Name: Analiza stabilności plazmidu za pomocą mikrofluidyki kropelkowej typu open source (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Poznaj metodę analizy retencji plazmidów w bakteriach za pomocą mikrofluidyki kropelkowej typu open source. Technika umożliwia precyzyjną kwantyfikację obecności plazmidów w pojedynczych komórkach zawartych w mikrokropelkach żelu agarozowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest częścią finansowanych projektów przyznanych T.W. przez ANID FONDECYT Regular 1241621 oraz projekt Chang Zuckerberg Initiative 'Latin American Hub for Bioimaging Through Open Hardware'. T.W. jest również wdzięczny za finansowanie z CIFAR, jako Azrieli Global Scholar w programie CIFAR MacMillan Multiscale Human.

<ol><li>Wein, T., Hülter, N. F., Mizrahi, I., Dagan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+plasmid+stability+under+non-selective+conditions+maintains+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Emergence of plasmid stability under non-selective conditions maintains antibiotic resistance.</a> Nat Commun. 10 (1), 2595(2019).</li>
<li>Rodríguez-Beltrán, J., DelaFuente, J., León-Sampedro, R., MacLean, R. C., Millán, ÁS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+horizontal+gene+transfer%3A+The+role+of+plasmids+in+bacterial+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Beyond horizontal gene transfer: The role of plasmids in bacterial evolution.</a> Nat Rev Microbiol. 19 (6), 347(2021).</li>
<li>Wein, T., Dagan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmid evolution.</a> Curr Biol. 30 (19), R1158-R1163 (2020).</li>
<li>Chen, S., Larsson, M., Robinson, R. C., Chen, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+convenient+measurement+of+plasmid+stability+in+lab+and+clinical+isolates+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Direct and convenient measurement of plasmid stability in lab and clinical isolates of E. coli.</a> Sci Rep. 7 (1), 4788(2017).</li>
<li>Rouches, M. V., Xu, Y., Cortes, L. B. G., Lambert, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmid+system+with+tunable+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A plasmid system with tunable copy number.</a> Nat Commun. 13 (1), 3908(2022).</li>
<li>Silva, F., Queiroz, J. A., Domingues, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+metabolic+stress+and+plasmid+stability+in+plasmid+DNA+production+by+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Evaluating metabolic stress and plasmid stability in plasmid DNA production by Escherichia coli.</a> Biotechnol Adv. 30 (3), 691-708 (2012).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+novel+pJRD215-derived+plasmids+using+chloramphenicol+acetyltransferase+%28cat%29+gene+as+a+selection+marker+for+Acidithiobacillus+caldus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Construction of novel pJRD215-derived plasmids using chloramphenicol acetyltransferase (cat) gene as a selection marker for Acidithiobacillus caldus.</a> PLoS ONE. 12 (8), e0183307(2017).</li>
<li>Moragues, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Droplet-based microfluidics.</a> Nat Rev Methods Primers. 3 (1), 32(2023).</li>
<li>Vitalis, C., Wenzel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+interactions+in+microfluidic+droplets+for+enhanced+biotechnology+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Leveraging interactions in microfluidic droplets for enhanced biotechnology screens.</a> Current Opinion in Biotechnology. 82, 102966(2023).</li>
<li>Sinha, N., Subedi, N., Wimmers, F., Soennichsen, M., Tel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pipette-tip+based+method+for+seeding+cells+to+droplet+microfluidic+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A pipette-tip based method for seeding cells to droplet microfluidic platforms.</a> J Vis Exp. (144), e57848(2019).</li>
<li>Wenzel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+hardware%3A+From+DIY+trend+to+global+transformation+in+access+to+laboratory+equipment%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">Open hardware: From DIY trend to global transformation in access to laboratory equipment.</a> PLOS Biol. 21 (1), e3001931(2023).</li>
<li>Murillo, L. F. R., Wenzel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Welcome+to+the+journal+of+open+hardware%5BTitle%5D)+AND+%22J+Open+Hardware%22%5BJournal%5D)">Welcome to the journal of open hardware.</a> J Open Hardware. 1 (1), (2017).</li>
<li>Shin, J. H., Choi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+and+do-it-yourself+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Sens+Actuators+B+Chem%22%5BJournal%5D)">Open-source and do-it-yourself microfluidics.</a> Sens Actuators B Chem. 347, 130624(2021).</li>
<li>Pryszlak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+gut+microbiome+strains+for+cultivation-free+genome+sequencing+using+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Methods%22%5BJournal%5D)">Enrichment of gut microbiome strains for cultivation-free genome sequencing using droplet microfluidics.</a> Cell Rep Methods. 2 (1), 100137(2021).</li>
<li>Pollak, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+loop+assembly%3A+open%2C+efficient+and+cross-kingdom+DNA+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Universal loop assembly: open, efficient and cross-kingdom DNA fabrication.</a> Biology. 5 (1), (2020).</li>
<li>Volkmer, B., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condition-dependent+cell+volume+and+concentration+of+Escherichia+coli+to+facilitate+data+conversion+for+systems+biology+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Condition-dependent cell volume and concentration of Escherichia coli to facilitate data conversion for systems biology modeling.</a> PLoS ONE. 6 (7), e23126(2011).</li>
<li>Li, H., et al. Squid: Simplifying quantitative imaging platform development and deployment. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+H+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2020).</li>
<li>Abate, A. R., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faster+multiple+emulsification+with+drop+splitting%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Faster multiple emulsification with drop splitting.</a> Lab Chip. 11 (11), 1911-1915 (2011).</li>
<li>Lau, B. T. C., Malkus, P., Paulsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+quantitative+methods+for+measuring+plasmid+loss+rates+reveal+unexpected+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">New quantitative methods for measuring plasmid loss rates reveal unexpected stability.</a> Plasmid. 70 (3), 353-361 (2013).</li>
<li>Oellermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+hardware+in+science%3A+The+benefits+of+open+electronics%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Comp+Biol%22%5BJournal%5D)">Open hardware in science: The benefits of open electronics.</a> Integr Comp Biol. 62 (4), 1061-1075 (2022).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że żadne konkurencyjne interesy finansowe ani powiązania osobiste nie mogły mieć wpływu na pracę opisaną w tym artykule.

