Prosta metoda obrazowania liści Arabidopsis przy użyciu perfluorodekaliny jako medium do obrazowania naciekowego

Ogólnym celem tej procedury jest zminimalizowanie degradacji obrazów biologicznych spowodowanej przez przestrzenie powietrzne w liściach roślin, aby uzyskać wyraźniejsze obrazy żywych komórek w liściu. Jeśli liść jest zamontowany w wodnym podłożu montażowym, a fluorofor jest wzbudzany przez laser, wiele niewypełnionych przestrzeni powietrznych i zmiany współczynnika załamania światła w tkance pokazane na pomarańczowo ograniczają siłę sygnału głęboko z wnętrza tkanki w wynikowym obrazie. Jeśli zamiast tego liść jest zamontowany w per fluoro deline lub PFD, wynikowe wzbudzenie laserowe fluoroforu jest mniej osłabione i umożliwia lepszą transmisję emitowanych sygnałów.

Ostatecznie, zastosowanie skaningowej laserowej mikroskopii konfokalnej z podłożem montażowym PFD daje wyraźne obrazy żywych komórek w liściu rośliny na głębokości ponad dwukrotnie większej niż jest to możliwe w przypadku zastosowania wodnego podłoża montażowego. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak utrwalanie lub montaż liści i mediów wodnych, jest to, że zmniejsza ona załamanie światła w wypełnieniu mezo i umożliwia dokładniejsze obrazowanie żywych komórek głębiej w liściu, co do tej pory stawało się problematyczne. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w nauce o roślinach, takie jak zajmowanie się wypełnieniem mezo, biologią komórki i sygnalizacją in vivo, kolonizacją liści przez patogeny i interakcjami wypełnienia patogenów, chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w podstawową biologię roślin.

Może być również stosowany do innych tkanek o wysokim załamaniu światła, które są bogate w przestrzeń powietrzną, takich jak spirale wglądu lub płuca kręgowców. Tę procedurę zademonstruje dr George Littlejohn z mojego laboratorium To Mount Leaf. Próbki w PFD rozpoczynają się od przygotowania szkiełka mikroskopowego z przepuszczalną dla gazu uszczelką z polidimetylu Sloane lub P-D-M-S-P-D-M-S jest lepkosprężystym polimerem, który można formować w celu uzyskania komory dostosowanej do wymagań eksperymentalnych.

Zrównoważyć PFD z powietrzem, potrząsając niewielką objętością PFD w butelce wypełnionej powietrzem. Można to również osiągnąć poprzez przepuszczenie powietrza przez PFD, następnie zdekantować PFD na otwartą szalkę Petriego i spławić całą sadzonkę lub liść wycinkowy na płynie przez pięć minut. Tkanka powinna stać się półprzezroczysta, przypominająca tkankę zeszkloną.

Liście mogą wydawać się ciemniejsze lub jaśniejsze niż przed ekspozycją na PFD, w zależności od warunków oświetleniowych i wieku użytej tkanki. Na koniec napełnij komorę PDMS aero equated PFD i ostrożnie przenieś próbki tkanek z płytki Petriego do inkubacji do komory PDMS. Uszczelnij szkiełko z pokrywą, poślizgiem i obrazem.

Zgodnie z wymaganiami doświadczalnymi, liście miesięcy inkubowano przez pięć minut w zawiesinie rekombinowanego białka zielonej fluorescencji lub GFP. W PFD badanie mikroskopowe próbek inkubowanych liści PFD pokazuje, że większość przestrzeni powietrznych jest zalana rekombinowanym GFP zawieszonym w PFD. GFP jest w kolorze zielonym, a czerwony reprezentuje komórki chlorofilu, fluorescencji lotto i delits meso fill.

Oczywiste jest, że liść jest zalany podczas inkubacji z PFD, ale że od czasu do czasu mogą pozostać kieszenie powietrza Woda nie zalewa liścia w tych warunkach. Tutaj liście opsys wyrażające Wenus, wariant YFP, który lokalizuje się w cytozolu, są inkubowane i montowane w skanowaniu laserowym powietrzem, wodą lub PFD. Mikroskopia konfokalna próbek wykazuje przewagę PFD nad powietrzem i wodą przy przybliżonym dwukrotnym wzroście głębokości obrazowania.

Porównując PFD i wodę Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu pięciu do 10 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tego zabiegu należy pamiętać, że delina obwodowa rozpuszcza lakier do paznokci i teflon, ale jest kompatybilna ze smarem silikonowym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać deliny per fluro jako podłoża montażowego, aby poprawić obrazowanie w komórkach liści roślin.

Nie zapominaj, że chociaż delina fluorowa jest nietoksyczna, zalecamy przyjęcie standardowych praktyk bezpieczeństwa podczas wykonywania tej procedury.