell, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+in+peptoids%3A+Recent+advances+toward+deciphering+the+structural+requirements+for+biological+function%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Biomol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships in peptoids: Recent advances toward deciphering the structural requirements for biological function.</a> Org. Biomol. Chem. 7, 1508-1524 (2009).</li>
<li>Zuckermann, R. N., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptoids+as+potential+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Op.+Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Peptoids as potential therapeutics.</a> Curr. Op. Mol. Ther. 11, 299-307 (2009).</li>
<li>Chongsiriwatana, N. P., Patch, J. A., Czyzewski, A. M., Dohm, M. T., Ivankin, A., Gidalevitz, D., Zuckermann, R. N., Barron, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptoids+that+mimic+the+structure%2C+function+and+mechanism+of+helical+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Peptoids that mimic the structure, function and mechanism of helical antimicrobial peptides.</a> , 105-2794 (2008).</li>
<li>Yam, A. Y., Wang, X., Gao, C., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N., Bleua, T., Halla, J., Fedynyshyn, J., Allauzen, S., Peretz, D., Salisbury, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Universal+method+for+detection+of+amyloidogenic+misfolded+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">A Universal method for detection of amyloidogenic misfolded proteins.</a> Biochem. 50, 4322-4329 (2011).</li>
<li>Huang, C. -Y., Uno, T., Murphy, J. E., Lee, S., Hamer, J. D., Escobedo, J. A., Cohen, F. E., Radhakrishnan, R., Dwarki, V., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipitoids+-+novel+cationic+lipids+for+cellular+delivery+of+plasmid+DNA+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lipitoids - novel cationic lipids for cellular delivery of plasmid DNA in vitro.</a> Chem. Biol. 5, 345-354 (1998).</li>
<li>Schroeder, T., Niemeier, N., Afonin, S., Ulrich, A. S., Krug, H. F., Bräse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptoidic+amino-+and+guanidinium-carrier+systems%3A+Targeted+drug+delivery+into+the+cell+cytosol+or+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptoidic amino- and guanidinium-carrier systems: Targeted drug delivery into the cell cytosol or the nucleus.</a> J. Med. Chem. 51, 376-379 (2008).</li>
<li>Murnen, H. K., Rosales, A. M., Jaworski, J. N., Segalman, R. A., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+self-assembly+of+a+biomimetic+diblock+copolypeptoid+into+homochiral+super+helices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Hierarchical self-assembly of a biomimetic diblock copolypeptoid into homochiral super helices.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 16112-16119 (2010).</li>
<li>Nam, K. T., Shelby, S. A., Marciel, A. B., Choi, P. H., Chen, R., Tan, L., Chu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free-floating+ultra-thin+two-dimensional+crystals+from+sequence-specific+peptoid+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Mater%22%5BJournal%5D)">Free-floating ultra-thin two-dimensional crystals from sequence-specific peptoid polymers.</a> Nature. Mater. 9, 454-460 (2010).</li>
<li>Burkoth, T. S., Beausoleil, E., Kaur, S., Tang, D., Cohen, F. E., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+synthesis+of+artificial+proteins%3A+The+Discovery+of+an+amphiphilic+helical+peptoid+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Toward the synthesis of artificial proteins: The Discovery of an amphiphilic helical peptoid assembly.</a> Chemistry & Biology. 9, 647-654 (2002).</li>
<li>Murphy, J. E., Uno, T., Hamer, J. D., Cohen, F. E., Dwarki, V., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Combinatorial+approach+to+the+discovery+of+efficient+cationic+peptoid+reagents+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A Combinatorial approach to the discovery of efficient cationic peptoid reagents for gene delivery.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 1517-1522 (1998).</li>
<li>Mora, P. uig, Masip, I. sabel, Cortés, N. uria, Marquina, R. egina, Merino, R. amón, Merino, J. esús, Carbonell, T. eresa, Mingarro, I. smael, Messeguer, A. ngel, Pérez-Payá, E. nrique <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+from+a+positional+scanning+peptoid+library+of+in+vivo+active+compounds+that+neutralize+bacterial+endotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification from a positional scanning peptoid library of in vivo active compounds that neutralize bacterial endotoxins.</a> J. Med. Chem. 48, 1265-1268 (2005).</li>
<li>Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+nanomolar+ligands+for+7-transmembrane+G-protein+coupled+receptors+from+a+diverse+%28N-substituted%29glycine+peptoid+Library%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery of nanomolar ligands for 7-transmembrane G-protein coupled receptors from a diverse (N-substituted)glycine peptoid Library.</a> J. Med. Chem. 37, 2678-2685 (1994).</li>
<li>Alluri, P., Liu, B., Yu, P., Xiao, X., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+coactivator-binding+peptoids+from+a+combinatorial+library%5BTitle%5D)+AND+%22Moleular+Biosystems%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of coactivator-binding peptoids from a combinatorial library.</a> Moleular Biosystems. 2, 568-579 (2006).</li>
<li>Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+N-%28substituted%29glycine+peptoid+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of N-(substituted)glycine peptoid libraries.</a> Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).</li>
<li>Culf, A. S., Ouellette, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+synthesis+of+N-substituted+glycine+oligomers+%28%26alpha%3B+peptoids%29+and+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Solid-phase synthesis of N-substituted glycine oligomers (&alpha; peptoids) and derivatives.</a> Molecules. 15, 5282-5335 (2010).</li>
<li>Burkoth, T. S., Fafarman, A. T., Charych, D. H., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+unprotected+heterocyclic+side+chains+into+peptoid+oligomers+via+solid-phase+submonomer+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Incorporation of unprotected heterocyclic side chains into peptoid oligomers via solid-phase submonomer synthesis.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 8841-8845 (2003).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Zastosowania i znaczenie
Niniejszy protokół opisuje prostą i wydajną metodę syntezy peptoidów oraz ich wodną samoorganizację w nanolisty. Większość laboratoriów jest w stanie bez trudności syntetyzować peptoidy, ponieważ wykorzystuje się w tym procesie niedrogie materiały, podstawową wiedzę oraz proste techniki4. Podobnie samoorganizacja ultracienkich, wysoko uporządkowanych nanolistów wymaga jedynie wielokrotnego przechylania fiolki z rozcieńczonym wodnym roztworem peptoidów2. Peptoidy są obiecującymi materiałami w badaniach biomedycznych i nanonauce, ponieważ są trwałe i elastyczne syntetycznie, a jednocześnie specyficzne dla sekwencji i wysoce konfigurowalne5. Wykazano, że peptoidy posiadają aktywność biologiczną (terapeutyczną6,7, diagnostyczną8, w dostarczaniu wewnątrzkomórkowym9-10) oraz zdolność do zwijania się w hierarchiczne nanostruktury3, 11-14. Dzięki modularnej syntezie kombinatoryczne biblioteki peptoidów15-19 mogą być łatwo syntetyzowane i przesiewane pod kątem szerokiego spektrum aktywności lub właściwości. W szczególności nanolisty służą jako potencjalna platforma dla dwuwymiarowych rusztowań ekspozycyjnych, mimetyków błon, biosensorów, mimetyków białek oraz do wytwarzania urządzeń. Ze względu na praktycznie niewyczerpaną liczbę możliwych sekwencji, obszar badań nad peptoidami szybko się rozwija.
 
