Prosta metoda obrazowania liści Arabidopsis z wykorzystaniem perfluorodekaliny jako infiltrującego medium obrazującego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zminimalizowanie degradacji obrazów biologicznych spowodowanej przestrzeniami powietrznymi w liściach roślin, aby uzyskać wyraźniejsze obrazy żywych komórek wewnątrz liścia. Jeśli liść zostanie zamontowany w wodnym medium montującym i fluorofor zostanie wzbudzony laserem, liczne niezapełnione przestrzenie powietrzne oraz zmiany współczynnika załamania światła w tkance, zaznaczonych na pomarańczowo, ograniczają siłę sygnału docierającego z głębszych warstw tkanki w otrzymanym obrazie. Jeśli zamiast tego liść zostanie zamontowany w perfluorodekalinie (PFD), wynikające z tego wzbudzenie laserowe fluoroforu jest słabiej tłumione, co pozwala na lepszą transmisję emitowanych sygnałów.

Ostatecznie, zastosowanie skaningowej mikroskopii konfokalnej z użyciem medium montażowego PFD pozwala na uzyskanie wyraźnych obrazów żywych komórek wewnątrz liścia rośliny na głębokości ponad dwukrotnie większej niż w przypadku stosowania wodnego medium montażowego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak fiksacja lub montowanie liści w mediach wodnych, jest redukcja refrakcji w obrębie mezofila, co umożliwia dokładniejsze obrazowanie żywych komórek głębiej w liściu, co dotychczas było problematyczne. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w nauce o roślinach, takie jak badanie biologii komórkowej i sygnalizacji in vivo w mezofilu, kolonizacja liści przez patogeny oraz interakcje z patogenami, dostarczając tym samym wglądu w fundamentalną biologię roślin.

Metodę tę można zastosować również do innych silnie załamujących światło tkanek bogatych w przestrzenie powietrzne, takich jak spirale wewnątrzśluzówkowe lub płuca kręgowców. Procedurę tę zaprezentuje dr George Littlejohn z mojego laboratorium w Mount Leaf. Przygotowanie próbek w PFD rozpoczyna się od sporządzenia preparatu mikroskopowego z przepuszczalną dla gazów uszczelką z polidimetylosiloksanu lub PDMS. PDMS jest polimerem wiskoelastycznym, który można formować w celu stworzenia komory dostosowanej do wymagań doświadczalnych.

Równoważymy PFD z powietrzem, wstrząsając niewielką objętością PFD w butelce wypełnionej powietrzem. Można to również osiągnąć poprzez przepuszczanie pęcherzyków powietrza przez PFD; następnie przelewamy PFD do otwartej szalki Petriego i umieszczamy całą siewkę lub wycięty liść na powierzchni cieczy na pięć minut. Tkanka powinna stać się półprzezroczysta, przypominając tkankę zwitryfikowaną.

Liście mogą wydawać się ciemniejsze lub jaśniejsze niż przed ekspozycją na PFD, w zależności od warunków oświetlenia i wieku użytej tkanki. Na koniec wypełnij komorę PDMS napowietrzonym PFD i ostrożnie przenieś próbki tkanek z szalki Petriego do inkubacji do komory PDMS. Zamknij preparat szkiełkiem nakrywkowym i wykonaj obrazowanie.

Zgodnie z wymogami eksperymentalnymi, liście miesięczne inkubowano przez pięć minut w zawiesinie rekombinowanej zielonej białka fluorescencyjnego (GFP). Mikroskopowa inspekcja próbek liści inkubowanych w PFD wykazuje, że większość przestrzeni powietrznych jest wypełniona rekombinowanym GFP zawieszonym w PFD. GFP jest widoczny na zielono, natomiast kolor czerwony reprezentuje chlorofil, autofluorescencję oraz komórki mezofilu.

Widać, że liść zostaje całkowicie wypełniony PFD podczas inkubacji, choć mogą pozostać sporadyczne pęcherzyki powietrza. W tych warunkach woda nie wypełnia liścia. Tutaj liście opsys wykazujące ekspresję Venus, wariantu YFP lokalizującego się w cytosolu, poddano inkubacji i zamontowano w powietrzu, wodzie lub PFD do skanowania laserowego. Mikroskopia konfokalna próbek wykazuje przewagę PFD nad powietrzem i wodą, z około dwukrotnym zwiększeniem głębokości obrazowania.

W porównaniu z PFD i wodą, po opanowaniu tej techniki, procedura ta może zostać wykonana w ciągu od pięciu do 10 minut, jeśli jest przeprowadzona prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że perfluorodekalina rozpuszcza lakier do paznokci oraz Teflon, ale jest kompatybilna ze smarem silikonowym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak stosować perfluorodekalinę jako medium montażowe w celu poprawy obrazowania komórek liści roślin.

Należy pamiętać, że mimo nietoksyczności perfluorodekaliny, zalecamy stosowanie standardowych zasad bezpieczeństwa podczas wykonywania tej procedury.