Wykazano, że metoda oparta na mikrokropelkach w żelu skutecznie identyfikuje i określa ilościowo kolonie z ekspresją genetyczną białek fluorescencyjnych kodowaną plazmidem i bez niej. Kolonie, które nie wykazują wystarczającej ekspresji produktu plazmidowego, są identyfikowane za pomocą fluorescencyjnego barwnika DNA (tutaj jodku propidyny), który barwi wszystkie kolonie i ma inną długość fali emisyjnej. Ta integracja mikrofluidyki kropelkowej, żelowania i mikroskopii fluorescencyjnej, wykorzystująca technologię open source, umożliwia realizację zaawansowanego przepływu pracy w wielu warunkach badawczych11,13. Pomyślne wygenerowanie mikrokropelek żelu umożliwia zaawansowane procesy pracy pojedynczej komórki w biologii molekularnej, w tym lizę komórek, amplifikację pojedynczego genomu, badania przesiewowe interakcji metabolicznych komórek, wymianę pożywek i wiele innych 8,9. Te zalety są wykorzystywane w tym protokole do hodowli, barwienia i analizowania mikrokolonii w bardziej skalowalny sposób niż w tradycyjnych testach opartych na płytkach.
Kroki krytyczne 
Proces enkapsulacji jest krytyczną i delikatną częścią protokołu. Precyzyjna kontrola stężeń składników, natężeń przepływu i ciśnień jest wymagana do wytworzenia jednolitych mikrożeli w określonym zakresie wielkości i kontrolowania średniej liczby komórek na kroplę. Ponadto utrzymanie stężenia i temperatury mieszanki komórkowo-agarozowej zapobiega zbrylaniu się lub przedwczesnemu żelowaniu. Kontrola temperatury ciekłej zawiesiny agarozowo-komórkowej w końcówce pipety jest szczególnie korzystną implementacją naszej sprzętowej stacji roboczej mikrofluidyki typu open source, która zapewnia znacznie łatwiejsze i bardziej niezawodne wytwarzanie mikrożelu w porównaniu z wysiłkami zmierzającymi do kontrolowania temperatury pomp strzykawkowych i przewodów. Ponieważ komórki są mieszane z pożywką wzrostową agarozy przed enkapsulacją i hodowlą, mikrożele agarozy muszą być wytwarzane szybko, aby uniknąć poważnych zmian stężenia komórek. W tym celu zoptymalizowano konstrukcję mikroprzepływowego chipa rozdzielającego kropelki, zainspirowaną przez Abate i wsp.18.
Modyfikacje i rozwiązywanie problemów
Konieczne było kilka kalibracji i modyfikacji, aby udoskonalić oryginalny protokół. Kapsułkowanie agarozy jest znacznie trudniejsze niż zwykłe kropelki wody w oleju, co wymaga zaprojektowania systemu utrzymującego agarozę w stanie ciekłym przy jednoczesnym zapewnieniu, że przepływ fazy wodnej osiąga jednorodny zakres wielkości cząstek. Zmiany lepkości agarozy spowodowane żelowaniem wpływają na szybkość przepływu, prowadząc do większych rozmiarów cząstek. Mikroskopia wymaga starannego doboru filtrów i źródeł światła, aby zapewnić nienakładające się na siebie sygnały wzbudzenia i emisji w celu wyraźnego rozróżnienia. Początkowo DAPI został wybrany do barwienia bakterii, ale jego sygnał emisyjny pokrywał się z sfGFP, co spowodowało, że sfGFP został wykryty w niebieskim kanale detekcji. Przeszliśmy na PI, ponieważ jego emisja jest dobrze oddzielona od sfGFP na długich falach (czerwone światło).
Podczas gdy utratę plazmidu określono ilościowo przy użyciu proponowanej metody, zastosowany plazmid sfGFP był nieoczekiwanie stabilny, nie wykazując prawie żadnych przypadków utraty plazmidu w pierwszym pokoleniu komórek hodowanych bez antybiotyków, nawet w warunkach stresowych, takich jak pożywka pH9 i inkubacja w temperaturze 40 °C. Obserwacja ta jest zgodna z ustaleniami innych grup badawczych 1,19. Stabilność plazmidu ograniczyła demonstrację pełnych możliwości kwantyfikacji metody dla początkowych generacji kultur komórkowych, ale wykazała, że metoda jest wystarczająco czuła, aby wykryć nawet niewielkie różnice w retencji plazmidu. Obserwacja stabilności wysokoplazmidowej u wczesnych generacji ma ważne implikacje dla kropelkowych badań przesiewowych mikroprzepływowych przy użyciu testu selekcji negatywnej, takiego jak hamowanie bakterii docelowych. Oznacza to, że utrata plazmidu celów selekcyjnych jest niskim źródłem fałszywie dodatnich wyników selekcji. Ze względu na to, że kropelkowe przesiewacze mikroprzepływowe zazwyczaj przewyższają inne sita o wysokiej przepustowości, takie jak przepływy pracy robotów pipetujących, o rzędy wielkości pod względem przepustowości, te rzadkie zdarzenia muszą być oceniane i brane pod uwagę.
Ograniczenia
Pomimo swoich zalet, prezentowana metoda ma swoje ograniczenia. Produkcja urządzeń mikroprzepływowych wymaga specjalistycznej wiedzy i skrupulatnej dbałości o szczegóły, a także ścisłej eksperymentalnej kontroli natężenia przepływu w celu zapewnienia deterministycznej wydajności enkapsulacji. Te aspekty mogą wymagać optymalizacji dla różnych konfiguracji eksperymentalnych. Chociaż metoda ta opiera się na mikroskopii fluorescencyjnej do wykrywania sygnałów, co wymaga dostępu do odpowiedniego sprzętu do obrazowania, sprzęt ten można wytwarzać przy użyciu sprzętu typu open source, co czyni go bardziej dostępnym. Co więcej, mikrożele mogą być przetwarzane w komercyjnej cytometrii przepływowej za pomocą dużych dysz, co jeszcze bardziej poprawia dostępność i przepustowość eksperymentalną. Do tej analizy cytometrycznej można również użyć sortowników kropelkowych.
Co więcej, chociaż metoda ta ma na celu wykrywanie sygnałów fluorescencyjnych z plazmidów, barwników lub innych markerów, ogranicza się do komórek, które można znakować fluorescencyjnie, co może nie mieć zastosowania do wszystkich szczepów bakteryjnych lub warunków eksperymentalnych. Metodę tę można jednak dostosować do innych rodzajów mikroskopii, takich jak mikroskopia z kontrastem fazowym lub mikroskopia jasnego pola, co pozwala na zastosowania fenotypowania wykraczające poza fluorescencję. Dodatkowo można go łączyć z technikami spektroskopowymi, takimi jak FTIR lub spektroskopia Ramana, rozszerzając jego możliwości w zakresie analizy składu chemicznego i informacji strukturalnych zamkniętych komórek. Adaptacje te poszerzają zakres jego zastosowania, czyniąc go wszechstronnym narzędziem dla różnych środowisk badawczych.
Znaczenie i zastosowania
Tradycyjne testy utraty plazmidu19 nie pozwalają na dobre określenie ilościowe stosunku komórek, które utraciły swoją ekspresję, informacje, które mogą być bardzo ważne w projektowaniu metod eksperymentalnych i różnych zastosowaniach biologicznych. Zazwyczaj typy kolonii są wyliczane w testach na płytkach agarowych, w których można uzyskać dobrze zdefiniowane izolowane kolonie, jak pokazano na rysunku 4. Jednak nakładające się na siebie kolonie są trudne do zidentyfikowania z całą pewnością; W naszych rękach nie zawsze uzyskujemy optymalną gęstość kolonii, a wiele płytek jest niezbędnych do uzyskania dobrych statystyk zdarzeń utraty plazmidów o niskiej częstotliwości. Proponowana metoda oferuje bardziej niezawodne podejście do dokładnego ilościowego oznaczania sygnałów fluorescencyjnych pochodzących z izolowanych kolonii o większej liczbie kolonii niż metody analogowe z płytką agarową, ponieważ w mikrokropelkach kolonie rozwijają się oddzielnie, są mniejsze i można je łatwo załadować do komór obrazowania, umożliwiając ilościowe określanie liczby dużych kolonii w oparciu o mikroskopię lub cytometrię przepływową. Może to znacznie poprawić statystyczną reprezentację metody i umożliwić integrację z innymi przepływami pracy z mikrokroplami żelu.
Wykorzystanie sprzętu typu open source11,20 pozwala naukowcom dostosować projekt mikroprzepływowej stacji roboczej i precyzyjnie dostosować szczura przepływu; W związku z tym wielkość cząstek obsługuje różne typy komórek i warunki eksperymentalne. Elastyczność ta rozciąga się na potencjalne włączenie innych typów mikroskopii, takich jak mikroskopia z kontrastem fazowym lub spektroskopia, co rozszerza możliwości zastosowania tej metody. Zdolność metody do oceny stabilności plazmidu w różnych warunkach ma kluczowe znaczenie dla zastosowań wymagających retencji plazmidu bez selekcji antybiotyków, w określonych warunkach stresu lub różnych generacjach kultur. Wszechstronność i zdolność adaptacji prezentowanej metody sprawiają, że jest ona cenna dla różnorodnych zastosowań badawczych w dziedzinach takich jak biologia syntetyczna, monitorowanie środowiska i diagnostyka kliniczna2.