Zmienne w syntezie submonomerów polypeptoidów w fazie stałej
Ze względu na możliwość wyboru z niezwykle dużego i różnorodnego alfabetu monomerów20, metoda submonomerowa wymaga okazjonalnych modyfikacji w przypadkach, gdy zwiększenie wydajności sprzęgania w każdym kroku poprawi całkowitą wydajność produktu. Wprowadzenie niechronionych heterocyklicznych łańcuchów bocznych wymaga zastosowania kwasu chlorooctowego zamiast kwasu bromooctowego21. Wydłużony czas podstawienia oraz wyższe stężenia amin są zazwyczaj stosowane po około 20 sprzęganiach w przypadku długich sekwencji peptoidowych lub amin o mniejszej nukleofilowości. Podgrzanie naczynia reakcyjnego do 35 °C, przy użyciu naczynia z płaszczem wodnym, pomaga przyspieszyć reakcję. W przypadku amin o wysokiej lotności, takich jak izopropylamina, należy zachować ostrożność, aby uniknąć ich odparowania.
Aminy w formie soli HCl, takie jak t-butylo beta-alanina HCl, muszą zostać przekształcone w wolną zasadę przed wprowadzeniem do reakcji substytucji. Można to osiągnąć poprzez rozpuszczenie lub zawieszenie aminy w DCM (˜5g aminy/25 mL DCM) i neutralizację ekvimolarnym roztworem wodnego wodorotlenku sodu w rozdzielaczu. Warstwę DCM oddziela się, a warstwę wodną przemywa dodatkowym DCM. Połączone warstwy DCM suszy się nad siarczanem sodu i filtruje do wcześniej zważonej kolby okrągłodennej. Rozpuszczalnik usuwa się za pomocą ewaporatora obrotowego, aż do uzyskania produktu w postaci oleju, a następnie zapisuje się masę produktu.
W etapie odszczepiania skład koktajlu TFA oraz czas odszczepiania zależą od liczby i rodzaju zastosowanych grup ochronnych. Wytyczne dotyczące koktajli do odszczepiania są podobne do tych stosowanych przy tradycyjnym usuwaniu grup ochronnych z peptydów1. Zazwyczaj 10-minutowa inkubacja jest wystarczająca dla sekwencji bez grup ochronnych lub sekwencji z niewielką liczbą grup ochronnych silnie labilnych w kwasach (np. BOC, trityl). W przypadku sekwencji z grupami ochronnymi trudniejszymi do usunięcia (np. ester t-butyl, Mtr, Pbf) lub sekwencji z wieloma grupami ochronnymi zaleca się dwugodzinną inkubację, aby zapewnić pełną deprotekcję każdego łańcucha. Surowe produkty peptoidowe zazwyczaj rozpuszczają się w mieszaninie acetonitryl:woda 1:1 (v/v), jednak w przypadku łańcuchów bocznych o wysokiej ogólnej hydrofobowości często stosuje się wyższe proporcje acetonitrylu.

