Name: Łatwy protokół syntezy samoorganizujących się amfifilów peptydowych na bazie poliaminy (PPA) i pokrewnych biomateriałów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Poznaj protokół syntezy samoorganizujących się amfifilów peptydowych na bazie poliamin z niechronionymi blokami chemicznymi. Ta metoda upraszcza tworzenie hybrydowych amfifilów peptydowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ten projekt został sfinansowany przez Centrum Medyczne Uniwersytetu Nebraska (fundusze na start, MC-S); NIH-COBRE, 5P20GM103480 (T. Bronich) i Amerykańskie Towarzystwo Chemiczne, PRF # 57434-DNI7(MC-S).

1. Ogólny protokół syntezy umów PPA
<ol>
	<li>Oblicz skalę syntezy (zwykle mmol). Skala ta opiera się na masie docelowej kwoty PPA. Należy pamiętać, że wydajność reakcji SPPS stopniowo spada wraz ze wzrostem sekwencji aminokwasów. Dlatego dokładna wydajność reakcji jest trudna do obliczenia.</li>
	<li>Oblicz masę żywicy, która ma być użyta, w zależności od obciążenia żywicy. Obciążenie znajduje się na pojemniku lub w protokole analizy żywicy i jest wyrażone w mmol/g. Do obliczenia masy żywicy można użyć następującego wzoru:</li>
	<li>Ostrożnie odważ żywicę chlorku 2-chlorotrytylu (w naszym przypadku obciążenie wynosi ~0,85 mmol)</li>
	<li>Umieść żywicę w spiekanym naczyniu do syntezy o następujących specyfikacjach: Pojemność – 50 ml, Smażony krążek – 25 mm, Porowatość – Średnia.</li>
	<li>Dodać 15 ml dichlorometanu (DCM) do żywicy.</li>
	<li>Umieścić naczynie syntezy na mechanicznej wytrząsarce o zmiennej prędkości (wytrząsarka kolb/mieszadło) i obrócić naczynia pod kątem 45° (lub poziomo), aby zmaksymalizować mieszanie.</li>
	<li>Pozwól kulkom żywicy pęcznieć przez 15 minut. Pęcznienie zwiększa wydajność reakcji, ponieważ ułatwia dyfuzję molekularną i dostęp do miejsca aktywnego, zwiększając wydajność sprzężenia.</li>
	<li>Dodaj 8 odpowiedników (2 mmol w skali 0,25 mmol) żądanej poliaminy (sperminy, spermidyny, dietyelenetriaminy, 1,3-diaminopropanu itp.) do żywicy i pozwól jej reagować przez 5 godzin 
	Uwaga: Krótszy okres reakcji zmniejszyłby wydajność.</li>
	<li>Wykonaj test Kaisera (patrz Tabela materiałów), aby potwierdzić pomyślne sprzężenie poliaminy z żywicą. Pomyślne sprzężenie amin pierwszorzędowych daje fioletowo-niebieski kolor, który odpowiada wolnej aminie.</li>
	<li>Chronić pierwszorzędową grupę aminową za pomocą 4 równoważników 1-(4,4-dimetylo-2,6-dioksocykloheks-1-ylideno)etylu (Dde), rozpuszczonych w bezwodnym metanolu (15 ml), wytrząsając mieszaninę reakcyjną przez noc11. 
	Uwaga: Krótszy czas reakcji zmniejsza wydajność.</li>
	<li>Wykonaj test Kaisera. Brak niebieskiego koloru na koraliku żywicy potwierdza skuteczną ochronę. W przypadku nieskutecznej ochrony aminy pierwszorzędowej należy powtórzyć poprzedni krok.</li>
	<li>Opróżnij DCM i dwukrotnie umyj żywice mieszaniną DCM i DMF (2:1, 15 ml).</li>
	<li>Rozpuścić 20 równoważników (5 mmol) di-tert butylu (Boc) w DCM (20 ml) i pozostawić reakcję do przebiegu przez 3 godziny.</li>
	<li>Wykonaj test chloranilu (patrz Tabela materiałów), aby potwierdzić pełną ochronę aminy drugorzędowej. Pozytywny wynik testu (ochrony) daje bezbarwny lub jasnożółty kolor. Wolne aminy drugorzędowe dają kolor ciemnozielony/niebieski, podczas gdy aminy pierwszorzędowe dają kolor czerwony.</li>
	<li>Odcedzić mieszaninę rozpuszczalnika i przemyć dwukrotnie mieszaniną DCM i DMF (2:1, 15 ml).</li>
	<li>Dodaj 2% roztwór hydrazyny do DMF (10 ml) i wstrząsaj przez 1 godzinę.</li>
	<li>Wykonaj test Kaisera, aby potwierdzić udaną deprotekcję aminy pierwszorzędowej.</li>
	<li>Dodaj pożądane aminokwasy w odwrotnej kolejności, w jakiej byś je napisał/narysował. Peptydy są pobierane od końców N do końców C, ale są syntetyzowane w przeciwnym kierunku, od C do N. Na przykład, w przypadku PPA wymagającego następującego rdzenia peptydowego -GLFD-, dodaj kwas asparaginowy (D), a następnie fenyloalaninę (F), leucynę (L), a na końcu glicynę (G). 
	UWAGA: W przypadku większości aminokwasów następujący koktajl sprzęgający jest odpowiedni do przyłączenia do żywic zawierających poliaminę.
	<ol>
		<li>Zmieszać 4 równoważniki (1 mmol) aminokwasu chronionego przez Fmoc, 3,95 równoważników 2-(1H-benzotriazol-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametylofluorofosforanu (HBTU) i 15 równoważników diizopropyloetyloaminy (DIPEA).</li>
		<li>Rozpuść je w mieszaninie DCM i DMF (1:1, 15 ml) i poddaj sonikacji koktajlu przez 2 minuty (aż do całkowitego rozpuszczenia).</li>
		<li>Odczekaj dodatkowe 3-5 minut, aby zapewnić aktywację kwasu karboksylowego na aminokwasie.</li>
		<li>Dodać mieszaninę reakcyjną do naczynia. Reakcję przeprowadzać przez 2-4 godziny w temperaturze otoczenia. 