Plazmidy są niezbędnymi elementami genetycznymi w komórkach prokariotycznych, znacząco przyczyniając się do ewolucji mikroorganizmów poprzez boczny transfer DNA i szybką adaptację do zmian środowiskowych1,2. Te pozachromosomalne cząsteczki DNA zawierają geny, które zapewniają korzystne cechy, takie jak oporność na antybiotyki, funkcje metaboliczne i czynniki wirulencji, co czyni je cennymi dla badań mikrobiologicznych, biologii syntetycznej i badań nad ewolucją2. Jednak utrzymanie plazmidu w populacjach komórek jest trudne ze względu na obciążenie metaboliczne związane z replikacją i segregacją, często skutkujące utratą plazmidu bez presji selekcyjnej3. Dodatkowo, stabilne dziedziczenie wymaga mechanizmów, takich jak systemy toksyna-antytoksyna i partycjonowanie, co komplikuje utrzymanie plazmidu. Ocena stabilności plazmidu w różnych warunkach ma kluczowe znaczenie zarówno dla badań podstawowych, jak i zastosowań praktycznych, które wykorzystują plazmidy jako podstawowy element badań4,5. Większość obecnych metod oceny stabilności plazmidu ma znaczące ograniczenia: metody oparte na cytometrii przepływowej dostarczają pośrednich danych na poziomie populacji, wymagają drogiego sprzętu i nie mają bezpośredniej wizualizacji kolonii6. Masowe metody transkryptomiki i proteomiki są kosztowne, zapewniają tylko średnie odpowiedzi komórkowe i nie mogą bezpośrednio określić ilościowo retencji plazmidu w poszczególnych koloniach6. Tradycyjne metody, takie jak seryjne rozcieńczanie i pasażowanie, są proste, ale czasochłonne i brakuje im precyzji i reprezentatywności7. Ogólnie rzecz biorąc, ilościowe wnioskowanie lub prognozowanie liczby kolonii, które zachowują określony funkcjonalny plazmid w czasie lub pod presją selekcyjną, pozostaje wyzwaniem.
Aby sprostać tym wyzwaniom, przedstawiono nowatorski przepływ pracy mikroprzepływowej wykorzystujący otwarte instrumenty badawcze do ilościowego określania sygnałów fluorescencyjnych w wielu izolowanych koloniach bakterii, używając Escherichia coli jako modelu. Metoda ta pozwala na wysokoprzepustową i precyzyjną analizę retencji plazmidu w różnych warunkach lub ciśnieniach selekcyjnych. Analiza rozdzielczości pojedynczej komórki zapewnia precyzyjną metodę manipulowania izolowanymi koloniami, dostarczając wrażliwych danych na temat kwantyfikacji plazmidu, które mogą pomóc w ocenie wskaźników retencji i straty4.
Mikrofluidyka, szczególnie mikrofluidyka kropelkowa, stała się potężnym narzędziem do hermetyzacji i manipulowania pojedynczymi komórkami w kontrolowanych środowiskach8. W szczególności kropelki mikrożelu mogą otaczać pojedyncze komórki w celu uzyskania wysokiej przepustowości i precyzyjnej analizy bez konieczności utrzymywania kropelek zawieszonych w oil9, co pozwala na kontrolowane badanie dynamiki plazmidu w określonym mikrośrodowisku. Po enkapsulacji zawiesin komórkowych bezpośrednio z końcówki pipety10, techniki fluorescencji mogą być stosowane do monitorowania wzrostu mikrokolonii w kropelkach, umożliwiając szczegółową analizę retencji i segregacji plazmidu pod różnymi ciśnieniami selekcyjnymi3.
Zalety tej metody w porównaniu z tradycyjnymi technikami hodowli masowej obejmują zwiększoną precyzję, zmniejszoną zmienność i możliwość przeprowadzania analiz o wysokiej przepustowości. Technologia mikroprzepływów typu open source pokonuje ograniczenia kosztownych systemów własnościowych, takie jak problemy z dostępnością, zdolnością adaptacji i konserwacją, które często utrudniają postęp badań11,12,13. Demonstrując, jak zastosować zaawansowany eksperymentalny przepływ pracy analizy retencji plazmidu w mikrożelach za pomocą oprzyrządowania typu open source, zapewniono dostępną i niezawodną metodę badań w zakresie biologii plazmidowej, zastosowań biologii syntetycznej i technik analizy kropel mikroprzepływowych.
Podsumowując, ten artykuł przedstawia przystępną metodę ilościowej oceny retencji plazmidu u E. coli o wysokiej mocy statystycznej. Możliwości tej metody sprawiają, że jest ona cennym narzędziem do pogłębiania wiedzy na temat biologii plazmidów i ulepszania zastosowań biologii syntetycznej.