<table><tbody><tr><td>Dimetyloformamid</td><td>EMD Millipore</td><td>EM-DX1726P-1</td><td>99+%</td></tr><tr><td>N-metylopirolidon</td><td>VWR</td><td>BDH1141-4LP</td><td>99%</td></tr><tr><td>Kwas bromooctowy</td><td>Acros Organics</td><td>200000-106</td><td>99%</td></tr><tr><td>4-metylopiperydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M73206</td><td>96%</td></tr><tr><td>N,N&amp;rsquo;-diizopropylokarbodiimid</td><td>Chem-Impex International</td><td>001100</td><td>99,5%</td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>EMD Millipore</td><td>EMD-DX0835</td><td>stopień ACS</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>EMD Millipore</td><td>EM-AX0145P-1</td><td>99,8%</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td>99%</td></tr><tr><td>Triizopropylsilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>233781-10G</td><td>Do odszczepiania TFA</td></tr><tr><td>1,2-dichlor&amp;#8211;etan</td><td>JT Baker</td><td>JTH076-33</td><td>Do sylikonizacji szklanych naczyń reakcyjnych</td></tr><tr><td>Fenetylamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>407267-100ML</td><td>&amp;gt;99,5% Amina o hydrofobowym łańcuchu bocznym</td></tr><tr><td>Boc-etylenodiamina</td><td>CNH Technologies</td><td>C-1112</td><td>Kationowa amina o łańcuchu bocznym</td></tr><tr><td>t-butyl-beta-alanina HCl</td><td>Chem-Impex International</td><td>04407</td><td>Anionowa amina o łańcuchu bocznym</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-cyjanokwas 4-hydroksycynamowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8982-10X10MG</td><td>Do matrycy MALDI</td></tr><tr><td>Nile Red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19123-10MG</td><td>Do obrazowania fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Dichlorodimetylosilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>80430-500G-F</td><td>Do sylikonizacji szklanych naczyń reakcyjnych</td></tr><tr><td>Jednorazowy wkład z frity PP</td><td>Applied Separations</td><td>2416</td><td>Wkład polipropylenowy 6 mL z frity PE 20 mm</td></tr><tr><td>Jednorazowy adapter Luer 3-drożny</td><td>Cole-Parmer</td><td>31200-80</td><td>Kurek do jednorazowego naczynia do manualnej syntezy</td></tr><tr><td>Pierścień Luer Lock</td><td>Cole-Parmer</td><td>45503-19</td><td>Złączka 1/4&quot;&amp;#157; do jednorazowego naczynia do manualnej syntezy</td></tr><tr><td>Złączki Luer</td><td>Cole-Parmer</td><td>45500-20</td><td>Złączka 1/4&quot;&amp;#157; do jednorazowego naczynia do manualnej syntezy</td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety PP</td><td>VWR international</td><td>16001-194</td><td>Do przenoszenia TFA</td></tr><tr><td>Plastikowa strzykawka Luer lock</td><td>National Scientific</td><td>S7515-5</td><td>Strzykawki 6 mL</td></tr><tr><td>Szklana fiolka 1 dram</td><td>VWR international</td><td>66011-041</td><td>Z fenomenową formowaną zakrętką z wkładką z pulpy polwinylowej</td></tr><tr><td>Fiolka scyntylacyjna 20 mL</td><td>VWR international</td><td>66022-060</td><td>Z dołączoną zakrętką PP i wkładką z folii pulpy</td></tr><tr><td>Przestawka adhezyjna Secure-Seal</td><td>Invitrogen</td><td>S-24736</td><td>Do obrazowania fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Szkiełka przedmiotowe</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63411</td><td>Do obrazowania fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Szkiełko zakrywkowe</td><td>VWR international</td><td>48366-067</td><td>Do obrazowania fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Wafel krzemowy 4&amp;#8221;</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>16007</td><td>Wstępnie pocięty na chipy 5x7 mm</td></tr><tr><td>Filtr 0,45</td><td>VWR international</td><td>28143-924</td><td>Do HPLC. &lt;br/&gt;Membrana PTFE</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>BD Biosciences</td><td>212272</td><td>Do obrazowania fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Kolektor próżniowy SPE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57044</td><td>Przykład kolektora próżniowego SPE</td></tr><tr><td>Naczynie z frity szklanej</td><td>Ace glass</td><td>6402-12</td><td>Frity o porowatości C</td></tr><tr><td>Oczyszczacz/Sterylizator plazmowy</td><td>Harrick Scientific Products, Inc.</td><td>PDC-32G</td><td>Przykład oczyszczacza plazmowego do przygotowania chipów krzemowych do SEM</td></tr></tbody></table>

