Analiza stabilności plazmidu za pomocą mikrofluidyki kropelkowej typu open source
December 27th, 2024
Dostępny przepływ pracy mikroprzepływów o otwartym kodzie źródłowym jest prezentowany do równoległej analizy retencji plazmidu u bakterii. Dzięki zastosowaniu mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego określenia obecności plazmidu w mikrokoloniach jednokomórkowych w mikrokropelkach żelu, metoda ta stanowi precyzyjną, dostępną i skalowalną alternatywę dla tradycyjnego liczenia płytek.
Opracowujemy wysokoprzepustowe mikrofilne metody IC do badania różnorodności populacji komórek i interakcji między komórkami. W tym kontekście, mikrokropelki żelu umożliwiają nam wykonywanie użytecznych kroków protokołu, takich jak manipulacja DNA barwiącym lizę i mikroskopia w wysoce sparaliżowany sposób w uwięzionych komórkach. Mikrofilne przepływy pracy kropelkowe są znane z bardzo wysokiej przepustowości i wszechstronności, ale ich zastosowanie jest często ograniczone przez potrzebę wysokiej klasy oprzyrządowania i specjalistycznej wiedzy.
Nasz protokół ulepsza tradycyjne techniki wykorzystujące wysokowydajną analizę pojedynczych komórek z barwieniem fluorescencyjnym i dostępny przepływ pracy mikroskopii typu open source. Zamyka komórki w mikrokropelkach żelu za pomocą mikrofluidyki, aby jednocześnie analizować minikomórki i mikrokolonie. Podczas gdy kulturom masowym i płytkowym brakuje specyficzności i rozdzielczości, metoda ta zapewnia precyzyjne i reprezentatywne statystyki różnych zjawisk.
Nasze protokoły łączą mikrofluidykę kropelkową, mikroskopię fluorescencyjną i sprzęt typu open source w metodzie opartej na znacznikach. Takie podejście sprawia, że analiza pojedynczych komórek jest bardziej elastyczna i przystępna cenowo, umożliwiając społeczności naukowej zajęcie się złożonymi pytaniami naukowymi dotyczącymi społeczności drobnoustrojów. Na początek podgrzej agarozę o bardzo niskiej temperaturze żelowania w stężeniu od 2% do 90 stopni Celsjusza w bulionie Luria Bertani lub LB.
Potrząsaj mieszaniną przez 10 minut w shakerze o kontrolowanej temperaturze, a następnie zmniejsz temperaturę wytrząsarki termicznej do 39 stopni Celsjusza, aby schłodzić roztwór agarozy. Umieść rurkę z zawiesiną Escherichia coli w wytrząsarce termicznej na cztery minuty, aby podgrzać ją do 39 stopni Celsjusza. Wymieszaj zawiesinę bakterii i roztwór agarozy w stosunku jeden do jednego, aby uzyskać stężenie agarozy 1% z zawiesiną komórkową 3,1 razy 10 do mocy sześciu komórek na mililitr.
Przygotować roztwór kontroli ujemnej do monitorowania zanieczyszczenia przy użyciu zawiesiny LB i agarozy w stosunku jeden do jednego. Uzyskaj pełną platformę przepływu typu open source, w tym sterowniki ciśnienia gazu i czujniki przepływu. Dołącz szklane szkiełko i grzałki końcówek pipet do zestawu, aby kontrolować temperaturę próbki komórek agarozy w momencie jej wprowadzania do chipa.
Następnie umieść chip mikroprzepływowy na stoliku mikroskopowym ze wzmocnieniem stroboskopowym, upewniając się, że widoczne jest złącze generowania kropel. Ustaw grzałkę końcówki do pipet i szklaną grzałkę szkiełka na 40 stopni Celsjusza za pomocą interfejsu oprogramowania sterującego. Za pomocą strzykawki z rurką i zatyczką PDMS załaduj 1% mieszaninę zawiesiny komórek agarozy do końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów.
