Łatwy protokół syntezy samoorganizujących się amfifilów peptydowych na bazie poliaminy (PPA) i pokrewnych biomateriałów

Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące sposobu dekorowania amfifilów peptydowych poliaminami oraz stosowania ośmiokątnych grup ochronnych Główną zaletą tej techniki jest to, że można generować amfifile peptydowe hybrydowe z niezabezpieczonymi chemicznymi blokami budulcowymi zawierającymi wiele reaktywnych stron. Procedurę zademonstrują Mehdi, Nathalia i Krishnaiah, studenci laboratorium z Laboratorium Conda Sheridan. Najpierw ostrożnie odważ żywicę chlorku 2-chlorotrytylu, umieść żywicę w spiekanym, średnio porowackim naczyniu do syntezy o pojemności 50 mililitrów.

Następnie przymocuj naczynie synetezy do mechanicznej wytrząsarki o zmiennej prędkości i obróć naczynie pod kątem 45 stopni, aby zmaksymalizować mieszanie. Następnie dodaj 15 mililitrów DCM do żywicy. Po pozostawieniu kulek żywicy na pęcznienie przez 15 minut, dodaj do żywicy osiem odpowiedników pożądanego poliaminy i pozwól jej reagować przez pięć godzin.

Po pięciu godzinach wykonaj test kajzera, aby potwierdzić pomyślną reakcję poliaminy z żywicą. Następnie należy chronić pierwszorzędową grupę aminową, dodając cztery równoważniki DDE do bezwodnego metanolu i wstrząsając mieszaniną reakcyjną przez noc. Następnego dnia wykonaj test kajzerki, aby potwierdzić skuteczną ochronę przez brak niebieskiego koloru na kulce żywicy.

Następnie odcedź DCM i umyj żywicę dwukrotnie mieszanką DCM i DMF w proporcji dwa do jednego. Teraz dodaj 20 odpowiedników bezwodnika Boc w DCM do żywicy i pozwól reakcji postępować przez trzy godziny. Po wykonaniu testu chloranilu w celu potwierdzenia ochrony aminy drugorzędowej, należy opróżnić mieszaninę rozpuszczalników i dwukrotnie przemyć żywicę mieszaniną DCM i DMF w proporcji dwa do jednego.

Następnie dodaj 10 mililitrów 2% roztworu hydrazyny w DMF do żywicy. Po potrząsaniu przez godzinę wykonaj test kajzera, aby potwierdzić udaną deprotekcję pierwszorzędowej aminy. Następnie wymieszaj cztery odpowiedniki aminokwasu chronionego Fmoc, 3,95 ekwiwalentu HBTU i 15 odpowiedników DIPEA.

Dodaj mieszaninę jeden do jednego DCM i DMF i sonikuj koktajl aż do całkowitego rozpuszczenia. Upewnij się, że aminokwas, środek sprzęgający i DIPEA są naprawdę wymieszane i aktywowane przed dodaniem mieszaniny do żywicy. Po odczekaniu od trzech do pięciu minut, aby zapewnić aktywację kwasu karboksylowego, dodaj mieszaninę reakcyjną do naczynia zawierającego żywicę i pozwól reakcji postępować przez dwie do czterech godzin w temperaturze otoczenia.

Na każdym kroku wykonuj test kajzera lub chloranilu, aby potwierdzić pomyślne sprzężenie. Po wykonaniu testu kajzera w celu potwierdzenia udanego sprzężenia, zdechroń grupę Fmoc przed aminokwasem, dodając 10 mililitrów 20% roztworu 4-metylopirydyny w DMF. Po zakończeniu reakcji wykonaj test kajzera, aby potwierdzić skuteczną deprotekcję aminokwasu.