synteza peptoidów metodą submonomerową w fazie stałej oraz ich samoorganizacja w wysoko uporządkowane nanoarkusze

Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets

Peptoidy to nowa klasa biomimetycznych, nienaturalnych, sekwencyjnie specyficznych heteropolimerów, które wykazują odporność na proteolizę, posiadają silną aktywność biologiczną i zwijają się w nanostruktury wyższego rzędu. Peptoidy, strukturalnie podobne do peptydów, są poliglicynami N-podstawionymi, w których łańcuchy boczne są przyłączone do azotu, a nie do węgla alfa. Łatwość ich syntezy oraz różnorodność strukturalna umożliwiają testowanie podstawowych zasad projektowania w celu opracowania de novo i inżynierii nowych materiałów nanostrukturalnych i biologicznie aktywnych.
W niniejszym materiale przedstawiono prosty protokół ręcznej syntezy peptoidów, który umożliwia otrzymywanie długołańcuchowych polypeptoidów (do 50merów) z doskonałą wydajnością. Wymagane jest jedynie podstawowe wyposażenie, proste techniki (np. przenoszenie cieczy, filtracja) oraz komercyjnie dostępne odczynniki, co czyni peptoidy przystępnym uzupełnieniem instrumentarium wielu badaczy. Szkielet peptoidu jest budowany po jednym monomerze przy użyciu metody submonomerowej, która składa się z dwuetapowego cyklu dodawania monomeru: acylacji i substytucji. Najpierw kwas bromooctowy, aktywowany in situ za pomocą N,N'-diizopropylokarbodiimidu, acyluje aminę drugorzędową związaną z żywicą. Następnie następuje nukleofilowe wyparcie bromku przez aminę pierwszorzędową w celu wprowadzenia łańcucha bocznego. Dwuetapowy cykl jest powtarzany do momentu uzyskania pożądanej długości łańcucha. Wydajność sprzęgania w tym dwuetapowym cyklu rutynowo przekracza 98% i umożliwia syntezę peptoidów o długości do 50 reszt. Metoda submonomerowa pozwala na uzyskanie wysoce dostrajalnych, precyzyjnych i chemicznie zróżnicowanych sekwencji, ponieważ bezpośrednio można w nich włączyć setki łatwo dostępnych amin pierwszorzędowych.
 
Peptoidy stają się wszechstronnym materiałem biomimetycznym w badaniach z zakresu nanobionauki ze względu na ich elastyczność syntetyczną, trwałość oraz uporządkowanie na poziomie atomowym. Niedawno wykazano możliwość fałdowania jednowątkowego, amfifilowego i bogatego w informacje polypeptoidu w wysoce uporządkowaną nanowarstwę. Peptoid ten jest 36-merem składającym się z zaledwie trzech różnych, dostępnych komercyjnie monomerów: hydrofobowego, kationowego i anionowego. Hydrofobowe łańcuchy boczne fenyloetylowe są ukryte w rdzeniu nanowarstwy, natomiast jonowe łańcuchy boczne aminowe i karboksylowe ustawiają się na powierzchniach hydrofilowych. Nanowarstwy peptoidowe służą jako potencjalna platforma dla mimetyków błon, mimetyków białek, produkcji urządzeń oraz sensorów. Opisane metody syntezy peptoidów, tworzenia warstw oraz obrazowania mikroskopowego stanowią prostą metodę umożliwiającą przyszłe projektowanie nanowarstw peptoidowych.

Opisano prostą i ogólną metodę manualnej syntezy peptoidów z wykorzystaniem podstawowego sprzętu i dostępnych komercyjnie odczynników, co umożliwia łatwą syntezę peptoidów w większości laboratoriów. Opisano syntezę, oczyszczanie i charakterystykę amfifilowego peptoidu 36-meru, a także jego samoorganizację w wysoko uporządkowane nanoarkusze.

Synteza peptoidów metodą submonomerową w fazie stałej oraz ich samoorganizacja w wysoko uporządkowane nanoarkusze

Peptoidy to nowa klasa biomimetycznych, nienaturalnych heteropolimerów o określonej sekwencji, które są odporne na proteolizę, wykazują silną aktywność biologiczną oraz...

