Name: Prosta metoda obrazowania liści Arabidopsis przy użyciu perfluorodekaliny jako medium do obrazowania naciekowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 19 s
Description: Poznaj metodę obrazowania liści Arabidopsis thaliana przy użyciu perfluorodekaliny jako medium naciekowego. Technika ta zwiększa głębokość obrazowania komórek żywych ponad dwukrotnie w porównaniu do mediów wodnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować prof. Nicholasowi Smirnoffowi z University of Exeter za udzielone porady oraz University of Exeter Bioimaging Facility. Finansowanie zostało zapewnione przez brytyjską Radę ds. Badań nad Biotechnologią i Naukami Biologicznymi (numer grantu BB/E002682/1).

Poniższy protokół opisuje prostą metodę wykorzystania PFD jako infiltracyjnego medium montażowego w liściach Arabidopsis thaliana, jednak przewidujemy, że metoda ta może być stosowana w wielu zastosowaniach, w których pożądane jest obrazowanie tkanek bogatych w powietrze.
1. Montowanie próbek liści w PFD
<ol>
 <li>Przygotuj szkiełko przedmiotowe z przepuszczalną dla gazów uszczelką z polidimetylosiloksanu (PDMS, Carolina Observation Gel). PDMS jest polimerem wiskoelastycznym, który można formować w celu uzyskania komory dostosowanej do wymagań eksperymentalnych.</li>
 <li>Wyrównaj PFD z powietrzem. Można to osiągnąć poprzez przedmuchiwanie powietrzem lub wstrząsanie niewielkiej objętości PFD w wypełnionej powietrzem butelce.</li>
 <li>Przelej PFD do otwartej szalki Petriego i umieść na powierzchni PFD całą siewkę lub wycięty liść na 5 minut. Tkanka powinna stać się półprzezroczysta, przypominając tkankę zwitryfikowaną (Ryc. 2 (a)). Liście mogą wydawać się ciemniejsze lub jaśniejsze niż przed ekspozycją na PFD, w zależności od warunków oświetlenia i wieku użytej tkanki.</li>
 <li>Wypełnij komorę z PDMS wyrównanym z powietrzem PFD i ostrożnie przenieś próbki tkanek z inkubacyjnej szalki Petriego do komory z PDMS. Zamknij szkiełko nakładką i wykonaj obrazowanie zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi.</li>
 <li>Uwaga: PFD sprawdza się również w otwartej komorze zbudowanej na szkiełku nakrywkowym lub w komorze perfuzyjnej i jest kompatybilny z smarem silikonowym. PFD nie jest kompatybilny z elementami teflonowymi, ponieważ je rozpuszcza.</li>
</ol>
2. Reprezentatywne wyniki:
Badanie mikroskopowe próbek liści inkubowanych w PFD pokazuje, że większość przestrzeni międzykomórkowych jest wypełniona cieczą. Rysunek 2 (b) przedstawia przestrzenie wypełnione rekombinowanym GFP zawieszonym w PFD. Jest oczywiste, że liść zostaje wypełniony podczas inkubacji w PFD, choć mogą pozostać pojedyncze pęcherzyki powietrza. W tych warunkach woda nie wypełnia wnętrza liścia. LSCM próbek inkubowanych i montowanych w powietrzu, wodzie lub PFD wykazuje, że PFD zapewnia przewagę nad wodą i powietrzem pod względem możliwej głębokości obrazowania (Rysunek 3). Przykład podany na Rysunku 3 przedstawia liście Arabidopsis montowane w powietrzu, wodzie i PFD, wykazujące ekspresję cytozolowo zlokalizowanego białka Venus, wariantu YFP11 wyrażanego konstytutywnie pod promotorem 35S. Można zauważyć około 2-krotny wzrost głębokości obrazowania przy porównaniu PFD i wody. Należy jednak zaznaczyć, że dokładny stopień poprawy przy użyciu PFD różni się w zależności od apertury numerycznej obiektywu oraz rodzaju użytej tkanki. Obserwowano strumieniowanie cytoplazmatyczne oraz wydłużanie się włośników korzeniowych u siewek traktowanych PFD, co w każdym przypadku wskazuje na zdrowe rośliny. Dodatkowo wykazaliśmy2, że Fv/Fm, parametr określający sprawność fotosyntetyczną roślin12, pozostaje w dopuszczalnych granicach w ramach czasowych stosowanych podczas obrazowania.
<img alt="Schemat przekroju poprzecznego liścia z widocznymi strukturami komórkowymi pod mikroskopem, obejmujący mezofyl palisadowy i gąbczasty." src="/files/ftp_upload/3394/3394fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1."> 
Rysunek 1. Złożoność liścia rośliny i skutki optyczne 
Przedstawienie schematyczne cech anatomicznych liścia A. thaliana w odniesieniu do układu optycznego. Stosowane skróty: obj. = obiektyw, imm. = medium imersyjne, cov. = szkiełko nakrywki, mnt. = medium montażowe, cut. = kutykula, ad. ep. = epidermy adaksjalna, st. = aparat szparkowy, sp. = mezofyl gąbczasty, a.s. = przestrzeń międzykomórkowa, pal. = mezofyl palisadowy, v.b. = wiązka przewodząca, ad. ep. = epidermy adaksjalna. Ściany komórkowe zaznaczono czarnymi liniami.
<img alt="Schemat eksperymentu z infiltracją liści pokazujący fluorescencję GFP i analizę nałożenia obrazów." src="/files/ftp_upload/3394/3394fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2."> 
Rysunek 2. PFD łatwo przenika przez liście Arabidopsis 
(a) Liście inkubowane w powietrzu, wodzie lub PFD przez 5 minut, obrazowane za pomocą cyfrowej kamery Leica DCF3000FX z mikroskopem Leica MZ16F (Leica Microsystems (UK) Ltd., Milton-Keynes, UK). Logo JoVE wydrukowano na folii octanowej i oświetlono od dołu za pomocą stołu świetlnego. Czas ekspozycji wynosił 89 ms, a wszystkie obrazy zostały zebrane i przetworzone w identyczny sposób. Paski skali reprezentują 2 mm. 
 