		UWAGA: Znaleźliśmy następujące skuteczne alternatywy dla HBTU (zwykle wymagające mniejszej ilości aminokwasów i czynnika sprzęgającego): COMU, PyBOP, HATU, DIC/Oxima.</li>
		<li>Wykonaj test Kaisera, aby potwierdzić udane sprzężenie.</li>
		<li>Odchroń grupę Fmoc przed aminokwasem, dodając 20% roztwór 4-metylopipiperydyny (10 ml) do DMF. Zrób to dwukrotnie, za każdym razem potrząsając mieszaniną reakcyjną przez 15 min. 
		UWAGA: Skuteczną alternatywą dla usuwania Fmoc jest piperazyna/DBU12.
		<ol>
			<li>Wykonaj płukanie DCM (15 ml) między dodawaniami.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wykonaj test Kaisera, aby potwierdzić pomyślną deprotekcję aminokwasu.</li>
		<li>Dokładnie umyj żywicę, aby usunąć wszelkie ślady 4-metylu. Żywicę należy przemyć dwukrotnie DMF (10 ml), przy czym każde pranie trwa 5 minut, a na koniec DCM (10 ml) przez 10 minut.</li>
		<li>Dodaj wszystkie pozostałe aminokwasy, kolejno powtarzając kroki sprzęgania i usuwania ochrony.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Na koniec, po sprzężeniu wszystkich wymaganych aminokwasów, sprzęgnij ogon hydrofobowy z ostatnim aminokwasem konstruktu poliaminowo-peptydowego:
	<ol>
		<li>Dodać 10 równoważników pożądanej funkcyjności kwasu karboksylowego do 9,5 równoważników HBTU i 12 równoważników DIPEA rozpuszczonych w mieszaninie DCM i DMF (1:1, 20 ml). 
		Uwaga: Należy pamiętać, że niektóre ogonki mogą wymagać innej proporcji rozpuszczalnika (zwykle większego % DCM) lub dodatku lub innego rozpuszczalnika, takiego jak N-metylopirolidon (NMP).</li>
		<li>Sonikuj koktajl przez 5-10 minut, aż do rozpuszczenia (widzieliśmy, że całkowite rozpuszczenie ogona trwa dłużej) i dodaj do naczynia. 
		Uwaga: W przypadku ogonów zawierających wiele miejsc reaktywnych, będą one musiały być chronione przed ich sprzężeniem.</li>
		<li>Przeprowadzaj tę reakcję (sprzęganie hydrofobowego ogona) przez co najmniej 5 godzin, chociaż zaleca się przeprowadzenie jej przez noc, aby uzyskać najwyższą wydajność.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Rozszczepienie PPA z solidnego wsparcia
Celem tego kroku jest rozszczepienie PPA z żywicy i usunięcie grup ochronnych Boc z aminokwasów i reszt poliaminowych.
<ol>
	<li>Przemyj żywicę DMF (8 ml przez 2 min) i dwukrotnie DCM (8 ml, za każdym razem przez 5 min). Przed każdym dodaniem należy spuścić rozpuszczalnik z naczynia. Po wykonaniu ostatniego prania wysusz żywicę w próżni przez 15 minut.</li>
	<li>Przygotować roztwór do rozszczepienia, stosując mieszaninę w następujących proporcjach: 28:1:1 kwas trifluorooctowy (TFA):H2O: Triizopropylosilan (TIPS). Aby przygotować 15 ml koktajlu rozszczepienia, dodaj 14 ml TFA do 0,5 ml H2O i 0,5 ml TIPS.</li>
	<li>Dodaj ten roztwór do rozszczepienia do żywicy i wstrząsaj przez 2-4 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zebrać roztwór do kolby okrągłodennej o pojemności 25 lub 50 ml.</li>
	<li>Zagęścić TFA w próżni do 1–2 ml za pomocą wyparki obrotowej pod zmniejszonym ciśnieniem, ogrzewając mieszaninę w temperaturze 40 °C (nie przekraczać 55 °C, aby uniknąć rozkładu PPA).</li>
	<li>Po odparowaniu dodać otrzymany roztwór TFA (kroplami) do kolby okrągłodennej zawierającej bezwodny zimny eter (15 ml). Spowoduje to natychmiastowe zawarcie umowy PPA.</li>
	<li>Ponadto dodać bezwodny zimny eter (5 ml) do oryginalnej kolby, w której zagęszczono tłuszcz tłuszczowy.</li>
	<li>Sonikować tę kolbę w celu odzyskania dodatkowych ciał stałych i połączyć z roztworem eteru z kroku 2.6. 
	Uwaga: Pipetę transferową można umyć niewielką ilością DCM. Unikaj wprowadzania DMF podczas procesu, ponieważ ma on tendencję do tworzenia substancji podobnej do żelu.</li>
	<li>Umieść kolbę (pod przykryciem) w lodówce i odstaw na noc, aby zmaksymalizować opady.</li>
	<li>Zebrać wytrącony materiał przez filtrację próżniową za pomocą spiekanego lejka filtra tarczowego. Idealne rozmiary porów to drobne lub średnie.</li>
	<li>Przemyć osad dwukrotnie zimnym eterem (5–10 ml) w celu usunięcia wszelkich pozostałości substancji organicznych.</li>
</ol>
3. Identyfikacja produktu surowego przy użyciu metody suszonej kropli MALDI
<ol>
	<li>Przygotowanie matrycy do analizy w trybie pozytywnym:
	<ol>
		<li>Aby rozpocząć analizę masy cząsteczkowej za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI), dodaj 10 do 20 mg kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego do probówki mikrowirówkowej.</li>
		<li>Dodać roztwór wody/acetonitrylu (1:1, 1,0 ml) z 0,1% kwasem trifluorooctowym (TFA). Dokładnie wymieszać przez wirowanie. 