<table><tbody><tr><td>1H,1H,2H,2H-Perfluoro-1-oktanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>370533-25G</td><td>Do rozbijania emulsji</td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td></td><td></td><td>Do przenikania komórek</td></tr><tr><td>Agar-Agar</td><td>Winkler</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz</td><td></td><td></td> do biopsji <td>0,75 mm i 1,8 mm</td></tr><tr><td>Niebieski transiluminator LED</td><td>IO Rodeo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówka do hodowli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eksykator</td><td></td><td></td> 15 ml <td>Z pompą próżniową</td></tr><tr><td>Jednorazowy kubek</td><td></td><td></td><td>Do mieszania PDMS</td></tr><tr><td>Jednorazowy widelec</td><td></td><td></td><td>Do mieszania PDMS</td></tr><tr><td>E. coli Szczep</td><td></td><td></td><td></td>TOP10</tr><tr><td>Mikroskop FluoPi</td><td>https://github.com/wenzel-lab/FluoPi</td><td></td><td>Zielony system obrazowania fluorescencyjnego do analizy płytek</td></tr><tr><td>Olej fluorowany</td><td>3M</td><td></td><td>Novec 7500</td></tr><tr><td>Szklana grzałka ślizgowa</td><td>https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller/tree/master/module-heating-and-stirring</td><td></td><td>Do kontrolowania temperatury na poziomie 40 & stopni; C z chipem mikroprzepływowym</td></tr><tr><td>Szkiełka szklane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>Mechaniczna</td><td></td><td>Do odparowywania Aquapel</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>Fiji/ImageJ</td><td></td><td>2.14.0/1.54f</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Mundo Lab</td><td></td><td>MLAB Scientific / Do inkubacji płytek i mikrożeli&nbsp;</td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td></td><td></td><td>Do czyszczenia szkiełek Stężenie</td></tr><tr><td>Kanamycyny</td><td></td><td></td><td>100 ug/ml</td></tr><tr><td>Rozsiewacz</td><td></td><td></td> w kształcie litery L <td>Do rozprowadzania bakterii na płytkach agarowych</td></tr><tr><td>Forma</td><td></td><td></td> główna <td>Wzór chipa na wafli silikonowej lub szklanej</td></tr><tr><td>Mikroprobówki</td><td></td><td></td><td>2 ml</td></tr><tr><td>roztworu</td><td></td><td></td> NaCl <td>Sód chlorek 0,9% w/v</td></tr><tr><td>https://github.com/wenzel-lab/flow-microscopy-platformStolik</td><td></td><td>mikroskopii stroboskopowej o otwartym kodzie źródłowym</td><td>Do mikroskopii w jasnym polu</td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>Citotest</td><td>2303-1090</td><td>90 x 15 mm</td></tr><tr><td>Grzałka końcówki do pipet</td><td>https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller/tree/master/module-heating-and-stirring</td><td></td><td>Do kontrolowania temperatury na poziomie 40 & deg; C końcówki pipety</td></tr><tr><td>Myjka plazmowa</td><td>Diener Electronic</td><td>117056</td><td>Do klejenia PDMS za pomocą szkiełka</td></tr><tr><td>Plazmid pCA_Odd1</td><td></td><td></td><td>Koduje oporność na sfGFP i kanamycynę</td></tr><tr><td>Rurki z politetrafluoroetylenu (PTFE)</td><td>Adtech Polymer Engineering Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wstępnie zmieszane medium Luria Bertoni</td><td>US Biological Life Science</td><td>L1520</td><td></td></tr><tr><td>Propidium jodek (PI)</td><td></td><td></td><td>Do barwienia</td></tr><tr><td>System regulatora ciśnienia i przepływu oparty na Raspberry Pi</td><td>https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller</td><td></td><td>Do kontrolowania ciśnienia i natężenia przepływu</td></tr><tr><td>Podstawa elastomeru silikonowego</td><td>Zestaw Sylgard</td><td></td><td>PDMS - 184 Zestaw elastomerów</td></tr><tr><td>silikonowych Utwardzacz z elastomeru silikonowego</td><td>Sylgard</td><td></td><td>PDMS kit - 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td></td><td></td><td>Do pomiaru absorbancji</td></tr><tr><td>Mikroskop SQUID</td><td>https://github.com/wenzel-lab/SQUID-bioimaging-platform</td><td></td><td>System obrazowania multifluorescencyjnego do analizy barwionych komórek</td></tr><tr><td>Sterylna pętla</td><td></td><td></td><td>Do zbierania kolonii i powlekania smugami</td></tr><tr><td>Środek powierzchniowo czynny</td><td>Fluidics</td><td></td><td>Sphere Pico-Surf</td></tr><tr><td>Strzykawki</td><td>NIPRO</td><td></td><td>Z filtrami i rurkami</td></tr><tr><td>Wytrząsarka z kontrolowaną temperaturą</td><td>Pęseta</td><td></td>Mundo Lab <td></td> DLAB HCM100-Pro</tr><tr><td>Ultra-niska temperatura żelowania agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576-5G</td><td>Do generowania kulek hydrożelowych</td></tr> Roztwór <tr><td></td> hydrofobowy (fluoroalkilosilan)Aquapel Do leczenia <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> mikrokanały urządzenia PDMS</td></tr></tbody></table>