(b) PFD zawierający oczyszczone rekombinowane zielone białko fluorescencyjne (GFP) wyznacza przestrzenie międzykomórkowe in vivo. GFP został zaznaczony kolorem zielonym (kolor sztuczny), natomiast kolor czerwony wskazuje autofluorescencję chlorofilu, która wyznacza komórki mezofylu. (Rysunek 2(b) powielony za zgodą; pełne szczegóły techniczne dostępne w pracy Littlejohn et al. 20102). Paski skali reprezentują 25 m.
<img alt="Analiza głębokości mikroskopii konfokalnej w tkance liścia, pokazująca rozkład fluorescencji w zależności od zastosowanej metody." src="/files/ftp_upload/3394/3394fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3."> 
Rycina 3. PFD poprawia obrazowanie konfokalne w liściach 
Obrazy LSCM pokazujące fluorescencję białka Venus zlokalizowaną w cytoplazmie (zielona) oraz autofluorescencję chlorofilu (czerwona) w nienaruszonych liściach A. thaliana obrazowanych w powietrzu, wodzie lub PFD. Długość fali wzbudzenia wynosiła 514 nm, a emisję fluorescencji rejestrowano przy 518 nm 604 nm dla Venus oraz przy 657 nm 679 nm dla chloroplastów. Każdy panel stanowi pojedynczy przekrój konfokalny pobrany ze stosu Z składającego się z 11 obrazów konfokalnych uzyskanych w odstępach 5 μm. Zostały one wyodrębnione z pełnego stosu Z obejmującego 59 obrazów uzyskanych w odstępach 1 μm, które posłużyły do przygotowania filmów uzupełniających. Pomiary głębokości podano w stosunku do powierzchni epidermy. Przedstawiono reprezentatywne obrazy, które zostały przetworzone w identyczny sposób. Szczegóły eksperymentalne, takie jak ustawienia mikroskopu, są identyczne z tymi opisanymi w pracy Littlejohn et al., 20102. Paski skali odpowiadają 20 μm.