Włóż końcówkę do grzałki końcówki i umieść ją na wlocie fazy wodnej w chipie mikroprzepływowym. Wymień uszczelkę PDMS końcówki na uszczelkę podłączoną do rurki systemu kontroli przepływu. Następnie włóż rurkę olejową do drugiego wlotu, a końcówkę rurki wylotowej do rurki odpływowej.
Następnie ustaw ciśnienie na 80 milibarów dla fazy przyzwolenia i oleju w interfejsie użytkownika i rozpocznij infuzję zawiesiny ogniw i oleju. Dostosuj fazę oleju do 320 milibarów, a fazę przyzwolenia do 180 milibarów. Odczekać jedną minutę na ustabilizowanie się wytwarzania kropel.
Gdy wytwarzanie kropel ustabilizuje się, przenieś rurkę wylotową z rurki odpływowej do rurki zbiorczej. Kontynuuj zbieranie kropelek na lodzie, aż zbiornik na próbkę będzie pusty. Po zebraniu umieść probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza na godzinę, aby agaroza mogła się żelować w kropelkach.
Inkubować mikrokropelki żelu zawierające bakterie i kropelki kontroli ujemnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny lub przez noc w celu wzrostu kolonii. Po inkubacji użyj trzymililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 21, aby ostrożnie usunąć jak najwięcej oleju z podstawy żelowej emulsji mikrokropelkowej. Przenieś 50 mikrolitrów mikrokropelek żelu do nowej mikroprobówki i przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dalszej analizy kropel, dodaj mieszaninę jeden do jednego oleju fluorowanego z PFO w objętości równej pozostałej emulsji.
Następnie dodaj około 200 mikrolitrów 0,9% buforu chlorku sodu na wierzch emulsji. Zmieszaj mieszaninę i krótko odwiruj ją w wirówce o stałej prędkości. Ostrożnie usuń fazę olejową z dolnej części granicy faz cieczy i wylej 100 mikrolitrów roztworu chlorku sodu od góry.
Przenieś dwa mikrolitry mikrokropelek żelu do szkiełka w komorze obrazowania i dodaj pięć mikrolitrów oleju fluorowanego, aby pomóc utworzyć monowarstwę kropelek dla optymalnego obrazowania. W mikroskopie włącz białe podświetlenie matrycy LED od góry, aby uzyskać obrazowanie w jasnym polu. Zamontuj przygotowaną prowadnicę.
Skoncentruj się na próbce, aby zlokalizować monowarstwę kropel i uchwycić obraz w jasnym polu. Następnie dostosuj koło filtrów, aby wyrównać je z zielonym filtrem długości fali. Przełącz się na 470-nanometrową diodę LED w celu wzbudzenia i bez przesuwania próbki uchwyć fluorescencyjny obraz kolonii.
Przenieś dwa mikrolitry mikrożeli barwionych jodkiem propidyny do chipa komory obrazowania i dodaj pięć mikrolitrów 0,9% roztworu chlorku sodu, aby utworzyć monowarstwę mikrożeli. Uszczelnij wlot i wylot chipa, aby zapobiec parowaniu podczas obrazowania. Dostosuj czerwony filtr interwału długości fali do obrazowania jodku propidyny i uchwyć obrazy jasnego pola i fluorescencji.
Enkapsulacja komórek w mikrokropelkach żelu została potwierdzona za pomocą mikroskopii jasnego pola, która pokazuje jednolite kropelki z wyraźnymi zamkniętymi komórkami. Kolonie, które utraciły fluorescencję kodowaną przez plazmid, zidentyfikowano za pomocą analizy współczynnika fluorescencji. Spośród 2 785 analizowanych kolonii, 100 kolonii straciło fluorescencję, co wskazuje na wskaźnik utraty plazmidu na poziomie 3,6%
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia otwartoźródłowy przepływ mikrofluidyczny do analizy zatrzymywania plazmidów w bakteriach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Metoda ta umożliwia precyzyjne ilościowe określenie obecności plazmidów w pojedynczych mikrokoloniach bakterii uwięzionych w żelowych mikrokropelkach, oferując skalowalną alternatywę dla tradycyjnych metod liczenia na płytkach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrofluidyka
- Biologia komórki
- Mikroskopia fluorescencyjna
Tło
- Techniki mikrofluidyczne umożliwiają wysokowydajną analizę populacji komórek.
