Analiza stabilności plazmidu za pomocą mikrofluidyki kropelkowej typu open source
27 grudnia 2024
Dostępny przepływ pracy mikroprzepływów o otwartym kodzie źródłowym jest prezentowany do równoległej analizy retencji plazmidu u bakterii. Dzięki zastosowaniu mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego określenia obecności plazmidu w mikrokoloniach jednokomórkowych w mikrokropelkach żelu, metoda ta stanowi precyzyjną, dostępną i skalowalną alternatywę dla tradycyjnego liczenia płytek.
Opracowujemy wysokoprzepustowe mikrofilne metody IC do badania różnorodności populacji komórek i interakcji między komórkami. W tym kontekście, mikrokropelki żelu umożliwiają nam wykonywanie użytecznych kroków protokołu, takich jak manipulacja DNA barwiącym lizę i mikroskopia w wysoce sparaliżowany sposób w uwięzionych komórkach. Mikrofilne przepływy pracy kropelkowe są znane z bardzo wysokiej przepustowości i wszechstronności, ale ich zastosowanie jest często ograniczone przez potrzebę wysokiej klasy oprzyrządowania i specjalistycznej wiedzy.
Nasz protokół ulepsza tradycyjne techniki wykorzystujące wysokowydajną analizę pojedynczych komórek z barwieniem fluorescencyjnym i dostępny przepływ pracy mikroskopii typu open source. Zamyka komórki w mikrokropelkach żelu za pomocą mikrofluidyki, aby jednocześnie analizować minikomórki i mikrokolonie. Podczas gdy kulturom masowym i płytkowym brakuje specyficzności i rozdzielczości, metoda ta zapewnia precyzyjne i reprezentatywne statystyki różnych zjawisk.
Nasze protokoły łączą mikrofluidykę kropelkową, mikroskopię fluorescencyjną i sprzęt typu open source w metodzie opartej na znacznikach. Takie podejście sprawia, że analiza pojedynczych komórek jest bardziej elastyczna i przystępna cenowo, umożliwiając społeczności naukowej zajęcie się złożonymi pytaniami naukowymi dotyczącymi społeczności drobnoustrojów. Na początek podgrzej agarozę o bardzo niskiej temperaturze żelowania w stężeniu od 2% do 90 stopni Celsjusza w bulionie Luria Bertani lub LB.
Potrząsaj mieszaniną przez 10 minut w shakerze o kontrolowanej temperaturze, a następnie zmniejsz temperaturę wytrząsarki termicznej do 39 stopni Celsjusza, aby schłodzić roztwór agarozy. Umieść rurkę z zawiesiną Escherichia coli w wytrząsarce termicznej na cztery minuty, aby podgrzać ją do 39 stopni Celsjusza. Wymieszaj zawiesinę bakterii i roztwór agarozy w stosunku jeden do jednego, aby uzyskać stężenie agarozy 1% z zawiesiną komórkową 3,1 razy 10 do mocy sześciu komórek na mililitr.
Przygotować roztwór kontroli ujemnej do monitorowania zanieczyszczenia przy użyciu zawiesiny LB i agarozy w stosunku jeden do jednego. Uzyskaj pełną platformę przepływu typu open source, w tym sterowniki ciśnienia gazu i czujniki przepływu. Dołącz szklane szkiełko i grzałki końcówek pipet do zestawu, aby kontrolować temperaturę próbki komórek agarozy w momencie jej wprowadzania do chipa.
Następnie umieść chip mikroprzepływowy na stoliku mikroskopowym ze wzmocnieniem stroboskopowym, upewniając się, że widoczne jest złącze generowania kropel. Ustaw grzałkę końcówki do pipet i szklaną grzałkę szkiełka na 40 stopni Celsjusza za pomocą interfejsu oprogramowania sterującego. Za pomocą strzykawki z rurką i zatyczką PDMS załaduj 1% mieszaninę zawiesiny komórek agarozy do końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów.
Włóż końcówkę do grzałki końcówki i umieść ją na wlocie fazy wodnej w chipie mikroprzepływowym. Wymień uszczelkę PDMS końcówki na uszczelkę podłączoną do rurki systemu kontroli przepływu. Następnie włóż rurkę olejową do drugiego wlotu, a końcówkę rurki wylotowej do rurki odpływowej.
Następnie ustaw ciśnienie na 80 milibarów dla fazy przyzwolenia i oleju w interfejsie użytkownika i rozpocznij infuzję zawiesiny ogniw i oleju. Dostosuj fazę oleju do 320 milibarów, a fazę przyzwolenia do 180 milibarów. Odczekać jedną minutę na ustabilizowanie się wytwarzania kropel.