<ol><li>Inoue, S. Foundations of Confocal Scanned Imaging in Light Microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInoue%2C+S+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%2C+3rd%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd</a>. Pawley, J. P. , Springer Science & Business Media, LLC. New York. 1-16 (2006).</li>
<li>Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C. S. mirnoff, N,, Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfluorodecalin+substantially+improves+confocal+depth+resolution+in+air-filled+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22New.+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Perfluorodecalin substantially improves confocal depth resolution in air-filled tissues.</a> New. Phytologist. 186, 1018-1025 (2010).</li>
<li>Sargent, J. W., Seffl, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+perfluorinated+liquids.+Fed%5BTitle%5D)+AND+%22Fed.+Proc%22%5BJournal%5D)">Properties of perfluorinated liquids. Fed.</a> Fed. Proc. 29, 1699-1703 (1970).</li>
<li>Schönherr, J., Bukovac, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+stomata+by+liquids%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Penetration of stomata by liquids.</a> Plant Physiol. 49, 813-819 (1972).</li>
<li>Davies, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+ventilation%5BTitle%5D)+AND+%22Paediatr.+Child.+Health%22%5BJournal%5D)">Liquid ventilation.</a> Paediatr. Child. Health. 35, 434-437 (1999).</li>
<li>Shaffer, T. H., Wolfson, M. R., Greenspan, J. S., Hoffman, R. E., Davis, S. L., Clark, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+ventilation+in+premature+lambs%3A+uptake%2C+biodistribution+and+elimination+of+perfluorodecalin+liquid%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Fertil.+Dev%22%5BJournal%5D)">Liquid ventilation in premature lambs: uptake, biodistribution and elimination of perfluorodecalin liquid.</a> Reprod. Fertil. Dev. 8, 409-416 (1996).</li>
<li>Crafoord, S., Larsson, J., Hansson, L. J., Carlsson, J. O., Stenkula, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+perfluorocarbon+liquids+in+vitreoretinal+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Ophthalmol.+Scand%22%5BJournal%5D)">The use of perfluorocarbon liquids in vitreoretinal surgery.</a> Acta. Ophthalmol. Scand. 73, 442-445 (1995).</li>
<li>Lowe, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+blood%3A+synthetic+substitutes+from+fluorinated+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineering blood: synthetic substitutes from fluorinated compounds.</a> Tissue Eng. 9, 389-399 (2003).</li>
<li>Wardrop, J., Edwards, C. M., Lowe, K. C., Davey, M. R., Power, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+responses+of+plant+protoplasts+to+culture+with+oxygenated+perfluorocarbon%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular responses of plant protoplasts to culture with oxygenated perfluorocarbon.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 428, 501-505 (1997).</li>
<li>Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorocarbons+to+study+freezing+in+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Use of fluorocarbons to study freezing in plant tissues.</a> Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).</li>
<li>Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li>
<li>Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorophyll+fluorescence%3A+a+probe+of+photosynthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo.</a> Annu. Rev. Plant. Biol. 59, 89-113 (2008).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Jest to prosta i łatwa w użyciu technika pozwalająca na poprawę mikroskopii tkanek wypełnionych powietrzem lub optycznie złożonych. Wykazaliśmy, że technika ta posiada istotne zalety i mamy nadzieję, że zostanie ona wykorzystana do wyjaśnienia kwestii biologicznych związanych z tkankami bogatymi w powietrze. Przykładowo, byłaby ona naturalnym wyborem do badań nad atakiem patogenów w mezofilu roślinnym lub w płucach. Jesteśmy również świadomi ograniczeń tej techniki. Pracujemy nad lepszym dopasowaniem współczynnika załamania światła, zastosowaniem w innych trybach mikroskopii oraz uzupełnianiem medium montażowego na bazie perfluorowęglowodorów podczas długotrwałych eksperymentów. Dostrzegamy jednak również, że jedna z głównych zalet PFC, a mianowicie ich biologiczna obojętność, ma swoją drugą stronę. PFC nie rozpuszczają łatwo cząsteczek biologicznych, co oznacza również, że nie mogą być one łatwo wykorzystane do dostarczania interesujących związków, takich jak hormony, leki i inne małe cząsteczki lub jony.

<table><tbody><tr><td>Perfluorodekalina</td><td>F2 Chemicals</td><td>N/A</td><td>Zamówienie telefoniczne.</td></tr><tr><td>Żel obserwacyjny Carolina</td><td>Blades Biological</td><td>13-2700</td><td></td></tr></tbody></table>

prosta metoda obrazowania liści arabidopsis z wykorzystaniem perfluorodekaliny jako infiltrującego medium obrazującego