- Tradycyjne metody często brakuje specyficzności i rozdzielczości.
- Żelowe mikrokropelki zapewniają wszechstronną platformę do analizy pojedynczych komórek.
- Podejścia otwartoźródłowe mogą demokratyzować dostęp do zaawansowanych metodologii.
Cel badania
- Opracowanie wysokowydajnej metody badania zatrzymywania plazmidów w bakteriach.
- Poprawa dostępności i przystępności cenowo technik analizy pojedynczych komórek.
- Zapewnić skalowalną alternatywę dla tradycyjnych metod hodowli.
Stosowane metody
- Przygotowanie mikrokropelek żelowych zawierających komórki bakterii.
- Wykorzystanie mikrofluidyki do generowania i manipulacji kropelkami.
- Mikroskopia fluorescencyjna do obrazowania i ilościowego określania zatrzymywania plazmidów.
- Analiza fluorescencji kolonii w celu określenia szybkości utraty plazmidów.
Główne wyniki
- Potwierdzono uwięzienie komórek w mikrokropelkach żelowych za pomocą mikroskopii jasnopolowej.
- Identyfikowano szybkość utraty plazmidów na poziomie 3,6% wśród analizowanych kolonii.
- Zadokumentowało skuteczność otwartoźródłowego przepływu do wysokowydajnej analizy.
- Dostarczono precyzyjnych statystyk dotyczących zatrzymywania plazmidów w różnych populacjach bakterii.
Wnioski
- Opracowany metoda poprawia badania nad społecznościami mikrobiologicznymi.
- Oferuje elastyczne i przystępne cenowo podejście do analizy pojedynczych komórek.
- Ten przepływ może być przyjęty przez naukowców o różnym poziomie ekspertyzy.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Plasmid stability is a critical parameter in synthetic biology and microbial engineering, directly impacting the reliability of engineered strains in biopharma R&D. High-throughput, quantitative analysis of plasmid retention without antibiotic selection enables robust target validation and de-risks early discovery workflows. Open-source droplet microfluidics democratizes access to advanced single-cell analytics, supporting scalable portfolio decisions and translational continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of plasmid stability in engineered microbial populations.
- Supports functional validation of genetic constructs under selection-free conditions.
- Provides high-resolution data for mechanistic de-risking of synthetic circuits.
- Facilitates predictive confidence in strain performance for downstream applications.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microbial systems for high-throughput screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative outputs for assay standardization.
- Enables parallel analysis of thousands of microcolonies, increasing statistical power.
- Supports scalable and reusable assay platforms for diverse genetic constructs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microbial system stability with translational biomarker strategies when relevant.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by quantifying genetic retention.
- Reduces risk of late-stage failure due to plasmid instability in engineered strains.
- Provides mechanistic insights for predictive de-risking in translational workflows.
Pipeline & Workflow Integration
This open-source microfluidic workflow integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling robust single-cell analytics from early target validation through assay development and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying plasmid retention at single-cell resolution.
- Screening: Delivers reproducible, high-throughput assay outputs for reliable compound or construct evaluation.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence-based measurements to compare genetic stability across conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by ensuring engineered strain fidelity.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, open-source platform adaptable to various genetic and microbial systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in engineered strain validation.
- Operational Value: Standardizes and scales single-cell analysis with accessible instrumentation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust genetic stability data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbial engineering projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, fluorescence microscopy, and microbial genetics.
- Needs open-source hardware for precise flow and temperature control.
- Demands cross-team standardization for reproducible data integration.
- Adaptable to various microbial models and genetic constructs with minimal modification.
- Limited by the need for fluorescence-based readouts and compatible imaging infrastructure.