analiza stabilności plazmidu za pomocą mikrofluidyki kropelkowej typu open source

Plasmid Stability Analysis with Open-Source Droplet Microfluidics

Plazmidy odgrywają istotną rolę w biologii syntetycznej, umożliwiając wprowadzanie i ekspresję obcych genów w różnych organizmach, ułatwiając w ten sposób budowę obwodów biologicznych i ścieżek wewnątrz i pomiędzy populacjami komórek. W przypadku wielu zastosowań utrzymanie funkcjonalnych plazmidów bez selekcji antybiotyków ma kluczowe znaczenie. Badanie to wprowadza otwarty, sprzętowy mikroprzepływowy przepływ pracy do analizy retencji plazmidu poprzez hodowlę pojedynczych komórek w mikrokropelkach żelu i ilościowe określanie mikrokolonii za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Takie podejście pozwala na równoległą analizę wielu kropel i mikrokolonii, zapewniając większą moc statystyczną w porównaniu z tradycyjnym liczeniem płytek i umożliwiając integrację testu z innymi przepływami pracy mikroprzepływowymi kropel. Stosując plazmidy wyrażające białka fluorescencyjne wraz z niespecyficznym fluorescencyjnym barwieniem DNA, pojedyncze kolonie można zidentyfikować i zróżnicować na podstawie utraty plazmidu lub ekspresji markera fluorescencyjnego. Warto zauważyć, że ten zaawansowany przepływ pracy, zaimplementowany za pomocą sprzętu typu open source, oferuje precyzyjną kontrolę przepływu i zarządzanie temperaturą zarówno próbki, jak i chipa mikroprzepływowego. Funkcje te zwiększają łatwość obsługi, niezawodność i dostępność przepływu pracy. Chociaż badanie koncentruje się na Escherichia coli jako modelu eksperymentalnym, prawdziwy potencjał metody tkwi w jej wszechstronności. Może być przystosowany do różnych badań wymagających kwantyfikacji sygnału fluorescencji z plazmidów lub barwników, a także do innych zastosowań. Przyjęcie sprzętu typu open source poszerza potencjał przeprowadzania wysokoprzepustowych analiz biologicznych przy użyciu dostępnej technologii w różnych warunkach badawczych.