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

Problem pozyskiwania obrazów o wysokiej rozdzielczości z głębokich warstw próbek biologicznych jest powszechnie znany1. W tkankach wypełnionych powietrzem, takich jak gąbczysty mezofil liści roślin czy płuca kręgowców, dodatkowe trudności wynikają z licznych przejść współczynnika załamania światła między komponentami komórkowymi, między komórkami a przestrzeniami powietrznymi oraz między tkanką biologiczną a resztą układu optycznego. Co więcej, niedopasowanie współczynników załamania prowadzi do tłumienia wzbudzenia fluoroforu i emisji sygnału w mikroskopii fluorescencyjnej. Opisujemy tutaj zastosowanie perfluorowęglowodoru, perfluorodekaliny (PFD), jako infiltracyjnego ośrodka obrazowania, który optycznie poprawia obrazowanie próbek w głębi za pomocą konfokalnej mikroskopii skaningowej (LSCM), bez konieczności stosowania szkodliwego zwiększania mocy lasera i przy minimalnym wpływie fizjologicznym2. Przedstawiamy protokół stosowania PFD w tkance liścia Arabidopsis thaliana, która jest optycznie złożona ze względu na swoją strukturę (Rycina 1). PFD posiada szereg właściwości, które czynią go odpowiednim do tego zastosowania3. Współczynnik załamania światła PFD (1,313) jest porównywalny z współczynnikiem wody (1,333) i jest bliższy współczynnikowi cytozolu (ok. 1,4) niż powietrza (1,000). Dodatkowo PFD jest łatwo dostępny, niefluorescencyjny i nietoksyczny. Niskie napięcie powierzchniowe PFD (19 dynes cm-1) jest niższe niż w przypadku wody (72 dynes cm-1) i znajduje się poniżej granicy (25 - 30 dyne cm-1) dla penetracji przez aparaty szparkowe4, co pozwala na wypełnienie przestrzeni powietrznych gąbczystego mezofilu bez stosowania potencjalnie destrukcyjnej próżni lub surfaktantu. Wreszcie, co kluczowe, PFD wykazuje dużą zdolność do rozpuszczania CO2 i O2, co pozwala na utrzymanie wymiany gazowej w wypełnionej tkance, minimalizując tym samym wpływ fizjologiczny na próbkę. Właściwości te były wykorzystywane w różnych zastosowaniach, w tym w częściowym oddychaniu w cieczy i wentylacji płuc5,6, chirurgii7, sztucznej krwi8, natlenianiu pożywek hodowlanych9 oraz badaniach nad tworzeniem się kryształów lodu w roślinach10. Obecnie powszechną praktyką przy obrazowaniu konfokalnym tkanek żywych jest ich montowanie w wodzie lub buforze wodnym. Uważamy, że zastosowanie PFD jako medium montażowego stanowi usprawnienie istniejącej praktyki i umożliwia prostą preparację żywych próbek całych liści do obrazowania.

Opisujemy zastosowanie perfluorodekaliny jako infiltracyjnego medium montażowego. Jest to prosta metoda poprawiająca głębokość obrazowania w tkance liścia Arabidopsis thaliana przy minimalnym wpływie fizjologicznym.

Prosta metoda obrazowania liści Arabidopsis z wykorzystaniem perfluorodekaliny jako infiltrującego medium obrazującego

Problem pozyskiwania obrazów o wysokiej rozdzielczości z głębokich warstw próbek biologicznych jest powszechnie znany1. W tkankach wypełnionych powietrzem, takich jak gąbczysty mezofyl ...

