Synteza i charakterystyka samoorganizujących się peptydów modyfikowanych 1,2-ditiolanem

Wraz ze wzrostem struktur zwiększających funkcjonalność struktur nadcząsteczkowych, ta metoda łączenia grup 1, 2-ditionanowych z samoorganizującymi się peptydami może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące reaktywności na powierzchniach nadmolekularnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że sprzężenie i deprotekcja cząsteczki prekursora 1, 2-ditiolanu zachodzi na żywicy przy użyciu tylko jednego etapu oczyszczania końcowego zmodyfikowanego peptydu. Ponieważ czas potrzebny na dojrzewanie zespołów do ich końcowych struktur nadcząsteczkowych jest różny, wizualna demonstracja metod charakterystyki i wyników dla zespołów nadmolekularnych ma kluczowe znaczenie.

Aby zsyntetyzować prekursor ditiolanu, najpierw rozpuść jeden gram kwasu 3-bromo-2-proprionowego w około czterech mililitrach jednomolowego wodorotlenku sodu w 50-mililitrowej okrągłodennej kolbie reakcyjnej w temperaturze 55 stopni Celsjusza, mieszając. Gdy cały odczynnik zostanie zawieszony w roztworze, uszczelnić kolbę reakcyjną przegrodą i umieścić kolbę w atmosferze azotu. Następnie dodaj 1,49 grama tiooctanu potasu i trzy mililitry dwumolowego kwasu siarkowego do czterech mililitrów wody dejonizowanej, aby wytworzyć kwas tiooctowy in situ.

Odessać roztwór kwasu tiooctowego do plastikowej, jednorazowej strzykawki o pojemności 10 mililitrów i wyposażyć strzykawkę w igłę o rozmiarze 18G, a następnie przekłuć przegrodę igłą, aby dodać mieszaninę kroplami do kolby reakcyjnej i kontynuować reakcję przez noc w temperaturze 55 stopni Celsjusza. Następnego ranka monitorować reakcję za pomocą chromatografii cienkowarstwowej na płytkach z żelem krzemionkowym 60 F254 przy użyciu mieszaniny metanolu i dichlorometanu i wizualizować postęp reakcji za pomocą barwienia zielenią bromokrezolową. Gdy zakończona reakcja ostygnie do temperatury pokojowej, zakwasić mieszaninę dwumolowym kwasem siarkowym do pH jednego.

Żółty olej powinien oddzielić się od roztworu, a następnie wyekstrahować produkt trzema 40-mililitrowymi dodatkami zimnego chloroformu i połączyć warstwy organiczne w celu wysuszenia na siarczanie magnezu, usuwając chloroform pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt powinien być żółtym olejem o ogólnej wydajności 83% i może być stosowany bez dalszego oczyszczania. Aby sprzęgnąć prekursor ditiolanu z N-końcem peptydu na żywicy, dodaj cztery równoważniki prekursora ditiolanu do pięciu mililitrów dimetyloformamidu, czterech równoważników HBTU i 10 równoważników DIPEA.

Pozostawić mieszaninę sprzęgającą do wstępnej aktywacji przez 10 minut w temperaturze pokojowej przed dodaniem próbki do strzykawki ze spiekaczką zawierającą żywicę N-końcową. Wstrząsać reakcją sprzęgania przez dwie godziny, a następnie trzy pięciomililitrowe płukanie świeżym dimetyloformamidem i powtórzyć reakcję sprzęgania i wytrząsanie przez noc. Po drugim sprzężeniu przemyj żywicę trzema pięciomililitrowymi płukaniami dimetyloformamidu, a następnie trzema pięciomililitrowymi płukankami żywicą dichlorometanową i przenieś wysuszoną żywicę do 10-mililitrowej probówki do reakcji mikrofalowej.

Następnie, aby zdezprotect grupę tiooctanową przed prekursorem N-końcowego ditiolanu, dodaj dwa mililitry dimetyloformamidu do probówki. Pozwól żywicy pęcznieć, dodaj małe mieszadło magnetyczne do naczynia i ponownie zawieś żywicę za pomocą mieszania magnetycznego o niskiej prędkości. Po 15 minutach dodać dwa mililitry stężonego wodorotlenku amonu do probówki, przykryć naczynie reakcyjne silikonową przegrodą i umieścić naczynie w reaktorze mikrofalowym na 45 minut w temperaturze 75 stopni Celsjusza, mieszając.