Walidacja enkapsulacji komórek i tworzenia mikrokolonii
Enkapsulację komórek można potwierdzić wizualnie, wykonując mikroskopię w polu jasnym mikro kropli żelu przed rozbiciem emulsji i przemyciem mikrogeli. Reprezentatywny wynik emulsji na tym etapie przedstawiono na Rysunku 4.
<img alt="Mikrokrople mikrofluidyczne z zieloną fluorescencją, obraz mikroskopowy dla badania enkapsulacji komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67659/67659fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Fragment nałożonego obrazu z mikroskopii fluorescencyjnej. Po inkubacji przez noc reprezentatywne mikrokolonie E. coli wykazujące ekspresję sfGFP wewnątrz żelowych mikrokropli. Użyto obiektywu mikroskopowego o powiększeniu 10x i NA 0,30. Pasek skali: 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67659/67659fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Wyniki analizy obrazu
Po zabarwieniu mikrogeli oraz pozyskaniu obrazów w świetle przechodzącym oraz w kanałach fluorescencyjnych w kilku pozycjach, możliwe jest zwizualizowanie kolonii zidentyfikowanych jako negatywne na obrazach pierwotnych (patrz Rysunek 5A). Dane wyekstrahowane ze wszystkich obrazów jednego eksperymentu można przedstawić na wykresie w celu ukazania stosunku fluorescencji różnych kolonii, co pozwala wyróżnić te, które utraciły fluorescencję kodowaną przez plazmid (patrz Rysunek 5B). Wyniki wskazują, że 100 kolonii utraciło plazmid lub funkcjonalność plazmidu z całkowitej liczby 2785 analizowanych mikrokolonii, co odpowiada 3,6%.
<img alt="Analiza komórek, obraz mikroskopii fluorescencyjnej i wykres rozrzutu; dane fluorescencji zielonej vs czerwonej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67659/67659fig5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Ilościowe oznaczenie negatywnych mikrokolonii. (A) Fragment nałożonego obrazu z mikroskopii fluorescencyjnej. Po usunięciu oleju i barwieniu, reprezentatywne kolonie w mikrogelach wykazujące ekspresję sfGFP oraz dwie kolonie negatywne wykazały czerwoną fluorescencję barwnika DNA (obwiedzione czarną linią). Pasek skali: 100 µm. (B) Wykres rozrzutu wartości fluorescencji poszczególnych mikrokolonii wyekstrahowanych z 16 wielokanałowych obrazów mikroskopowych. Kolonie bez fluorescencji zielonej uznano za negatywne, co zaznaczono kolorem czerwonym na wykresie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67659/67659fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Ilościowe oznaczenie płytek agarowych
Zdjęcia trzech powtórnych szalek przedstawiono na Rysunku 6, gdzie białe strzałki wskazują kolonie niefluorescencyjne. Na pierwszej szalce (Rysunek 6A) widocznych było łącznie 213 kolonii, z czego 1 nie była fluorescencyjna. Na drugiej szalce (Rysunek 6B) znajdowało się łącznie 49 kolonii i nie stwierdzono kolonii niefluorescencyjnych. Na trzeciej szalce (Rysunek 6C) widocznych było łącznie 252 kolonie, z których 6 nie było fluorescencyjnych. Wyniki te odpowiadają średniej częstości utraty plazmidu przez kolonie na poziomie 2,3%, przy dużym odchyleniu standardowym wynoszącym 3,2.
<img alt="Wzrost kolonii bakteryjnych na płytkach agarowych; analiza fluorescencyjna; wyniki eksperymentu porównujące próbki A, B, C." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67659/67659fig6.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Identyfikacja kolonii negatywnych na płytkach. (A–C) Fluorescencyjne i niefluorescencyjne kolonie E. coli na płytkach z agarem LB (średnica: 90 mm, wysokość: 15 mm). Inokulum, pochodzące z zapasu E. coli z sfGFP przechowywanego w -80 °C, zostało wysiałe w 1. dniu, hodowane z antybiotykiem w 2. dniu, a następnie codziennie rozcieńczane 1:100 od 3. do 6. dnia, aby umożliwić utratę plazmidu. Kolonie inkubowano w 37 °C przez 24 h i obrazowano w komorze FluoPi. Kolonie niefluorescencyjne zostały uwydatnione w programie GIMP i wskazane białymi strzałkami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67659/67659fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Dostępny przepływ pracy mikroprzepływów o otwartym kodzie źródłowym jest prezentowany do równoległej analizy retencji plazmidu u bakterii. Dzięki zastosowaniu mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego określenia obecności plazmidu w mikrokoloniach jednokomórkowych w mikrokropelkach żelu, metoda ta stanowi precyzyjną, dostępną i skalowalną alternatywę dla tradycyjnego liczenia płytek.

Analiza stabilności plazmidu za pomocą mikrofluidyki kropelkowej typu open source

Plasmids play a vital role in synthetic biology by enabling the introduction and expression of foreign genes in various organisms, thereby facilitating ...