Ogólnym celem tej procedury jest zminimalizowanie degradacji obrazów biologicznych spowodowanej obecnością przestrzeni powietrznych w liściach roślin, aby uzyskać wyraźniejsze obrazy żywych komórek wewnątrz liścia. Jeśli liść zostanie zamocowany w wodnym medium montażowym i fluorofor zostanie wzbudzony laserem, liczne niezypełnione przestrzenie powietrzne oraz zmiany współczynnika załamania światła w obrębie tkanki (pokazane na pomarańczowo) ograniczają siłę sygnału pochodzącego z głębszych warstw tkanki na otrzymanym obrazie. Jeśli natomiast liść zostanie zamocowany w perfluorodekalinie (PFD), wynikające z tego wzbudzenie laserowe fluoroforu jest w mniejszym stopniu tłumione, co pozwala na lepszą transmisję emitowanych sygnałów.Ostatecznie, zastosowanie skaningowej mikroskopii konfokalnej z użyciem medium montażowego PFD pozwala na uzyskanie wyraźnych obrazów żywych komórek wewnątrz liścia rośliny na głębokości ponad dwukrotnie większej niż w przypadku zastosowania wodnego medium montażowego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak fiksacja, montowanie liści czy stosowanie mediów wodnych, jest redukcja refrakcji w obrębie mezofylu, co umożliwia dokładniejsze obrazowanie żywych komórek w głębszych warstwach liścia, co dotychczas stanowiło problem. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu nauk o roślinach, takie jak biologia komórek mezofylu i sygnalizacja in vivo, kolonizacja liści przez patogeny oraz interakcje z patogenami; tym samym metoda ta może dostarczyć wglądu w fundamentalną biologię roślin.Metodę tę można zastosować również do innych tkanek o wysokim współczynniku załamania światła, bogatych w przestrzenie powietrzne, takich jak spirale ślimaków lub płuca kręgowców. Procedurę tę zaprezentuje dr George Littlejohn z mojego laboratorium To Mount Leaf. Próbki w PFD przygotowuje się od sporządzenia preparatu mikroskopowego z przepuszczalną dla gazów uszczelką z polidimetylosiloksanu lub P-D-M-S; P-D-M-S jest polimerem wiskoelastycznym, który można formować w celu stworzenia komory dostosowanej do wymagań eksperymentalnych.Nasyć PFD powietrzem, wstrząsając niewielką objętością PFD w wypełnionej powietrzem butelce. Można to również osiągnąć poprzez przepuszczanie pęcherzyków powietrza przez PFD. Następnie przelej PFD do otwartej szalki Petriego i umieść całą siewkę lub wycięty liść na powierzchni cieczy na pięć minut. Tkanka powinna stać się półprzezroczysta, co przypomina tkankę zwitryfikowaną.Liście mogą wydawać się ciemniejsze lub jaśniejsze niż przed ekspozycją na PFD, w zależności od warunków oświetlenia i wieku użytej tkanki. Na koniec wypełnij komorę PDMS napowietrzonym PFD i ostrożnie przenieś próbki tkanki z szalki Petriego do inkubacji do komory PDMS. Zamknij preparat szkiełkiem nakrywką i wykonaj obrazowanie.Zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi, liście miesięczne inkubowano przez pięć minut w zawiesinie rekombinowanego zielonego białka fluorescencyjnego (GFP). Mikroskopowa inspekcja próbek liści inkubowanych w PFD wykazuje, że większość przestrzeni powietrznych jest wypełniona rekombinowanym GFP zawieszonym w PFD. GFP jest widoczny w kolorze zielonym, natomiast kolor czerwony reprezentuje chlorofil, autofluorescencję i komórki mezofila.Widać, że liść zostaje całkowicie zanurzony podczas inkubacji w PFD, jednak mogą pozostać sporadyczne pęcherzyki powietrza. W tych warunkach woda nie wypełnia całkowicie przestrzeni w liściu. W niniejszym doświadczeniu liście opsys wykazujące ekspresję Venus, wariantu YFP lokalizującego się w cytosolu, są inkubowane i montowane w powietrzu, wodzie lub PFD do skanowania laserowego. Mikroskopia konfokalna próbek wykazuje przewagę PFD nad powietrzem i wodą, przy w przybliżeniu dwukrotnym zwiększeniu głębokości obrazowania.W porównaniu z PFD i wodą, po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w czasie od pięciu do 10 minut, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że perfluorodekalina rozpuszcza lakier do paznokci oraz Teflon, ale jest kompatybilna z smarem silikonowym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wykorzystać perfluorodekalinę jako medium montażowe w celu poprawy obrazowania w komórkach liści roślin.Należy pamiętać, że mimo iż perfluorodekalina jest nietoksyczna, zalecamy stosowanie standardowych zasad bezpieczeństwa podczas przeprowadzania tej procedury.

a-simple-method-for-imaging-arabidopsis-leaves-using-perfluorodecalin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Prosty sposób obrazowania liści Arabidopsis z wykorzystaniem perfluorodecyny jako środka obrazującego infiltrującego

Opracowaliśmy prosty i powtarzalny protokół badania odpowiedzi aparatów szparkowych na żywe bakterie. Metoda ta minimalizuje uszkadzanie i manipulację liściem w porównaniu do wcześniej opisanego zastosowania preparatów z naskórka liści.

Ocena reakcji aparatów szparkowych na żywe komórki bakteryjne z wykorzystaniem obrazowania całych liści

Niniejszy artykuł przedstawia protokół hodowli siewek Arabidopsis w RootChip, mikrofluidycznej platformie obrazowania, która łączy zautomatyzowaną kontrolę warunków wzrostu z mikroskopijnym monitorowaniem korzeni oraz pomiarem wewnątrzkomórkowych poziomów metabolitów w oparciu o technikę FRET.