		Uwaga: Ta matryca powinna być używana dla peptydów naładowanych dodatnio. Tryb ujemny MALDI jest podobny, ale wymaga matrycy zawierającej 9-aminoakrydynę z 0,1% amoniaku jako dodatek rozpuszczalnika.</li>
		<li>Dodać 1–2 μl próbki do płytki celowniczej ze stali nierdzewnej dla MALDI i wysuszyć próbkę na powietrzu. Dodać 1–2 μl matrycy i ponownie wysuszyć. 
		Uwaga: Tabliczki mają okrągłe oznaczenia w siatce wzdłuż tarczy docelowej, aby pomóc zlokalizować konkretne miejsce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeanalizuj próbki w instrumencie MALDI, aby zweryfikować ich tożsamość. Jonizacja elektronrozpylacyjna (ESI) jest ważną alternatywą w celu potwierdzenia tożsamości umów PPA.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie PPA za pomocą preparatywnego oczyszczania wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC)
<ol>
	<li>Rozpuść osad PPA w minimalnej ilości acetonitrylu i wody.
	<ol>
		<li>Z reguły rozpuść 100 mg suchego surowego PPA w mniej niż 5 ml acetonitrylu i wody. Bardziej hydrofobowe umowy PPA mogą wymagać większego procentu acetonitrylu do rozpuszczenia, a także mogą wymagać większej objętości rozpuszczalnika w ogóle, w zależności od ładunku netto umów PPA (tabela 1).</li>
		<li>Jeśli całkowite rozpuszczenie nie nastąpi, dodać 1% TFA (ACN lubH2O). Możliwe jest również dodanie śladowych ilości innych kompatybilnych rozpuszczalników, w tym dimetylosulfotlenku, metanolu lub izopropanolu (ogranicz ich zawartość do 5%).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>rozpuszczalnik</td>
			<td colspan="2">Dodatnio naładowane PPA</td>
			<td colspan="2">Ujemnie naładowane umowy PPA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">0.1% TFA w wodzie</td>
			<td colspan="2">0,1% NH3 w wodzie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">0.1% TFA w ACN</td>
			<td colspan="2">0.1% NH3 w ACN</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Systemy rozpuszczalnikowe. Proponowany system rozpuszczalnikowy dla dodatnio i ujemnie naładowanych PPA.
<ol start="2">
	<li>Sonikować PPA za pomocą sonikatora klaksonowego przez 20 minut przy 10 impulsach s z Amp1 48% lub przez 2-3 godziny w kąpieli ultradźwiękowej.</li>
	<li>Następnie przefiltruj za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 μm, a następnie przefiltruj za pomocą filtra strzykawkowego z politetrafluoroetylenu (PTFE) 0,20 μm. Roztwór PPA powinien być przejrzysty i wolny od wszelkich cząstek stałych.
	<ol>
		<li>Jeśli filtracja jest zbyt trudna, należy poddać się sonizacji przez dłuższy czas. Zdecydowanie zaleca się, aby roztwór PPA został oczyszczony natychmiast po filtracji strzykawki, ponieważ długotrwałe przechowywanie może spowodować jego agregację lub żelację, co będzie wymagało ponownej sonikacji i być może ponownej filtracji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podczas i po oczyszczaniu należy używać rozpuszczalników klasy HPLC lub takich, które są filtrowane przez filtr/membranę strzykawkową 0,25 μm. 
	UWAGA: Najczęstszymi warunkami rozpuszczalnika do oczyszczania PPA jest gradientH2Oi ACN.</li>
	<li>Do tego protokołu należy użyć standardowego przyrządu HPLC z odwróconymi fazami. Powinien zawierać programator gradientu elucji, binarny system dostarczania rozpuszczalnika, detektor UV zdolny do wykrywania przy 220 i 254 nm oraz programowalny kolektor frakcji. Maksymalne natężenie przepływu powinno wynosić 50 ml/min.</li>
	<li>Do separacji należy użyć kolumny C-18 z odwróconymi fazami. Kolumny o następujących wymiarach mogą być stosowane w zależności od masy oczyszczanego ciała stałego i ładunku netto PPA (tabela 2).</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Opłata PPA</td>
			<td>Wielkość cząstek</td>
			<td>Rozmiar kolumny</td>
			<td>Masa surowego PPA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+ ve naładowany</td>
			<td>5 μm</td>
			<td>Wymiary: 150 x 30 mm</td>
			<td>170 mg tabletki powlekania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- ve Naładowany</td>
			<td>5 μm</td>
			<td>Wymiary: 150 x 30 mm</td>
			<td>170 mg tabletki powlekania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+ ve naładowany</td>
			<td>5 μm</td>
			<td>Wymiary: 150 x 21,2 mm</td>
			<td>90 mg tabletki powlekania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- ve Naładowany</td>
			<td>5 μm</td>
			<td>Wymiary: 150 x 21,2 mm</td>
			<td>90 mg tabletki powlekania</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Sugerowane kolumny: Wymiary kolumny, rozmiary cząstek i maksymalna nośność na wtrysk dla kolumn HPLC z odwróconą fazą C18
<ol start="7">
	<li>Wstrzyknąć PPA o objętości określonej zarówno przez pojemność kolumny, jak i przez objętość pętli iniekcyjnej HPLC. Uruchomić metodę gradientu HPLC zgodnie z ustawieniami przedstawionymi w tabeli 3 (czas elucji 40 min).</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Godzina</td>