Ogólnym celem tej procedury jest opisanie prostej i wydajnej metody syntezy peptydów w fazie stałej oraz wodnego samoorganizowania się peptydów w wysoko uporządkowane nanoarkusze. Peptydy, strukturalnie podobne do polipeptydów, są polimerami podstawionej glicyny, w których łańcuchy boczne są przyłączone do azotu, a nie do węgla alfa. Proces rozpoczyna się od syntezy specyficznej sekwencji peptydowej metodą podmonomerową.Metoda submonomerowa składa się z dwóch prostych etapów chemicznych, które wprowadzają każdy monomer do łańcucha sekwencyjnie. Najpierw aminę przyłączoną do nośnika stałego poddaje się bromoacetylacji. Następnie bromek zostaje zastąpiony aminą pierwszorzędową.Kroki te są powtarzane do momentu uzyskania pożądanej długości łańcucha. Po wydłużeniu łańcucha peptyd jest odczepiany od nośnika stałego, a otrzymany surowy olej peptydowy jest oczyszczany za pomocą HPLC i charakteryzowany, aby zainicjować samoorganizację peptydów w nanoarkusze. W szklanej probówce przygotowuje się rozcieńczony wodny roztwór buforowy peptydu i delikatnie go miesza. Jako ostatni krok.Nanoarkusze są badane pod mikroskopem. Wyniki wykazują, że iteracyjny cykl dwóch prostych etapów chemicznych może prowadzić do otrzymania polimeru o specyficznej sekwencji, który spontanicznie samoorganizuje się w nanoarkusze. Peptydy stanowią nową klasę polimerów bioinspirowanych, których właściwości plasują się pomiędzy właściwościami białek a tradycyjnych polimerów.Są one wytrzymałe i wszechstronne syntetycznie, podobnie jak tradycyjne polimery, a jednocześnie wysoce konfigurowalne i specyficzne pod względem sekwencji, jak białka i DNA. Peptydy wyłaniają się jako zaawansowany materiał pozwalający rozwiązać kluczowe problemy w biomedycynie i inżynierii materiałowej, takie jak identyfikacja leków bioaktywnych czy projektowanie sztucznych białek. Główne zalety peptydów obejmują precyzyjną kontrolę sekwencji, dostępność niezwykle zróżnicowanych bloków budulcowych, wydajną syntezę oraz stabilność wobec proteaz. Opisano ogólną metodę manualnej syntezy peptydów z wykorzystaniem podstawowego sprzętu i komercyjnie dostępnych odczynników, co umożliwia łatwą syntezę peptydów w większości laboratoriów.Wizualna demonstracja etapów syntezy jest kluczowa i stanowi cenny punkt odniesienia dla osób rozpoczynających pracę w dziedzinie syntezy na fazie stałej. Po raz pierwszy opisano tutaj oczyszczanie i charakteryzację amfipatycznego peptydu o długości 36 merów, a także jego samoorganizację w wysoko uporządkowane nanoarkusze. Rozpocznij ten protokół od przygotowania aparatury doświadczalnej zgodnie z opisem w protokole pisemnym.W celu zapewnienia przejrzystości poniższe kroki zostaną wykonane w szklanym naczyniu reakcyjnym zamiast w jednorazowym polipropylenowym wkładzie z fritą. Po umieszczeniu 100 mg żywicy R-amid w naczyniu reakcyjnym z fritą, należy napęcznieć żywicę, dodając dwa mililitry dimetyluformamidu lub DMF, a następnie mieszać poprzez przepuszczanie pęcherzyków gazu przez 10 minut. Następnie należy odessać roztwór za pomocą próżni, aby wyizolować napęczniałą żywicę.Następnie dodaj jeden mililitr 20% pełnej metylopirydyny w DMF, aby usunąć grupę ochronną FM O. Mieszaj przez dwie minuty, a następnie zlej płyn. Powtarzaj ten proces przez 12 minut, po czym przepłucz żywicę, dodając dwa mililitry DMF, mieszając przez 15 sekund i zlewając płyn.Rozpocznij wzrost łańcucha peptydowego od pierwszego cyklu submonomeru, który obejmuje etap bromoacetylacji oraz etap wypierania. W celu przeprowadzenia bromoacetylacji dodaj jeden mililitr 0,6 M kwasu bromooctowego w DMF oraz 86 µL diizopropylokarbodiimidu. Po wytrząsaniu przez 