Analiza stabilności plazmidu za pomocą mikrofluidyki kropelkowej typu open source

Dostępny przepływ pracy mikroprzepływów o otwartym kodzie źródłowym jest prezentowany do równoległej analizy retencji plazmidu u bakterii. Dzięki zastosowaniu mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego określenia obecności plazmidu w mikrokoloniach jednokomórkowych w mikrokropelkach żelu, metoda ta stanowi precyzyjną, dostępną i skalowalną alternatywę dla tradycyjnego liczenia płytek.

Opracowujemy wysokoprzepustowe mikrofilne metody IC do badania różnorodności populacji komórek i interakcji między komórkami. W tym kontekście, mikrokropelki żelu umożliwiają nam wykonywanie użytecznych kroków protokołu, takich jak manipulacja DNA barwiącym lizę i mikroskopia w wysoce sparaliżowany sposób w uwięzionych komórkach. Mikrofilne przepływy pracy kropelkowe są znane z bardzo wysokiej przepustowości i wszechstronności, ale ich zastosowanie jest często ograniczone przez potrzebę wysokiej klasy oprzyrządowania i specjalistycznej wiedzy.

Nasz protokół ulepsza tradycyjne techniki wykorzystujące wysokowydajną analizę pojedynczych komórek z barwieniem fluorescencyjnym i dostępny przepływ pracy mikroskopii typu open source. Zamyka komórki w mikrokropelkach żelu za pomocą mikrofluidyki, aby jednocześnie analizować minikomórki i mikrokolonie. Podczas gdy kulturom masowym i płytkowym brakuje specyficzności i rozdzielczości, metoda ta zapewnia precyzyjne i reprezentatywne statystyki różnych zjawisk.

Nasze protokoły łączą mikrofluidykę kropelkową, mikroskopię fluorescencyjną i sprzęt typu open source w metodzie opartej na znacznikach. Takie podejście sprawia, że analiza pojedynczych komórek jest bardziej elastyczna i przystępna cenowo, umożliwiając społeczności naukowej zajęcie się złożonymi pytaniami naukowymi dotyczącymi społeczności drobnoustrojów. Na początek podgrzej agarozę o bardzo niskiej temperaturze żelowania w stężeniu od 2% do 90 stopni Celsjusza w bulionie Luria Bertani lub LB.

Potrząsaj mieszaniną przez 10 minut w shakerze o kontrolowanej temperaturze, a następnie zmniejsz temperaturę wytrząsarki termicznej do 39 stopni Celsjusza, aby schłodzić roztwór agarozy. Umieść rurkę z zawiesiną Escherichia coli w wytrząsarce termicznej na cztery minuty, aby podgrzać ją do 39 stopni Celsjusza. Wymieszaj zawiesinę bakterii i roztwór agarozy w stosunku jeden do jednego, aby uzyskać stężenie agarozy 1% z zawiesiną komórkową 3,1 razy 10 do mocy sześciu komórek na mililitr.

Przygotować roztwór kontroli ujemnej do monitorowania zanieczyszczenia przy użyciu zawiesiny LB i agarozy w stosunku jeden do jednego. Uzyskaj pełną platformę przepływu typu open source, w tym sterowniki ciśnienia gazu i czujniki przepływu. Dołącz szklane szkiełko i grzałki końcówek pipet do zestawu, aby kontrolować temperaturę próbki komórek agarozy w momencie jej wprowadzania do chipa.

Następnie umieść chip mikroprzepływowy na stoliku mikroskopowym ze wzmocnieniem stroboskopowym, upewniając się, że widoczne jest złącze generowania kropel. Ustaw grzałkę końcówki do pipet i szklaną grzałkę szkiełka na 40 stopni Celsjusza za pomocą interfejsu oprogramowania sterującego. Za pomocą strzykawki z rurką i zatyczką PDMS załaduj 1% mieszaninę zawiesiny komórek agarozy do końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów.

Włóż końcówkę do grzałki końcówki i umieść ją na wlocie fazy wodnej w chipie mikroprzepływowym. Wymień uszczelkę PDMS końcówki na uszczelkę podłączoną do rurki systemu kontroli przepływu. Następnie włóż rurkę olejową do drugiego wlotu, a końcówkę rurki wylotowej do rurki odpływowej.

Następnie ustaw ciśnienie na 80 milibarów dla fazy przyzwolenia i oleju w interfejsie użytkownika i rozpocznij infuzję zawiesiny ogniw i oleju. Dostosuj fazę oleju do 320 milibarów, a fazę przyzwolenia do 180 milibarów. Odczekać jedną minutę na ustabilizowanie się wytwarzania kropel.

Gdy wytwarzanie kropel ustabilizuje się, przenieś rurkę wylotową z rurki odpływowej do rurki zbiorczej. Kontynuuj zbieranie kropelek na lodzie, aż zbiornik na próbkę będzie pusty. Po zebraniu umieść probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza na godzinę, aby agaroza mogła się żelować w kropelkach.

Inkubować mikrokropelki żelu zawierające bakterie i kropelki kontroli ujemnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny lub przez noc w celu wzrostu kolonii. Po inkubacji użyj trzymililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 21, aby ostrożnie usunąć jak najwięcej oleju z podstawy żelowej emulsji mikrokropelkowej. Przenieś 50 mikrolitrów mikrokropelek żelu do nowej mikroprobówki i przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dalszej analizy kropel, dodaj mieszaninę jeden do jednego oleju fluorowanego z PFO w objętości równej pozostałej emulsji.

Następnie dodaj około 200 mikrolitrów 0,9% buforu chlorku sodu na wierzch emulsji. Zmieszaj mieszaninę i krótko odwiruj ją w wirówce o stałej prędkości. Ostrożnie usuń fazę olejową z dolnej części granicy faz cieczy i wylej 100 mikrolitrów roztworu chlorku sodu od góry.

Przenieś dwa mikrolitry mikrokropelek żelu do szkiełka w komorze obrazowania i dodaj pięć mikrolitrów oleju fluorowanego, aby pomóc utworzyć monowarstwę kropelek dla optymalnego obrazowania. W mikroskopie włącz białe podświetlenie matrycy LED od góry, aby uzyskać obrazowanie w jasnym polu. Zamontuj przygotowaną prowadnicę.

Skoncentruj się na próbce, aby zlokalizować monowarstwę kropel i uchwycić obraz w jasnym polu. Następnie dostosuj koło filtrów, aby wyrównać je z zielonym filtrem długości fali. Przełącz się na 470-nanometrową diodę LED w celu wzbudzenia i bez przesuwania próbki uchwyć fluorescencyjny obraz kolonii.

Przenieś dwa mikrolitry mikrożeli barwionych jodkiem propidyny do chipa komory obrazowania i dodaj pięć mikrolitrów 0,9% roztworu chlorku sodu, aby utworzyć monowarstwę mikrożeli. Uszczelnij wlot i wylot chipa, aby zapobiec parowaniu podczas obrazowania. Dostosuj czerwony filtr interwału długości fali do obrazowania jodku propidyny i uchwyć obrazy jasnego pola i fluorescencji.

Enkapsulacja komórek w mikrokropelkach żelu została potwierdzona za pomocą mikroskopii jasnego pola, która pokazuje jednolite kropelki z wyraźnymi zamkniętymi komórkami. Kolonie, które utraciły fluorescencję kodowaną przez plazmid, zidentyfikowano za pomocą analizy współczynnika fluorescencji. Spośród 2 785 analizowanych kolonii, 100 kolonii straciło fluorescencję, co wskazuje na wskaźnik utraty plazmidu na poziomie 3,6%