			<td>Rozpuszczalnik A (acetonitryl)</td>
			<td>Rozpuszczalnik B (woda)</td>
			<td>Natężenie przepływu (ml/min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>5 proc.</td>
			<td>95%</td>
			<td rowspan="5">Natężenie przepływu zależy od upakowania kolumny i jej rozmiaru.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyfra arabska</td>
			<td>5 proc.</td>
			<td>95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35</td> Rozdział
			<td>95%</td>
			<td>5 proc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>38 Rozdział 38</td>
			<td>W 100%</td>
			<td>0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozdział 40</td>
			<td>5 proc.</td>
			<td>95%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Sugerowany gradient fazy odwrotnej: Sugerowany gradient fazy odwrotnej pokazujący względny skład wody w porównaniu z acetonitrylem w danym okresie czasu. Natężenie przepływu będzie zależeć od specyfikacji kolumny.
<ol start="8">
	<li>Przeanalizuj frakcje zebrane na różnych probówkach za pomocą MALDI i określ, która probówka (lub probówki) zawiera PPA. Ocenia się to, badając masę cząsteczkową znajdującą się w każdej probówce.
	<ol>
		<li>Sprawdzić czystość frakcji za pomocą analitycznej HPLC. Użyj systemu gradientu HPLC wyposażonego w detektor UV ustawiony na 220 nm.</li>
		<li>Jeśli występują zanieczyszczenia, wykonaj dodatkowy cykl oczyszczania za pomocą HPLC. Powyższy gradient używany do preparatywnej HPLC można przeskalować w dół do użycia z analityczną HPLC za pomocą oprogramowania online do konwertera kolumn. Każda frakcja musi mieć czystość ≥95% do charakterystyki fizycznej lub oceny biologicznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zebrać frakcje do dużej kolby okrągłodennej lub kolby do odparowywania i usunąć cały acetonitryl i większość wody. Końcowy roztwór PPA nie powinien przekraczać 10 ml.</li>
	<li>Przenieść ten koncentrat do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Należy pamiętać, że umowy PPA są substancjami podobnymi do detergentów; W ten sposób podczas odparowania rozpuszczalnika powstaną pęcherzyki. Odkryliśmy, że dodatek alkoholu etylowego zmniejsza tworzenie się pęcherzyków.</li>
	<li>Zagęścić koncentrat próżniowo. Podczas parowania próżniowego duża ilość PPA może przylegać do ścianek pojemnika. Odzyskać to, wielokrotnie przepłukując ściankę kolby wodą z HPLC. Łączna objętość stężonego PPA i płukanki nie powinna przekraczać 30 ml.</li>
	<li>Umieść roztwór wodny w probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Błyskawiczne zamrożenie tego roztworu PPA w ciekłym azocie: 
	UWAGA: Błyskawiczne zamrażanie powoduje powstawanie mniejszych kryształków lodu, które szybciej sublimują w liofilizatorze. Co więcej, wolniejsze zamrażanie może pozwolić na tworzenie się samoorganizujących się struktur supramolekularnych. Inną alternatywą (ale mniej pożądaną) jest stopniowe zamrażanie w zamrażarce o temperaturze -80 °C lub zamrażanie za pomocą mieszanki suchego lodu + acetonu
	<ol>
		<li>Przed umieszczeniem probówki wirówkowej w liofilizatorze należy przeperforować lub poluzować nakrętkę probówki, aby wilgoć mogła uciec z próbki i zebrać się w urządzeniu chłodniczym. Ustaw jednostkę liofilizacyjną na -54 °C i 0,016 mbar. 
		UWAGA: Inną opcją jest zdjęcie nasadki i umieszczenie chusteczki (z gumką) na wierzchu otworu. Odkryliśmy również, że zamrażanie próbek pod kątem lub rozbijanie lodu na małe porcje pozwala na szybszą i lepszą liofilizację dzięki zwiększeniu powierzchni.</li>
		<li>Jeśli ciało stałe zacznie się topić, może to oznaczać, że obecne są śladowe ilości rozpuszczalnika organicznego (zwykle acetonitrylu). Powtórz etap zamrażania i oceń stan liofilizacji.</li>
		<li>Jeśli topnienie będzie się utrzymywać, istnieją dwa potencjalne rozwiązania:
		<ol>
			<li>Podzielić próbkę na dwie porcje (umieścić w probówkach), rozcieńczyć wodą i ponownie zamrozić. Nie używaj tego roztworu często, ponieważ duże ilości rozpuszczalników organicznych mogą uszkodzić sprzęt.</li>
			<li>Alternatywnie, umieścić próbkę w kolbie i dalej odparować rozpuszczalnik organiczny w próżni. Liofilizacja próbki, która jest w postaci płynnej, zwykle prowadzi do uderzenia i utraty związku PPA.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przechowywanie umów PPA
<ol>
	<li>Przechowuj PPA w temperaturze -20 °C z nakrętkami dokręconymi i uszczelnionymi Parafilmem na tubie z odpowiednią etykietą.</li>
	<li>Przed użyciem doprowadź PPA z powrotem do temperatury otoczenia w komorze próżniowej, aby uniknąć kondensacji pary wodnej na PPA.</li>
</ol>