Opracowujemy wysokoprzepustowe mikrofilne metody IC do badania różnorodności populacji komórek i interakcji między komórkami. W tym kontekście, mikrokropelki żelu umożliwiają nam wykonywanie użytecznych kroków protokołu, takich jak manipulacja DNA barwiącym lizę i mikroskopia w wysoce sparaliżowany sposób w uwięzionych komórkach. Mikrofilne przepływy pracy kropelkowe są znane z bardzo wysokiej przepustowości i wszechstronności, ale ich zastosowanie jest często ograniczone przez potrzebę wysokiej klasy oprzyrządowania i specjalistycznej wiedzy.Nasz protokół ulepsza tradycyjne techniki wykorzystujące wysokowydajną analizę pojedynczych komórek z barwieniem fluorescencyjnym i dostępny przepływ pracy mikroskopii typu open source. Zamyka komórki w mikrokropelkach żelu za pomocą mikrofluidyki, aby jednocześnie analizować minikomórki i mikrokolonie. Podczas gdy kulturom masowym i płytkowym brakuje specyficzności i rozdzielczości, metoda ta zapewnia precyzyjne i reprezentatywne statystyki różnych zjawisk.Nasze protokoły łączą mikrofluidykę kropelkową, mikroskopię fluorescencyjną i sprzęt typu open source w metodzie opartej na znacznikach. Takie podejście sprawia, że analiza pojedynczych komórek jest bardziej elastyczna i przystępna cenowo, umożliwiając społeczności naukowej zajęcie się złożonymi pytaniami naukowymi dotyczącymi społeczności drobnoustrojów. Na początek podgrzej agarozę o bardzo niskiej temperaturze żelowania w stężeniu od 2% do 90 stopni Celsjusza w bulionie Luria Bertani lub LB.Potrząsaj mieszaniną przez 10 minut w shakerze o kontrolowanej temperaturze, a następnie zmniejsz temperaturę wytrząsarki termicznej do 39 stopni Celsjusza, aby schłodzić roztwór agarozy. Umieść rurkę z zawiesiną Escherichia coli w wytrząsarce termicznej na cztery minuty, aby podgrzać ją do 39 stopni Celsjusza. Wymieszaj zawiesinę bakterii i roztwór agarozy w stosunku jeden do jednego, aby uzyskać stężenie agarozy 1% z zawiesiną komórkową 3,1 razy 10 do mocy sześciu komórek na mililitr.Przygotować roztwór kontroli ujemnej do monitorowania zanieczyszczenia przy użyciu zawiesiny LB i agarozy w stosunku jeden do jednego. Uzyskaj pełną platformę przepływu typu open source, w tym sterowniki ciśnienia gazu i czujniki przepływu. Dołącz szklane szkiełko i grzałki końcówek pipet do zestawu, aby kontrolować temperaturę próbki komórek agarozy w momencie jej wprowadzania do chipa.Następnie umieść chip mikroprzepływowy na stoliku mikroskopowym ze wzmocnieniem stroboskopowym, upewniając się, że widoczne jest złącze generowania kropel. Ustaw grzałkę końcówki do pipet i szklaną grzałkę szkiełka na 40 stopni Celsjusza za pomocą interfejsu oprogramowania sterującego. Za pomocą strzykawki z rurką i zatyczką PDMS załaduj 1% mieszaninę zawiesiny komórek agarozy do końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów.Włóż końcówkę do grzałki końcówki i umieść ją na wlocie fazy wodnej w chipie mikroprzepływowym. Wymień uszczelkę PDMS końcówki na uszczelkę podłączoną do rurki systemu kontroli przepływu. Następnie włóż rurkę olejową do drugiego wlotu, a końcówkę rurki wylotowej do rurki odpływowej.Następnie ustaw ciśnienie na 80 milibarów dla fazy przyzwolenia i oleju w interfejsie użytkownika i rozpocznij infuzję zawiesiny ogniw i oleju. Dostosuj fazę oleju do 320 milibarów, a fazę przyzwolenia do 180 milibarów. Odczekać jedną minutę na ustabilizowanie się wytwarzania kropel.Gdy wytwarzanie kropel ustabilizuje się, przenieś rurkę wylotową z rurki odpływowej do rurki zbiorczej. Kontynuuj zbieranie kropelek na lodzie, aż zbiornik na próbkę będzie pusty. Po zebraniu umieść probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza na godzinę, aby agaroza mogła się żelować w kropelkach.Inkubować mikrokropelki żelu zawierające bakterie i kropelki kontroli ujemnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny lub przez noc w celu wzrostu kolonii. Po inkubacji użyj trzymililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 21, aby ostrożnie usunąć jak najwięcej oleju z podstawy żelowej emulsji mikrokropelkowej. Przenieś 50 mikrolitrów mikrokropelek żelu do nowej mikroprobówki i przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dalszej analizy kropel, dodaj mieszaninę jeden do jednego oleju fluorowanego z PFO w objętości równej pozostałej emulsji.Następnie dodaj około 200 mikrolitrów 0,9% buforu chlorku sodu na wierzch emulsji. Zmieszaj mieszaninę i krótko odwiruj ją w wirówce o stałej prędkości. Ostrożnie usuń fazę olejową z dolnej części granicy faz cieczy i wylej 100 mikrolitrów roztworu chlorku sodu od góry.Przenieś dwa mikrolitry mikrokropelek żelu do szkiełka w komorze obrazowania i dodaj pięć mikrolitrów oleju fluorowanego, aby pomóc utworzyć monowarstwę kropelek dla optymalnego obrazowania. W mikroskopie włącz białe podświetlenie matrycy LED od góry, aby uzyskać obrazowanie w jasnym polu. Zamontuj przygotowaną prowadnicę.Skoncentruj się na próbce, aby zlokalizować monowarstwę kropel i uchwycić obraz w jasnym polu. Następnie dostosuj koło filtrów, aby wyrównać je z zielonym filtrem długości fali. Przełącz się na 470-nanometrową diodę LED w celu wzbudzenia i bez przesuwania próbki uchwyć fluorescencyjny obraz kolonii.Przenieś dwa mikrolitry mikrożeli barwionych jodkiem propidyny do chipa komory obrazowania i dodaj pięć mikrolitrów 0,9% roztworu chlorku sodu, aby utworzyć monowarstwę mikrożeli. Uszczelnij wlot i wylot chipa, aby zapobiec parowaniu podczas obrazowania. Dostosuj czerwony filtr interwału długości fali do obrazowania jodku propidyny i uchwyć obrazy jasnego pola i fluorescencji.Enkapsulacja komórek w mikrokropelkach żelu została potwierdzona za pomocą mikroskopii jasnego pola, która pokazuje jednolite kropelki z wyraźnymi zamkniętymi komórkami. Kolonie, które utraciły fluorescencję kodowaną przez plazmid, zidentyfikowano za pomocą analizy współczynnika fluorescencji. Spośród 2 785 analizowanych kolonii, 100 kolonii straciło fluorescencję, co wskazuje na wskaźnik utraty plazmidu na poziomie 3,6%

plasmid-stability-analysis-with-open-source-droplet-microfluidics

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Urządzenia mikrofluidyczne mogą być wykorzystywane do wizualizacji złożonych procesów naturalnych w czasie rzeczywistym i w odpowiednich skalach fizycznych. Opracowaliśmy proste urządzenie mikrofluidyczne, które naśladuje kluczowe cechy naturalnych ośrodków porowatych, służące do badania wzrostu i transportu bakterii w podłożu gruntowym.