Po zakończeniu reakcji mikrofalowej przenieś żywicę do czystej, jednorazowej, spiekanej strzykawki i umyj żywicę dwoma pięciomililitrowymi dimetyloformamidem i dwoma pięciomililitrowymi roztworami metanolu. Po ostatnim praniu dodaj pięć mililitrów koktajlu rozszczepienia do strzykawki zawierającej żywicę na 1 1/2 godziny inkubacji z delikatnym wstrząsaniem w temperaturze pokojowej. Aby przygotować jeden mililitr surowego peptydu do wysokosprawnej chromatografii cieczowej lub oczyszczania HPLC, dodaj 400 mikrolitrów skoncentrowanego materiału peptydowego w acetonitrylu do 600 mikrolitrów wody uzupełnionej 0,1% kwasu trifluorooctowego i przefiltruj roztwór przez 22-mikrometrowy filtr strzykawkowy do fiolki HPLC.

Aby oczyścić peptyd, użyj półpreparatywnej kolumny C18 o natężeniu przepływu trzech mililitrów na minutę w liniowym gradiencie od 15 do 55% acetonitrylu w ciągu 20 minut z detektorami UV ustawionymi na 222 nanometry i 330 nanometrów. Następnie zbierz i połącz interesujące Cię szczyty. W celu potwierdzenia produktu peptydowego za pomocą czasu przelotu desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą lub spektrometrii mas MALDI-TOF, należy wymieszać 0,5 mikrolitra zebranego piku na matrycowo wspomaganej desorpcji/jonizacji laserowej płytce zawierającej 0,5 mikrolitra matrycy kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego.

Aby przygotować roztwór do samoorganizacji, rozpuść jeden miligram liofilizowanego proszku peptydowego w mieszaninie 20% acetonitrylu i 10-milimolowego HEPES w 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki, a następnie zwiruj roztwór montażowy i pozostaw próbkę do złożenia w temperaturze pokojowej. Gdy zespół peptydowy osiągnie dojrzałość, wysusz od ośmiu do 10 mikrolitrów roztworu montażowego jako cienką warstwę na osłabionym krysztale diamentu o całkowitym odbiciu i monitoruj zanikanie dużego i szerokiego piku wody od 1640 do 1631 odwrotnych centymetrów w miarę tworzenia się suchego filmu. Uzyskaj widma tła i podczerwieni od 1500 do 1800 centymetrów odwrotnych, uzyskując średnio 50 skanów z rozdzielczością dwóch odwrotnych centymetrów, odejmując skany tła przed każdym skanowaniem próbki.

Sygnatura w podczerwieni dla montażu arkusza beta powinna być obserwowana jako ostry pik między 1625 a 1635 odwrotnymi centymetrami. Gdy próbki peptydów dojrzeją do bogatych w arkusze beta struktur nadcząsteczkowych, załaduj 10 mikrolitrów roztworu zespołu peptydów na powierzchnię siatki węglowej transmisyjnego mikroskopu elektronowego i pozwól zestawom adsorbować się na powierzchni siatki przez jedną do dwóch minut. Przyłóż bibułę filtracyjną do krawędzi siatki, aby usunąć nadmiar próbki, i dodaj 10 mikrolitrów świeżo przygotowanego barwnika z 2% octanu uranylu do powierzchni siatki na dwie do trzech minut inkubacji, a następnie usuń nadmiar plamy bibułą filtracyjną i umieść siatkę w eksykatorze próżniowym na noc przed obrazowaniem następnego dnia za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Oprócz początkowej jednoetapowej syntezy cząsteczki prekursora ditiolanu, reszta syntezy peptydu modyfikowanego 1, 2-ditiolanem zachodzi na stałym podłożu. Konwersja kwasu 3-bromo-2-proprionowego do kwasu 3-2-propanowego, prekursora ditiolanu, jest potwierdzana przez magnetyczny rezonans jądrowy protonu i węgla-13 przed sprzężeniem z wolną aminą N-końcową peptydu nadal na żywicy. Po debezferacjonacji surowy peptyd jest oczyszczany metodą HPLC z odwróconymi fazami, a masa produktu jest potwierdzana za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF.

Spektroskopia dichroizmu w podczerwieni i kołowa z transformacją Fouriera może być stosowana do monitorowania samoorganizacji oczyszczonego peptydu 1,2-ditiolanu w dojrzałe włókna amyloidowe w celu scharakteryzowania ich rozszerzonej konformacji arkusza beta. Włókna można następnie zobrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Chociaż metody te mogą być używane do modyfikowania N-końca dowolnej sekwencji peptydowej nadal na żywicy, ważne jest, aby pamiętać, że warunki samoorganizacji peptydu powinny być zoptymalizowane dla każdego peptydu.

Techniki te, polegające na dodawaniu grup 1,2-ditiolanowych do samoorganizujących się peptydów, pozwolą naukowcom zajmującym się biomateriałami badać nadcząsteczkową reaktywność powierzchniową.