<ol><li>Cui, H., Pashuck, E. T., Velichko, Y. S., Weigand, S. J., Cheetham, A. G., Newcomb, C. J., Stupp, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+and+x-ray-triggered+crystallization+at+long+range+in+self-assembling+filament+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spontaneous and x-ray-triggered crystallization at long range in self-assembling filament networks.</a> Science. 327, 555-559 (2010).</li>
<li>Pashuck, E. T., Cui, H., Stupp, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+supramolecular+rigidity+of+peptide+fibers+through+molecular+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Tuning supramolecular rigidity of peptide fibers through molecular structure.</a> Journal of the American Chemical Society. 132, 6041-6046 (2010).</li>
<li>Stupp, S. I., Zha, R. H., Palmer, L. C., Cui, H., Bitton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+biomolecular+soft+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discussions%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of biomolecular soft matter.</a> Faraday Discussions. 166, 9-30 (2013).</li>
<li>Conda-Sheridan, M., Lee, S. S., Preslar, A. T., Stupp, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esterase-activated+release+of+naproxen+from+supramolecular+nanofibres%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Esterase-activated release of naproxen from supramolecular nanofibres.</a> Chemical Communications. 50, 13757-13760 (2014).</li>
<li>Mata, A., Palmer, L., Tejeda-Montes, E., Stupp, S. I. Design of biomolecules for nanoengineered biomaterials for regenerative medicine. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMata%2C+A+%22Nanotechnology+in+Regenerative+Medicine%22">Nanotechnology in Regenerative Medicine</a>. , Springer. 39-49 (2012).</li>
<li>Samad, M. B., Chhonker, Y. S., Contreras, J. I., McCarthy, A., McClanahan, M. M., Murry, D. J., Conda-Sheridan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+Polyamine-Based+Peptide+Amphiphiles+with+Tunable+Morphology+and+Physicochemical+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+bioscience%22%5BJournal%5D)">Developing Polyamine-Based Peptide Amphiphiles with Tunable Morphology and Physicochemical Properties.</a> Macromolecular bioscience. 17, (2017).</li>
<li>Nel, A. E., Mädler, L., Velegol, D., Xia, T., Hoek, E. M., Somasundaran, P., Klaessig, F., Castranova, V., Thompson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+biophysicochemical+interactions+at+the+nano-bio+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Understanding biophysicochemical interactions at the nano-bio interface.</a> Nature Materials. 8, 543(2009).</li>
<li>Gujrati, M., Malamas, A., Shin, T., Jin, E., Sun, Y., Lu, Z. -R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+cationic+lipid-based+nanoparticles+facilitate+endosomal+escape+and+reduction-triggered+cytosolic+siRNA+release%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Multifunctional cationic lipid-based nanoparticles facilitate endosomal escape and reduction-triggered cytosolic siRNA release.</a> Molecular Pharmaceutics. 11, 2734-2744 (2014).</li>
<li>Zhu, Y., Li, J., Kanvinde, S., Lin, Z., Hazeldine, S., Singh, R. K., Oupický, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-immolative+polycations+as+gene+delivery+vectors+and+prodrugs+targeting+polyamine+metabolism+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Self-immolative polycations as gene delivery vectors and prodrugs targeting polyamine metabolism in cancer.</a> Molecular Pharmaceutics. 12, 332-341 (2014).</li>
<li>Planas-Portell, J., Gallart, M., Tiburcio, A. F., Altabella, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper-containing+amine+oxidases+contribute+to+terminal+polyamine+oxidation+in+peroxisomes+and+apoplast+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Copper-containing amine oxidases contribute to terminal polyamine oxidation in peroxisomes and apoplast of Arabidopsis thaliana.</a> BMC Plant Biology. 13, 109(2013).</li>
<li>Nash, I. A., Bycroft, B. W., Chan, W. C. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0040403996003449">Dde - A selective primary amine protecting group: A facile solid phase synthetic approach to polyamine conjugates.</a> Tetrahedron Letters. 37, 2625-2628 (1996).</li>
<li>Ralhan, K., KrishnaKumar, V. G., Gupta, S. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2015/ra/c5ra23441g">Piperazine and DBU: a safer alternative for rapid and efficient Fmoc deprotection in solid phase peptide synthesis.</a> RSC Advances. 5, 104417-104425 (2015).</li>
<li>Casero, R. A. Jr, Marton, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+polyamine+metabolism+and+function+in+cancer+and+other+hyperproliferative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Targeting polyamine metabolism and function in cancer and other hyperproliferative diseases.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6, 373(2007).</li>
<li>Wuts, P. G. M., Greene, T. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWuts%2C+PGM+%22Protection+for+the+Amino+Group.+In+Greene%27s+Protective+Groups+in+Organic+Synthesis%22">Protection for the Amino Group. In Greene's Protective Groups in Organic Synthesis</a>. , John Wiley &, Sons, Inc. 696-926 (2006).</li>
<li>Palasek, S. A., Cox, Z. J., Collins, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+racemization+and+aspartimide+formation+in+microwave-enhanced+Fmoc+solid+phase+peptide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis.</a> Journal of Peptide Science. 13, 143-148 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów

Opisane tutaj protokoły mogą być wykorzystywane do syntezy PPA, a także PA i powiązanych cząsteczek na bazie peptydów (takich jak hybrydowe peptoidy PA). Chociaż synteza peptydów za pomocą SPPS jest prostą procedurą, synteza peptydów zawierających biologiczne cząsteczki naprowadzające może być szczególnie trudna. Poliaminy, takie jak spermina, spermidyna, dietylelenetriamina itp., mogą funkcjonować jako cząsteczki naprowadzające do celowania w komórki rakowe13. Umowy PPA mogą samoorganizo...

Samozgrupujące się amfifile peptydowe (PAs) to klasa biomateriałów składających się zazwyczaj z następujących segmentów: (a) głowy hydrofilowej, (b) regionu łącznika oraz (c) ogona hydrofobowego. Większość PAs opisanych w literaturze posiada głowę hydrofilową złożoną z naładowanych lub polarnych reszt aminokwasowych1,2,3,4. PAs znalazły szerokie zastosowanie w biomedycynie, w tym w dostarczaniu leków, diagnostyce chorób, medycynie regeneracyjnej itp.5. W zależności od sekwencji aminokwasowej PAs mogą tworzyć szeroką gamę nanostruktur, w tym micelle sferyczne oraz nanofilamenty. Niedawno opisaliśmy klasę hybrydowych amfifili peptydowych na bazie poliamin, nazwanych PPAs6. Stwierdzono, że morfologia, kinetyka samozgrupowania oraz degradacja metaboliczna tych biomateriałów są związane z ich solubilizującą grupą głowy. Ponadto nanostruktury PPA nie wykazały toksyczności wobec komórek ssaków (linie komórkowe MiaPaCa2 i HeLa) w przetestowanych stężeniach. Nanonośniki oparte na PPA są atrakcyjnymi wehikułami do dostarczania leków, ponieważ: (1) wykazano zwiększone pobieranie i metabolizm poliamin w komórkach nowotworowych, (2) kationowe nanostruktury mogą uciekać z endosomów7,8, co prowadzi do dłuższego krążenia i czasu przebywania wewnątrz komórki, oraz (3) powinny one posiadać odmienny profil metaboliczny w porównaniu z PA; na przykład będą bardziej stabilne wobec proteaz występujących w ludzkim organizmie (choć mogą być wrażliwe na inne enzymy, takie jak oksydazy aminowe)9,10. Ustalono również, że PPAs wykazują zróżnicowaną morfologię, właściwości fizykochemiczne, sztywność nanocząstek oraz kinetykę agregacji w zależności od długości i ładunku pojedynczej cząsteczki PPA6. W niniejszej pracy opisujemy szczegółowy protokół syntezy, identyfikacji i oczyszczania PPAs, który może zostać zastosowany również do przygotowania PAs lub podobnych hybrydowych cząsteczek peptydowych.
Ponieważ poliaminy nie są powszechnie dostępne w handlu w formach chronionych, a ochrona amin pierwszo- i drugorzędowych poliamin jest kluczowa dla ich sprzęgania z aminokwasami i innymi cząsteczkami, opisaliśmy etapy syntetyczne prowadzące do ich ochrony. Ogólnym celem niniejszego protokołu jest przedstawienie prostej metody sprzęgania poliamin z aminokwasami. Poliaminy nie posiadają grupy karboksylowej, przez co nie mogą być sprzęgane z żywicami Rink Amide lub Wang. Zamiast tego w protokole syntetycznym zaleca się stosowanie żywic takich jak chlorek 2-chlorotrytylu. Głównym wyzwaniem w syntezie PPA jest obecność grup funkcyjnych amin pierwszo- i drugorzędowych. Na potrzeby naszych badań chroniliśmy wszystkie aminy drugorzędowe w poliaminie, pozostawiając wolną grupę aminową pierwszorzędową w poliaminie, aby umożliwić reakcję sprzęgania. Reakcję przeprowadzono na nośniku stałym zgodnie z zasadami syntezy peptydów w fazie stałej (SPPS), aby ułatwić oczyszczanie po każdym etapie sprzęgania i deprotekcji. Poniższy protokół dotyczy zarówno manualnej, jak i automatycznej syntezy PPA (choć weryfikacja niektórych etapów w systemie automatycznym będzie utrudniona). Syntezę tych cząsteczek można przeprowadzić również na automatycznym syntezatorze lub przy użyciu reaktora mikrofalowego (automatycznego lub półautomatycznego). Schemat reakcji został przedstawiony na Rysunku 1.
<img alt="Schemat syntezy peptydów; struktury chemiczne; etapy syntezy z odczynnikami; struktury poliamin." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57908/57908fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: (A) Ogólny schemat reakcji syntezy PPA. (B) Reprezentatywne poliaminy, które mogą być wykorzystane do syntezy PPA opisanych w niniejszej pracy. <a href="/files/ftp_upload/57908/57908fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Żywica chlorku 2-chlorotrytylu&nbsp;</td>Naczynie do syntezy <td>AappTec</td><td>RTZ001</td><td></td></tr><tr><td>SynthwareTM&nbsp;</td><td>Aldrich</td><td>SYNP120050M</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Acros</td><td>AC406920250</td><td>Fisher Sci. Katalog #</td></tr><tr><td>Wytrząsarka do nadgarstków</td><td>Boekel Scientific</td><td>401000-2</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw testowy</td><td>Kaisera Sigma-Aldrich</td><td>60017</td><td></td></tr><tr><td>2-[(4,4-dimetylo-2,6-dioksocykloheks-1-ylideno)etylo-amino]-etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CDS004772</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodny metanol</td><td>Acros</td><td>AC610981000</td><td>Fisher Sci. Katalog #</td></tr><tr><td>Zestaw testowy chloranilu</td><td>TCI</td><td>TCC1771-KIT</td><td>Katalog VWR #</td></tr><tr><td>Di-tert di-butyl&nbsp;</td><td>Acros</td><td>AC194670250</td><td>Fisher Sci. Katalog #</td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1160-4</td><td></td></tr><tr><td>Hydrazine</td><td>Acros</td><td>AC296815000</td><td>FIster Sci. Katalog #</td></tr><tr><td>(2-(1H-benzotriazol-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametylouronium heksafluorofosforan)</td><td>p3biosystems</td><td>31001</td><td></td></tr><tr><td>4-metylopirydyna&nbsp;</td><td>Acros</td><td>AC127515000</td><td>Katalog naukowy #</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>AappTec</td><td>CXZ035</td><td></td></tr><tr><td>Triisopropyl Silane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>233781</td><td></td></tr><tr><td>Ether</td><td>Fisher Scientific</td><td>E138-1</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-cyjano-4-hydroksycynamonowy kwas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8982</td><td></td></tr><tr><td>9-aminoakrydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92817</td><td></td></tr><tr><td>Marka rybacka&nbsp; Filtry strzykawkowe: Membrana PTFE</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-730-21</td><td></td></tr></tbody></table>