Obrazowanie fluorescencyjne w czasie rzeczywistym wzrostu korzeni Arabidopsis z szybką manipulacją środowiskiem korzenia przy użyciu urządzenia RootChip

Opisujemy protokół z wykorzystaniem szkiełek z komorami oraz pośrodków do unieruchamiania liści zasadniczych roślin w celu obrazowania konfokalnego epidermy przez kilka dni rozwoju, co pozwala na dokumentowanie różnicowania szparek. Białka znakowane fluoroforami mogą być śledzone dynamicznie poprzez analizę ich ekspresji i lokalizacji subkomórkowej, co zwiększa zrozumienie ich potencjalnych ról podczas podziału komórek i różnicowania typów komórek.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe wysokiej rozdzielczości konfokalne epidermy zawilżnych liści przeciwstawnych Arabidopsis podczas kiełkowania

Ca2+ reguluje różnorodne procesy biologiczne w roślinach. W tym miejscu przedstawiamy podejścia do monitorowania przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2 + wywołanych stresem abiotycznym w komórkach i tkankach rzodkiewnika przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 + Aequorin lub Case12.

Pomiar przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2+ u rzodkiewnika

Obrazowanie konfokalne na żywo dostarcza biologom potężnego narzędzia do badania rozwoju. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół obrazowania konfokalnego na żywo rozwijających się kwiatów rzodkiewnika.

Obrazowanie konfokalne na żywo rozwijających się kwiatów rzodkiewnika

Przedstawiona tutaj jest prosta technika konfokalnego obrazowania poklatkowego o wysokiej rozdzielczości rozwoju korzeni i hipokotylu przez okres do 3 dni przy użyciu obiektywów o dużej aperturze numerycznej i perfluorodekaliny jako medium immersyjnego.

Prosta komora do długoterminowego obrazowania konfokalnego rozwoju korzeni i hipokotylu

Ten artykuł pokazuje, jak hodować siewki Arabidopsis thaliana w dwuwarstwowej platformie mikroprzepływowej, która ogranicza główny korzeń i włośniki do jednej płaszczyzny optycznej. Platforma ta może być wykorzystywana do obrazowania optycznego w czasie rzeczywistym drobnej morfologii korzeni, a także do obrazowania w wysokiej rozdzielczości za pomocą innych środków.

Obrazowanie morfologii włośnika siewek rzodkiewnika w dwuwarstwowej platformie mikroprzepływowej

Tutaj prezentujemy protokół syntezy i charakterystyki nanocząstek tlenku ceru (nanocerii) do oczyszczania ROS (reaktywnych form tlenu) in vivo, obrazowania nanocerii w tkankach roślinnych za pomocą mikroskopii konfokalnej oraz monitorowania in vivo nanocerii ROS za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Katalityczne oczyszczanie roślinnych reaktywnych form tlenu in vivo za pomocą anionowych nanocząstek tlenku ceru

Przedstawiamy prostą i wszechstronną metodę wykonywania fluorescencyjnego obrazowania na żywo liści Arabidopsis thaliana przez dłuższy okres czasu. Używamy transgenicznej rośliny Arabidopsis wykazującej ekspresję fluorescencyjnego genu reporterowego pod kontrolą promotora związanego z odpornością jako przykładu uzyskania czasoprzestrzennego zrozumienia odpowiedzi immunologicznych roślin.

Uniwersalna metoda montażu liści Arabidopsis do przyżyciowego obrazowania poklatkowego

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak załadować CFDA do różnych miejsc w dolnych częściach Arabidopsis. Następnie przedstawiamy wynikowy wzór rozmieszczenia mukowiscydozy w pędach.

Ruch w kierunku strzału smugi CFDA załadowanej do tkanek dennego zlewu Arabidopsis

Kilka powszechnie stosowanych metod jest tutaj wprowadzanych do badania zdarzeń transportu błonowego kinazy receptora błony komórkowej. Manuskrypt ten opisuje szczegółowe protokoły, w tym przygotowanie materiału roślinnego, leczenie farmakologiczne i konfokalną.

Oparte na obrazie metody badania zdarzeń transportu błonowego w komórkach linii szparkowej

Poznaj metodę obrazowania liści Arabidopsis thaliana przy użyciu perfluorodekaliny jako medium naciekowego. Technika ta zwiększa głębokość obrazowania komórek żywych ponad dwukrotnie w porównaniu do mediów wodnych.

Prosta metoda obrazowania liści Arabidopsis z wykorzystaniem perfluorodekaliny jako infiltrującego medium obrazującego

Przeglądaj więcej filmów