Następnie umyj żywicę dwukrotnie 10 mililitrami DMF przy każdym praniu trwającym 5 minut, a na koniec 10 mililitrami DCM przez 10 minut. Po sprzężeniu wszystkich wymaganych aminokwasów, sprzęgnij ogon hydrofobowy z ostatnim aminokwasem, dodając 10 równoważników pożądanej funkcjonalności kwasu karboksylowego do 9,5 równoważników HBTU i 12 równoważników DIPEA. Sonikuj koktajl aż do całkowitego rozpuszczenia, a następnie dodaj koktajl do naczynia.

Przeprowadzaj reakcję przez co najmniej pięć godzin, chociaż zaleca się przeprowadzenie jej przez noc, aby uzyskać najwyższą wydajność. Myj żywicę ośmioma mililitrami DMF przez dwie minuty i dwukrotnie ośmioma mililitrami DCM przez pięć minut. Przed każdym dodaniem należy spuścić rozpuszczalnik z naczynia.

Po wykonaniu ostatniego prania wysusz żywicę pod próżnią przez 15 minut. Aby przygotować 15 mililitrów koktajlu z dekoltem, dodaj 14 mililitrów TFA do 0,5 mililitra wody i 0,5 mililitra triizopropylosilianu. Dodaj ten koktajl łupliwy do żywicy i wstrząsaj przez dwie do czterech godzin w temperaturze pokojowej.

Po zakończeniu reakcji rozszczepienia zebrać roztwór do 50-mililitrowej kolby okrągłodennej. Następnie zagęścić TFA w próżni do jednego do dwóch mililitrów za pomocą wyparki obrotowej pod zmniejszonym ciśnieniem, podgrzewając mieszaninę do 40 stopni Celsjusza Po odparowaniu dodać otrzymany roztwór TFA, kroplami, do kolby okrągłodennej zawierającej 15 mililitrów bezwodnego zimnego eteru w celu wytrącenia PPA. Następnie dodać 5 mililitrów bezwodnego zimnego eteru do oryginalnej kolby zawierającej stężony roztwór TFA.

Sonikacja w celu odzyskania dodatkowych ciał stałych. Następnie połącz z roztworem eteru z poprzedniego kroku. Przykryj kolbę i umieść ją na noc w lodówce, aby zmaksymalizować opady.

Następnego dnia zebrać wytrącony materiał przez filtrację próżniową za pomocą drobnego lub średniego lejka z centralnym filtrem talerzowym. Na koniec przemyj osad dwukrotnie pięcioma do dziesięciu mililitrami zimnego eteru, aby usunąć wszelkie pozostałości substancji organicznych. Ślad HPLC i widmo MALDI potwierdzają obecność produktu PPA, który powinien mieć czystość większą niż 95% do charakterystyki materiału lub oceny biologicznej.

W śladzie HPLC na bazie UV obserwuje się pojedynczy ostry pik, a widmo MALDI odpowiada obliczonej masie cząsteczkowej PPA w granicach plus minus jednego daltona. Samoorganizacja PPA może być wizualizowana i analizowana za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej, mikroskopii sił atomowych, rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem, skaningowej mikroskopii elektronowej i dynamicznego rozpraszania światła. Udana samoorganizacja zaowocuje dobrze zdefiniowanymi nanostrukturami, zarówno w transmisyjnej mikroskopii elektronowej, jak i mikroskopii sił atomowych.

Po opanowaniu tego protokołu można go wykonać w ciągu trzech dni, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o oczyszczeniu produktów i ocenie ich czystości przed kolejnymi badaniami. Po tej procedurze można przygotować inne cząsteczki, takie jak amfifile peptydowe, peptydy i hybrydy peptydowo-poliaminowe.

Po opracowaniu, technika ta pomaga w badaniach w dziedzinie amfifilów peptydowych do samoorganizacji w celu zbadania wpływu nanostruktur poliaminowych w obszarach takich jak dostarczanie leków, obrazowanie lub kataliza Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić syntezę amfifilów peptydowych na bazie poliaminy i pokrewnych amfifilów peptydowych. Kwas trifluorooctowy i 4-metylopirydyna mogą być niebezpieczne, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy podjąć środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek, fartuchów laboratoryjnych i praca pod wyciągiem.