Łatwy protokół syntezy samoorganizujących się amfifilów peptydowych na bazie poliaminy (ppa) i pokrewnych biomateriałów

Facile Protocol for the Synthesis of Self-assembling Polyamine-based Peptide Amphiphiles (PPAs) and Related Biomaterials

Amfifile peptydowe na bazie poliaminy (PPA) to nowa klasa samoorganizujących się amfifilowych biomateriałów związanych z amfifilami peptydowymi (PA). Tradycyjne PA posiadają naładowane aminokwasy w postaci grup rozpuszczających (lizyna, arginina), które są bezpośrednio połączone z segmentem lipidowym lub mogą zawierać region łącznikowy zbudowany z obojętnych aminokwasów. Dostrojenie sekwencji peptydowej PA może dać różne morfologie. Podobnie PPA posiadają segment hydrofobowy i aminokwasy obojętne, ale zawierają również cząsteczki poliaminy w postaci grup rozpuszczalnych w wodzie (hydrofilowych). Podobnie jak w przypadku PA, PPA mogą również samoorganizować się w różne morfologie, w tym małe pręciki, skręcone nanowstążki i stopione nano-arkusze, po rozpuszczeniu w wodzie. Jednak obecność zarówno amin pierwszorzędowych, jak i drugorzędowych w pojedynczej cząsteczce poliaminy stanowi poważne wyzwanie podczas syntezy PPA. W tym artykule przedstawiono prosty protokół, oparty na precedensach literaturowych, w celu osiągnięcia łatwej syntezy PPA przy użyciu syntezy peptydów w fazie stałej (SPPS). Protokół ten można rozszerzyć na syntezę PA i innych podobnych systemów. Ilustrujemy również kroki, które są potrzebne do rozszczepienia z żywicy, identyfikacji i oczyszczenia.

Po syntezie i oczyszczaniu, a przed oceną fizykochemiczną lub biologiczną, zaleca się ponowne sprawdzenie masy PPA oraz ustalenie czystości za pomocą analitycznego HPLC. Do charakterystyki materiału lub oceny biologicznej PPA muszą posiadać czystość &gt;95%. Rysunek 2 przedstawia chromatogram HPLC (góra) oraz widma MALDI (dół), potwierdzające obecność produktu. Analityczne systemy HPLC obliczą pole pod krzywą (AUC), a AUC &gt;95% można odnieść do czystości pr...

Synteza amfifilów peptydowych na bazie poliaminy (PPA) jest znaczącym wyzwaniem ze względu na obecność wielu azotów aminowych, co wymaga rozsądnego użycia grup ochronnych w celu zamaskowania tych reaktywnych funkcji. W tym artykule opisujemy łatwą metodę otrzymywania tych nowych klas cząsteczek samoorganizujących się.

Łatwy protokół syntezy samoorganizujących się amfifilów peptydowych na bazie poliaminy (PPA) i pokrewnych biomateriałów

Polyamine-based Peptide Amphiphiles (PPAs) are a new class of self-assembling amphiphilic biomaterials-related to the peptide amphiphiles (PAs). ...

Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące sposobu dekorowania amfifilów peptydowych poliaminami oraz stosowania ośmiokątnych grup ochronnych Główną zaletą tej techniki jest to, że można generować amfifile peptydowe hybrydowe z niezabezpieczonymi chemicznymi blokami budulcowymi zawierającymi wiele reaktywnych stron. Procedurę zademonstrują Mehdi, Nathalia i Krishnaiah, studenci laboratorium z Laboratorium Conda Sheridan. Najpierw ostrożnie odważ żywicę chlorku 2-chlorotrytylu, umieść żywicę w spiekanym, średnio porowackim naczyniu do syntezy o pojemności 50 mililitrów.Następnie przymocuj naczynie synetezy do mechanicznej wytrząsarki o zmiennej prędkości i obróć naczynie pod kątem 45 stopni, aby zmaksymalizować mieszanie. Następnie dodaj 15 mililitrów DCM do żywicy. Po pozostawieniu kulek żywicy na pęcznienie przez 15 minut, dodaj do żywicy osiem odpowiedników pożądanego poliaminy i pozwól jej reagować przez pięć godzin.Po pięciu godzinach wykonaj test kajzera, aby potwierdzić pomyślną reakcję poliaminy z żywicą. Następnie należy chronić pierwszorzędową grupę aminową, dodając cztery równoważniki DDE do bezwodnego metanolu i wstrząsając mieszaniną reakcyjną przez noc.