30 minut odlej zawartość i przemyj dno dwoma mililitrami DMF.Następnie przeprowadź proces przemieszczenia, dodając 1 ml aminy o stężeniu od 1 do 2 M w N-metylo-2-pyrolidonie i inkubując przez 30 do 120 minut; po inkubacji odlej ciecz i wypłucz 2 ml DMF. Kontynuuj wydłużanie łańcucha peptydowego poprzez powtarzanie cyklu submonomeru. Po wykonaniu ostatniego przemieszczenia wypłucz 2 ml DMF.Następnie nałóż zakrętkę do płukania metanem diora i przechowuj naczynie reakcyjne do momentu odszczepienia. Aby rozpocząć proces odszczepiania, przenieś całą wysuszoną żywicę do 20 mililitrowej szklanej fiolki scyntylacyjnej; pracując w dygestorium i stosując odpowiednie środki ochrony osobistej, dodaj do fiolki scyntylacyjnej cztery mililitry kwasu trifluorooctowego lub koktajlu do odszczepiania TFA i zakręć. Mieszać intensywnie od 10 minut do dwóch godzin w temperaturze pokojowej.Alternatywnie można użyć wytrząsarki rotacyjnej do wymieszania roztworu. Roztwór z etapu odszczepiania TFA należy zebrać, filtrując żywicę przez jednorazowy polipropylenowy wkład z fritym do nowej, wcześniej zważonej 20 mililitrowej szklanej fiolki scyntylacyjnej. Następnie należy dodać jeden mililitr świeżego koktajlu do odszczepiania, aby wypłukać żywicę i zebrać pozostały peptyd.Powtórz tę czynność, płucząc dwukrotnie. Odparuj TFA, kierując delikatny strumień azotu lub używając ewaporatora Biot Charge V 10. Rozpuść otrzymany surowy olej w sześciu mililitrach roztworu acetonitrylu i wody w stosunku 1:1.Następnie zamrozić i liofilizować próbkę. Proces ten należy powtórzyć raz jeszcze po drugiej liofilizacji. Odnotować masę produktu surowego i przechowywać go w postaci suchego proszku w temperaturze -20 °C, analizując za pomocą analitycznego HPLC w fazie odwróconej oraz/lub LCMS z jonizacją elektrospray.Czystość surowego produktu oraz obecność pożądanej masy cząsteczkowej można określić, postępując zgodnie z procedurami opisanymi w tekście. Surową mieszaninę peptydów można następnie oczyścić za pomocą preparatywnej HPLC w fazie odwróconej zgodnie z opisaną procedurą. Niniejsza sekcja opisuje protokół tworzenia arkuszy z amfifilnego peptydu o długości 36 reszt, o specyficznej sekwencji jednowaściegowej.Po syntezie, oczyszczeniu i liofilizacji nici peptydowej, otrzymany biały proszek rozpuszcza się w DMSO w celu przygotowania 2 mM roztworu zapasu. Następnie należy przygotować 20 µM roztwór peptydowy zgodnie z plikiem Dr.Glass. W pierwszej kolejności dodać 445 µL wody Milli-Q oraz 50 µL 10x buforu do formowania arkuszy.Wymieszaj zawartość probówki za pomocą vortexa. Następnie dodaj 5 µL roztworu zapasu peptydu o stężeniu 2 mM i delikatnie wymieszaj. Powstałe arkusze roztworu formują się poprzez łagodne wytrząsanie rozcieńczonego wodnego roztworu peptydu.Powolne przechylanie zakręconej szklanej fiolki z pozycji poziomej do pionowej. Powoduje to łagodne wstrząsanie arkuszami, co również prowadzi do ich powstania. Jednakże w przypadku wielu wysokiej jakości arkuszy mają one tendencję do bycia mniejszymi i posiadania mniejszej liczby prostych krawędzi.Powoli obracaj szklane fiolki wokół osi poziomej przez jeden dzień, używając rotatora do probówek lub dostosowanej kołysarki, w celu barwienia nanoarkuszy fluorescencyjnie; dodaj 1 µL Nile red o stężeniu 100 µM do 100 µL roztworu nanoarkuszy, aby uzyskać końcowe stężenie 1 µM Nile red. Nile red jest barwnikiem wrażliwym na środowisko, którego intensywność fluorescencji wzrasta po zlokalizowaniu w środowisku hydrofobowym. Następnie przygotuj 1% roztwór agarozy w gorącej wodzie i wlej go do plastikowej szalki Petriego.Upewnij się, że roztwór aros ma grubość około 1/8 cala i