Gdy wytwarzanie kropel ustabilizuje się, przenieś rurkę wylotową z rurki odpływowej do rurki zbiorczej. Kontynuuj zbieranie kropelek na lodzie, aż zbiornik na próbkę będzie pusty. Po zebraniu umieść probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza na godzinę, aby agaroza mogła się żelować w kropelkach.
Inkubować mikrokropelki żelu zawierające bakterie i kropelki kontroli ujemnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny lub przez noc w celu wzrostu kolonii. Po inkubacji użyj trzymililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 21, aby ostrożnie usunąć jak najwięcej oleju z podstawy żelowej emulsji mikrokropelkowej. Przenieś 50 mikrolitrów mikrokropelek żelu do nowej mikroprobówki i przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dalszej analizy kropel, dodaj mieszaninę jeden do jednego oleju fluorowanego z PFO w objętości równej pozostałej emulsji.
Następnie dodaj około 200 mikrolitrów 0,9% buforu chlorku sodu na wierzch emulsji. Zmieszaj mieszaninę i krótko odwiruj ją w wirówce o stałej prędkości. Ostrożnie usuń fazę olejową z dolnej części granicy faz cieczy i wylej 100 mikrolitrów roztworu chlorku sodu od góry.
Przenieś dwa mikrolitry mikrokropelek żelu do szkiełka w komorze obrazowania i dodaj pięć mikrolitrów oleju fluorowanego, aby pomóc utworzyć monowarstwę kropelek dla optymalnego obrazowania. W mikroskopie włącz białe podświetlenie matrycy LED od góry, aby uzyskać obrazowanie w jasnym polu. Zamontuj przygotowaną prowadnicę.
Skoncentruj się na próbce, aby zlokalizować monowarstwę kropel i uchwycić obraz w jasnym polu. Następnie dostosuj koło filtrów, aby wyrównać je z zielonym filtrem długości fali. Przełącz się na 470-nanometrową diodę LED w celu wzbudzenia i bez przesuwania próbki uchwyć fluorescencyjny obraz kolonii.
Przenieś dwa mikrolitry mikrożeli barwionych jodkiem propidyny do chipa komory obrazowania i dodaj pięć mikrolitrów 0,9% roztworu chlorku sodu, aby utworzyć monowarstwę mikrożeli. Uszczelnij wlot i wylot chipa, aby zapobiec parowaniu podczas obrazowania. Dostosuj czerwony filtr interwału długości fali do obrazowania jodku propidyny i uchwyć obrazy jasnego pola i fluorescencji.
Enkapsulacja komórek w mikrokropelkach żelu została potwierdzona za pomocą mikroskopii jasnego pola, która pokazuje jednolite kropelki z wyraźnymi zamkniętymi komórkami. Kolonie, które utraciły fluorescencję kodowaną przez plazmid, zidentyfikowano za pomocą analizy współczynnika fluorescencji. Spośród 2 785 analizowanych kolonii, 100 kolonii straciło fluorescencję, co wskazuje na wskaźnik utraty plazmidu na poziomie 3,6%
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia otwartoźródłowy mikrofluidyczny schemat pracy do analizy retencji plazmidów w bakteriach z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej. Metoda ta pozwala na precyzyjną kwantyfikację obecności plazmidów w pojedynczo-komórkowych mikrokoloniach zamkniętych w żelowych mikrokroplach, stanowiąc skalowalną alternatywę dla tradycyjnego liczenia kolonii na płytkach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrofluidyka
- Biologia komórki
- Mikroskopia fluorescencyjna
Wstęp
- Techniki mikroprzepływowe umożliwiają wysokoprzepustową analizę populacji komórek.
- Tradycyjne metody często charakteryzują się niską specyficznością i rozdzielczością.
- Żelowe mikrokropelki stanowią wszechstronną platformę do analizy pojedynczych komórek.
- Podejścia typu open-source mogą zdemokratyzować dostęp do zaawansowanych metodologii.
Cel badania
- Opracowanie wysokoprzepustowej metody badania retencji plazmidów w bakteriach.
- Poprawa dostępności i przystępności cenowej technik analizy pojedynczych komórek.
- Zapewnienie skalowalnej alternatywy dla tradycyjnych metod hodowli.
Zastosowane metody
- Przygotowanie mikrokropel żelu agarozowego zawierających komórki bakteryjne.