Okno na mikroświat: Proste systemy mikrofluidyczne do badania transportu drobnoustrojów w ośrodkach porowatych

Mikrofluidyczne platformy kropelkowe są obiecującymi narzędziami do eksperymentów wysokoprzepustowych, ponieważ umożliwiają one niskokosztowe generowanie piko-litrowych, samoczynnie odseparowanych komór z częstotliwością rzędu kHz. Dzięki integracji z szybkimi, czułymi i wysokorozdzielczymi metodami spektroskopii fluorescencyjnej, duże ilości informacji generowanych w tych systemach mogą być efektywnie wydobywane, przetwarzane i wykorzystywane.

Metody detekcji fluorescencyjnej dla mikroprzepływowych platform kroplkowych

Przedstawiamy prostą metodę wytwarzania urządzeń mikrofluidycznych zdolnych do stosowania podobnych warunków dynamicznych w odniesieniu do wielu odrębnych szczepów, bez konieczności korzystania z pomieszczeń typu clean room lub litografii miękkiej.

Urządzenie mikroprzepływowe do badania wielu odrębnych szczepów

Źródło: Hemmerich, J. i in. Protokół optymalizacji heterologicznego wytwarzania białek z wykorzystaniem zautomatyzowanej technologii mikrobioreaktorów. J. Vis. Exp. (2017).Ten film pokazuje użycie zautomatyzowanego mikrobioreaktora do monitorowania wzrostu bakterii i wydzielania białek fluorescencyjnej w odpowiedzi na różne formuły mediów. Genetycznie zmodyfikowana bakteria ekspresyjna wydzielniowa fluorescencja jest hodowana pod antybiotykowym selekcją i zaszczepiana w dołkach o zróżnicowanych...

Monitorowanie wzrostu bakterii w różnych formułach ośrodka za pomocą zautomatyzowanego mikrobioreaktora

W tym protokole przedstawiono produkcję, konfigurację i podstawowe działanie mikroprzepływowego bioreaktora pikolitrowego (PLBR) do analizy pojedynczych komórek mikroorganizmów prokariotycznych. Mikroorganizmy istotne z przemysłowego punktu widzenia zostały przeanalizowane jako dowód zasadności, co pozwoliło na wgląd w tempo wzrostu, morfologię i niejednorodność fenotypową w określonych okresach czasu, co jest prawie niemożliwe przy użyciu konwencjonalnych metod.

Mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy mikrobiologicznej pojedynczych komórek: produkcja, konfiguracja systemu i obsługa

Opisujemy cyfrowy test końcowy do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych za pomocą uproszczonego (analogowego) odczytu. Mierzymy fluorescencję masową kropelkowych testów cyfrowych za pomocą standardowej maszyny qPCR, a nie specjalistycznego oprzyrządowania, i potwierdzamy nasze wyniki za pomocą mikroskopii.

Prosty masowy odczyt cyfrowych testów ilościowych kwasów nukleinowych

Ta praca dostarcza metody wytwarzania platform mikroprzepływowych opartych na kropelkach oraz zastosowania mikrosfer poliakrylamidowych do amplifikacji mikrosferycznej PCR. Metoda microsphere-PCR umożliwia otrzymanie jednoniciowych amplikonów DNA bez rozdzielania dwuniciowego DNA.

Podejście mikroprzepływowe oparte na kropelkach i amplifikacja mikrosferyczno-PCR dla jednoniciowych amplikonów DNA

Nasze eksperymentalne podejście dostarcza strategię śledzenia obfitości plazmidów i oporności na antybiotyki w czasie w populacjach bakterii.

Kwantyfikacja oporności na antybiotyki za pośrednictwem plazmidu w podejściu ewolucji eksperymentalnej

Ogólnym celem protokołu jest przygotowanie ponad miliona uporządkowanych, jednolitych, stabilnych i biokompatybilnych kropel femtolitru na płaskim podłożu o powierzchni 1cm2, który może być użyty do syntezy białek bez komórek.

Femtolitrowa matryca kropelkowa do masowo równoległej syntezy białek z pojedynczych cząsteczek DNA

Prezentacja dwuwarstwowego urządzenia opartego na polidimetylosiloksanie (PDMS) do produkcji bibliotek kombinatorycznych w emulsjach (korkach) typu woda w oleju jest przedstawiona. Niezbędny sprzęt i oprogramowanie wymagane do automatyzacji produkcji zatyczek jest szczegółowo opisane w protokole, a także pokazano produkcję ilościowej biblioteki zatyczek fluorescencyjnych.

Dwuwarstwowe urządzenie mikroprzepływowe do kombinatorycznej produkcji korków

Ten protokół przedstawia standardowy przepływ wysokowydajnego przesiewania dla mikroorganizmów przemysłowych. Obejmuje ono konstruowanie biblioteki mutantów poprzez mutagenezę ARTP, przeprowadzanie pozytywnego przesiewania kropel za pomocą zautomatyzowanych mikrofluidów i następnie weryfikację wyników. Niezawodność przepływu została zweryfikowana poprzez przesiewanie wysokowydajnych szczepów B. coagulans.

Przesiewowe badanie wysokowydajne mutantów Bacillus coagulans hiperprodukujących kwas L-mlekowy za pomocą zautomatyzowanej platformy mikrofluidycznej kroplowej

Poznaj metodę analizy retencji plazmidów w bakteriach za pomocą mikrofluidyki kropelkowej typu open source. Technika umożliwia precyzyjną kwantyfikację obecności plazmidów w pojedynczych komórkach zawartych w mikrokropelkach żelu agarozowego.

Analiza stabilności plazmidu za pomocą mikrofluidyki kropelkowej typu open source

Przeglądaj więcej filmów