facile-protocol-for-synthesis-self-assembling-polyamine-based-peptide

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Opisano prostą i ogólną metodę manualnej syntezy peptoidów z wykorzystaniem podstawowego sprzętu i dostępnych komercyjnie odczynników, co umożliwia łatwą syntezę peptoidów w większości laboratoriów. Opisano syntezę, oczyszczanie i charakterystykę amfifilowego peptoidu 36-meru, a także jego samoorganizację w wysoko uporządkowane nanoarkusze.

Synteza peptoidów metodą submonomerową w fazie stałej oraz ich samoorganizacja w wysoko uporządkowane nanoarkusze

Ten artykuł opisuje tworzenie wysoce uporządkowanych struktur opartych na peptydach poprzez spontaniczny proces samoorganizacji. Metoda wykorzystuje dostępne na rynku peptydy i powszechnie stosowany sprzęt laboratoryjny. Technika ta może być stosowana do wielu różnych peptydów i może prowadzić do odkrycia nowych zespołów opartych na peptydach.

Tworzenie uporządkowanych struktur biomolekularnych przez samoorganizację krótkich peptydów

Prezentujemy nowy hydrożel poliakrylamidowy, zwany hydroksy-PAAm, który umożliwia bezpośrednie wiązanie białek ECM przy minimalnych kosztach i specjalistycznej wiedzy. Połączenie hydrożeli hydroksy-PAAm z nadrukiem mikrokontaktowym ułatwia niezależną kontrolę wielu sygnałów naturalnego mikrośrodowiska komórkowego w celu badania mechanostransdukcji komórkowej.

Przygotowanie hydrożeli hydroksy-PAAm do rozprzęgania efektów sygnałów mechanotransdukcji

Synteza i charakterystyka trzeciorzędowej biblioteki amidów peptydów

Przedstawiono protokół syntezy peptoidów o mieszanej funkcjonalności kationowej w tej samej sekwencji (monomery typu lizyny i argininy). Opisano również późniejsze testy tych związków przeciwko Leishmania mexicana, pasożytniczym pierwotniakom wywołującym leiszmaniozę skórną.

Skuteczna metoda syntezy peptoidów z monomerami typu mieszanego lizyny/argininy i oceny ich aktywności przeciwleiszmanicznej

Raportujemy protokoły syntezy i oczyszczania oligomerów peptydowych kwasów nukleinowych (PNA) zawierających zmodyfikowane pozostałości. Opisano biochemiczne i biofizyczne metody charakterystyki rozpoznawania dupleksów RNA przez zmodyfikowane PNA.

Specyficzne dla sekwencji i selektywne rozpoznawanie dwuniciowych RNA na jednoniciowych RNA za pomocą chemicznie modyfikowanych peptydowych kwasów nukleinowych

Protokół syntezy peptydu modyfikowanego 1,2-ditiolanem i charakterystyka struktur supramolekularnych wynikających z samoorganizacji peptydu.

Synteza i charakterystyka samoorganizujących się peptydów modyfikowanych 1,2-ditiolanem

Ten protokół opisuje skuteczną metodę syntezy nanoemulsji koniugatu kwasów oleinowych i platyny(II) stabilizowanego tripeptydem lizyna-tyrozyna-fenyloalanina (KYF). Nanoemulsja powstaje w łagodnych warunkach syntetycznych poprzez samoorganizację KYF i koniugatu.

Stabilizowana tripeptydem nanoemulsja kwasu oleinowego

Przedstawiono protokół do syntezy kodowanych informacyjnie oligomerów peptoidowych oraz do sekwencyjnego samoorganizowania tych peptoidów w drabinki molekularne przy użyciu amin i aldehydów jako dynamicznych par kowalencyjnych reagentów oraz kwaśnych triflatów metali ziem rzadkich Lewisa jako odczynników wielozadaniowych.

Synteza peptydów niosących informacje i ich sekwencyjna dynamiczna samoorganizacja kowalencyjna

Ten artykuł zawiera protokoły projektowania i samoorganizacji nanostruktur z oligomerów kwasu nukleinowego modyfikowanych gamma peptydów w mieszaninach rozpuszczalników organicznych.

Samoorganizacja peptydowych kwasów nukleinowych modyfikowanych promieniami gamma w złożone nanostruktury w mieszaninach rozpuszczalników organicznych

Ten protokół przedstawia trzy szybkie i proste metody przygotowania, które wykorzystują warunki środowiskowe do wywołania samoorganizacji peptydów w hydrożele. Dodatkowo opisano charakterystykę hydrożeli peptydowych, wykazując, że w tych prostych warunkach mogą powstawać mechanicznie stabilne hydrożele peptydowe.

Przygotowanie stabilnych mechanicznie samoorganizujących się hydrożeli peptydowych

Poznaj protokół syntezy samoorganizujących się amfifilów peptydowych na bazie poliamin z niechronionymi blokami chemicznymi. Ta metoda upraszcza tworzenie hybrydowych amfifilów peptydowych.

Łatwy protokół syntezy samoorganizujących się amfifilów peptydowych na bazie poliaminy (PPA) i pokrewnych biomateriałów

Przeglądaj więcej filmów