pozwól roztworowi ostygnąć bez zakłóceń na płaskiej powierzchni. Po zastygnięciu aros użyj szpatułki, aby wyciąć kwadraty o wymiarach 1 cm na 1 cm. Następnie przenieś wycięte kwadraty na szkiełko przedmiotowe, aby zgromadzić arkusze w tej samej płaszczyźnie; nanieś 1 µL roztworu arkusza na kawałek aros.Po dwóch minutach aros powinien wchłonąć bufor, pozostawiając arkusze na powierzchni. Obrazowanie arkusza należy przeprowadzić w ciągu 15 minut. Alternatywnie, aby obrazować arkusze i roztwór, należy nanieść 15 µL do uszczelki o średnicy 20 mm i grubości 0,12 mm na szkiełku przedmiotowym.Przykryj próbkę szkiełkiem nakrywką i wykonaj obrazowanie w ciągu kilku dni, aby przeprowadzić SEM nanoruwek. Najpierw poddaj płytki krzemowe trawieniu plazmowemu, aby wspomóc adsorpcję nanoruwek. Następnie nanieś 20 µL roztworu nanoruwek peptydowych na podłoże krzemowe potraktowane plazmą i pozostaw roztwór na trzy minuty; usuń nadmiar roztworu końcówką chusteczki Kimwipe, nanieś 20 µL wody na powierzchnię i ponownie odsącz nadmiar roztworu, aby usunąć bufor i sole.Alternatywnie, roztwory arkuszy peptydowych poddaje się dializie przeciwko wodzie w celu usunięcia buforu i soli. W takim przypadku 20 µL zdializowanego roztworu arkusza można nanieść na podłoża krzemowe potraktowane plazmą i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Po wyschnięciu roztworu arkusza na podłożach krzemowych potraktowanych plazmą, arkusz można obrazować za pomocą SEM, wykorzystując detektor wewnątrzsoczewkowy (in lens) przy energiach wiązki od 1 kV do 5 kV.Przeprowadzono syntezę, charakterystykę i oczyszczanie sekwencyjnego 36 me peptydu blokowo-naładowanego, który składa się w wysoce uporządkowaną dwuwymiarową nanoarkusz. Aminy wykorzystane do syntezy 36 me peptydu blokowo-naładowanego to etylenodiamina, fenetyloamina oraz t-butyl beta-alanina. Po syntezie surowy peptyd oddzielono od żywicy za pomocą 95% wodnego TFA.Po zebraniu i odparowaniu roztworu TFA, surowy peptyd blokowy 36 me poddano oczyszczaniu za pomocą HPLC w fazie odwróconej. Masę oczyszczonego peptydu blokowego potwierdzono następnie za pomocą spektrometrii mas.Obserwowana masa 4981,2 jest zbliżona do masy obliczonej wynoszącej 4981,74. Liofilizowany proszek rozpuszczono w DMSO w celu przygotowania 2 mM roztworu zapasu, który przechowywano w temperaturze 4 °C. Arkusze przygotowano zgodnie z wyżej wspomnianym protokołem i zobrazowano za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii optycznej.Obserwowano różnorodne kształty o rozmiarach cech sięgających do 300 mikronów, przy czym szczególnie widoczne były proste krawędzie. Do obrazowania arkuszy wykorzystano również SEM, co w podobny sposób ujawniło wyraźne proste krawędzie. Niniejszy film opisuje prosty i wydajny protokół syntezy peptydów na podłożu stałym oraz wodną samoorganizację peptydów w nanosheets.Ponieważ dostępne są setki bloków budulcowych o średniej długości am, które można wykorzystać w tym protokole, przestrzeń projektowa dostępna dla polipeptydów jest praktycznie nieograniczona. Peptydy stanowią obiecujące materiały w badaniach z zakresu biomedycyny i nanonauki ze względu na swoją syntetyczną elastyczność, odporność oraz uporządkowanie. W szczególności na poziomie atomowym nanoarkusze mogą służyć jako potencjalna platforma dla dwuwymiarowych rusztowań ekspozycyjnych, mimetyków błon, biosensorów, mimetyków białek oraz do wytwarzania urządzeń.Praca z odczynnikami żrącymi, takimi jak trior, kwas octowy i kwas bromooctowy, jest niezwykle niebezpieczna; aby zapobiec obrażeniom, wszystkie reakcje należy przeprowadzać w dygestorium, stosując odpowiednie środki ochrony indywidualnej.