- Wykorzystanie mikroprzepływów do generowania i manipulowania kropelkami.
- Mikroskopia fluorescencyjna do obrazowania i ilościowego określania retencji plazmidów.
- Analiza fluorescencji kolonii w celu określenia tempa utraty plazmidów.
Główne wyniki
- Potwierdzono enkapsulację komórek w mikrokroplach żelu za pomocą mikroskopii w jasnym polu.
- Stwierdzono 3,6% wskaźnik utraty plazmidów wśród analizowanych kolonii.
- Wykazano skuteczność otwartoźródłowego przepływu pracy w analizach wysokoprzepustowych.
- Przedstawiono precyzyjne statystyki dotyczące retencji plazmidów w zróżnicowanych populacjach bakteryjnych.
Wnioski
- Opracowana metoda usprawnia badanie społeczności drobnoustrojów.
- Oferuje ona elastyczne i przystępne cenowo podejście do analizy pojedynczych komórek.
- Ten schemat postępowania może być stosowany przez badaczy o różnym poziomie doświadczenia.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Stabilność plazmidu jest krytycznym parametrem w biologii syntetycznej i inżynierii mikrobowej, bezpośrednio wpływając na niezawodność zmodyfikowanych szczepów w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym. Wysokoprzepustowa analiza ilościowa retencji plazmidów bez selekcji antybiotykowej umożliwia solidną walidację celu i minimalizuje ryzyko w początkowych etapach procesów odkrywania. Otwarta architektura mikrofluidyki kropelkowej demokratyzuje dostęp do zaawansowanej analityki pojedynczych komórek, wspierając skalowalne decyzje dotyczące portfolio oraz ciągłość translacyjną.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia ilościową analizę stabilności plazmidów w modyfikowanych populacjach mikrobiologicznych.
- Wspiera walidację funkcjonalną konstruktów genetycznych w warunkach bez selekcji.
- Dostarcza danych o wysokiej rozdzielczości w celu mechanistycznego ograniczania ryzyka w przypadku obwodów syntetycznych.
- Ułatwia uzyskanie pewności prognostycznej w zakresie wydajności szczepów w zastosowaniach końcowych.
Przesiewy i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane układy mikrobiologiczne do wysokoprzepustowych procesów przesiewowych.
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki do standaryzacji testów.
- Umożliwia równoległą analizę tysięcy mikrokolonii, zwiększając moc statystyczną.
- Wspiera skalowalne i wielokrotnego użytku platformy testowe dla różnorodnych konstruktów genetycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje stabilność układu mikrobiologicznego do translacyjnych strategii biomarkerowych, gdy jest to zasadne.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez ilościowe określanie retencji genetycznej.
- Zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnym etapie z powodu niestabilności plazmidów w szczepach zmodyfikowanych.
- dostarcza wglądu mechanistycznego w celu predykcyjnej minimalizacji ryzyka w procesach translacyjnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten otwartoźródłowy przepływ mikrofluidyczny integruje się z kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając rzetelną analitykę pojedynczych komórek – od wczesnej walidacji celu, przez opracowanie testów, aż po badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez ilościowe określanie retencji plazmidów z rozdzielczością pojedynczej komórki.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, wysokoprzepustowe wyniki analiz w celu rzetelnej oceny związków lub konstruktów.
- Analityka: Dostarcza ilościowych pomiarów opartych na fluorescencji w celu porównania stabilności genetycznej w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy fazę odkryć z fazą przedkliniczną poprzez zapewnienie wierności zmodyfikowanych szczepów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje elastyczną platformę open-source, którą można dostosować do różnych systemów genetycznych i mikrobiologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji zmodyfikowanych szczepów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i skaluje analizę pojedynczych komórek przy użyciu dostępnej aparatury.
- Wartość strategiczna: Poprawia procesy podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową dzięki dostarczeniu wiarygodnych danych o stabilności genetycznej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację projektów z zakresu inżynierii mikrobiologicznej z uwzględnieniem poziomu ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrofluidyki, mikroskopii fluorescencyjnej i genetyki drobnoustrojów.
- Wymaga sprzętu open-source do precyzyjnej kontroli przepływu i temperatury.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalnej integracji danych.
- Możliwość adaptacji do różnych modeli drobnoustrojów i konstruktów genetycznych przy minimalnych modyfikacjach.
- Ograniczona koniecznością stosowania odczytów opartych na fluorescencji i kompatybilnej infrastruktury obrazowania.