solid-phase-submonomer-synthesis-peptoid-polymers-their-self-assembly

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Fazowa synteza submonomerów polimerów peptydowych i ich samouzbrajanie w wysoce uporządkowane nanoarkusze

Ten artykuł opisuje przygotowanie dobrze uporządkowanych nanopianek niklowych poprzez bezprądowe osadzanie metalu na nanoporowatych szablonach uzyskanych z samodzielnie składających się supramolekuł na bazie kopolimeru diblokowego.

Żyroidalne nanostruktury niklowe z supramolekuł kopolimeru dibloku

Ten artykuł opisuje tworzenie wysoce uporządkowanych struktur opartych na peptydach poprzez spontaniczny proces samoorganizacji. Metoda wykorzystuje dostępne na rynku peptydy i powszechnie stosowany sprzęt laboratoryjny. Technika ta może być stosowana do wielu różnych peptydów i może prowadzić do odkrycia nowych zespołów opartych na peptydach.

Tworzenie uporządkowanych struktur biomolekularnych przez samoorganizację krótkich peptydów

Raportujemy protokoły "polimeryzacji" różnych typów nanocząsteczek metalowych w kapsułkach polimerowych w długie łańcuchy "homo-" i "kopolimerów".

Wykorzystanie nanocząstek metali pokrytych blokiem polistyrenu (kwas akrylowy) jako monomerów do ich homo- i kopolimeryzacji

Tutaj prezentujemy protokół do przygotowania i wizualizacji struktur drugorzędnych (np. włókien, architektur toroidalnych i nanosfer) pochodzących z polikarmidów spiralnych. Wykazano, że morfologia charakteryzująca się zarówno mikroskopią sił atomowych (AFM), jak i skaningową mikroskopią elektronową (SEM) zależy od struktury molekularnej, stężenia i wybranego rozpuszczalnika.

Samoorganizujące się morfologie otrzymane z helikalnych kopolimerów polikarbodimidu i ich pochodnych triazolowych

Opisany jest protokół ręcznej syntezy oligo-peptoidów, po którym następuje analiza sekwencji za pomocą spektrometrii mas.

Synteza i analiza oligo-peptoidów za pomocą spektrometrii mas

Synteza amfifilów peptydowych na bazie poliaminy (PPA) jest znaczącym wyzwaniem ze względu na obecność wielu azotów aminowych, co wymaga rozsądnego użycia grup ochronnych w celu zamaskowania tych reaktywnych funkcji. W tym artykule opisujemy łatwą metodę otrzymywania tych nowych klas cząsteczek samoorganizujących się.

Łatwy protokół syntezy samoorganizujących się amfifilów peptydowych na bazie poliaminy (PPA) i pokrewnych biomateriałów

Protokół syntezy peptydu modyfikowanego 1,2-ditiolanem i charakterystyka struktur supramolekularnych wynikających z samoorganizacji peptydu.

Synteza i charakterystyka samoorganizujących się peptydów modyfikowanych 1,2-ditiolanem

Samoorganizacja sterowana krystalizacją (CDSA) wykazuje unikalną zdolność do wytwarzania cylindrycznych nanostruktur o wąskich rozkładach długości. Wykazano organokatalizowaną polimeryzację ε-kaprolaktonu z otwarciem pierścienia oraz późniejsze wydłużenia łańcuchów metakrylanu metylu i N,N-dimetyloakrylamidu. Przedstawiono żywy protokół CDSA, który wytwarza cylindry monodyspersyjne o długości do 500 nm.

Synteza monodyspersyjnych cylindrycznych nanocząstek poprzez samoorganizację biodegradowalnych kopolimerów blokowych sterowaną krystalizacją

Przedstawiono protokół do syntezy kodowanych informacyjnie oligomerów peptoidowych oraz do sekwencyjnego samoorganizowania tych peptoidów w drabinki molekularne przy użyciu amin i aldehydów jako dynamicznych par kowalencyjnych reagentów oraz kwaśnych triflatów metali ziem rzadkich Lewisa jako odczynników wielozadaniowych.

Synteza peptydów niosących informacje i ich sekwencyjna dynamiczna samoorganizacja kowalencyjna

Ten artykuł zawiera protokoły projektowania i samoorganizacji nanostruktur z oligomerów kwasu nukleinowego modyfikowanych gamma peptydów w mieszaninach rozpuszczalników organicznych.

Samoorganizacja peptydowych kwasów nukleinowych modyfikowanych promieniami gamma w złożone nanostruktury w mieszaninach rozpuszczalników organicznych

Protokół syntezy i charakterystyki samoorganizujących się monowarstw szkieletu metaloorganicznego jest dostarczany przy użyciu szczepionych polimerami, kryształów metaloorganicznych (MOF). Procedura pokazuje, że cząstki MOF szczepione polimerem mogą być samoorganizujące się na granicy faz powietrze-woda, co skutkuje dobrze uformowanymi, wolnostojącymi, jednowarstwowymi strukturami, czego dowodem jest obrazowanie za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.

Synteza i charakterystyka samoorganizujących się monowarstw metaloorganicznych z wykorzystaniem cząstek pokrytych polimerem

Poznaj syntezę peptydów w fazie stałej metodą submonomerową i ich samoorganizację w nanoarkusze. Protokół umożliwia tworzenie sekwencyjnie zdefiniowanych polimerów o zastosowaniu w nanonauce i biomedycynie.

Synteza peptoidów metodą submonomerową w fazie stałej oraz ich samoorganizacja w wysoko uporządkowane nanoarkusze

Przeglądaj więcej filmów