Cyfrowa platforma mikroprzepływowa oparta na elektrozwilżaniu do zautomatyzowanego testu immunoenzymatycznego

Automatyzacja aktywacji poszczególnych kropel pozwala na przeniesienie złożonych sekwencji działania jednostki laboratoryjnej do jednego chipa. Nasza cyfrowa platforma mikroprzepływowa zajmuje się szybkim, specyficznym wykrywaniem patogenów wirusowych w terenie. Metoda ta opiera się na ilościowym wykrywaniu określonych antygenów za pomocą mikrofluidyki cyfrowej opartej na EWOD w połączeniu z immunoprecypitacją magnetyczną.

W tym artykule metoda jest oceniana na próbkach zawierających różne stężenia bakterii, zarodników, wirusów i białek. Proces ten jest w pełni zautomatyzowany, sekwencyjny, skalowalny i wszechstronny. Sekwencja i objętość kropli mogą być modyfikowane w celu dopasowania do wymagań określonego protokołu.

Całkowicie rezygnując z wykrywania opartego na przeciwciałach, cyfrowa platforma mikrofluidyczna może stać się potencjalnym zastosowaniem opartym na biodetekcji aptamerowej, w której kulki magnetyczne przenoszą określone aptamery do wychwytywania i wykrywania sekwencji nukleotydowych. Wypróbowując tę technikę po raz pierwszy, ważne jest, aby wziąć pod uwagę rodzaj środka powierzchniowo czynnego i jego interakcję z wybraną biochemią i hydrofobową powłoką polimerową. Zacznij od wyjęcia magnesu z platformy cyfrowej mikrofluidyki lub DMF i umieszczenia go na stole.

Umieść czystą płytkę uruchamiającą na obracającym się stage z chromem skierowanym do góry, wyrównując płytkę z lewym górnym rogiem wpuszczanego stolika. Zacisnąć płytkę uruchamiającą od góry za pomocą panelu z 47 kołkami stykowymi, które zabezpieczą płytkę na miejscu i ułatwią wyrównanie z kołkami stykowymi. Następnie umieść podkładkę o średnicy 0,5 milimetra i separator PMMA o średnicy dwóch milimetrów na stoliku obrotowym, aby zapewnić kontrolowaną szczelinę między płytami uruchamiającymi a pokrywą.

Aby załadować kropelki na proponowane podkładki ładujące, należy podzielić cztery krople o pojemności 2,5 mikrolitra z bufora roboczego na B, A, R i E oznaczone elektrodami przy użyciu jednej kropli na podkładkę. Następnie podwielokrotność 2,5 mikrolitra roztworu nadtlenku wodoru luminolu na E oznaczane podkładką. Następnie podwielokrotność 2,5 mikrolitra neutrawidyny sprzężonej z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym HRP i mikrogranulkami na F, G i I oznaczały odpowiednio elektrody.

Na koniec podwielokrotność 2,5 mikrolitra nieznanej próbki na C oznaczała podkładkę. Umieść pokrywę na powierzchni zestawu obok okrągłego wgłębienia i wsuń ją bocznie do wgłębienia i na górze płyty uruchamiającej. Umieść magnes trwały na górze pokrywy i zabezpiecz go, przesuwając dwa zatrzaski, a następnie obróć stolik o 180 stopni i sprawdź go wizualnie, aby upewnić się, że załadowane kropelki są nadal na swoim miejscu.

Sprawdź, czy pozycja ładowania każdej kropli jest zgodna z zaprogramowaną sekwencją uruchamiania w oprogramowaniu. Umieść puszkę z ekranowanym fotodetektorem w szczelinie obrotowego stage i podłącz. Umieść pokrywę na platformie DMF i rozpocznij sekwencję programu za pomocą interfejsu oprogramowania.

Lokalizacja kropli jest rejestrowana za pomocą czujnika pojemnościowego, a następnie może być obserwowana w interfejsie użytkownika. Sekwencja programu wyświetli komunikaty, które pojawią się na interfejsie, aby poinformować operatora, że kropla luminolu jest gotowa do zebrania wyekstrahowanych kulek magnetycznych lub kropla wykrywania jest gotowa do przeniesienia do miejsca detekcji. W obu przypadkach wymagane jest potwierdzenie od operatora, aby kontynuować.

Natężenie światła wytwarzanego w reakcji chemiluminescencyjnej jest odczytywane przez fotodetektor i rejestrowane w czasie rzeczywistym. Aby działać w trybie wizualnym w celu optymalizacji protokołów, uruchom sekwencję programu za pomocą interfejsu oprogramowania. Automatyczne uruchamianie kropli można wizualizować na chipie dla każdego z krytycznych etapów testu, takich jak ekstrakcja magnetyczna kulek, ponowne zawieszenie i mieszanie kulek.

Po wyświetleniu monitu zamontuj puszkę z ekranowanym fotodetektorem w szczelinie obracającego się stolika. Podłącz puszki ekranowanej fotodetektora, wkładając piny do gniazda. Umieść pokrywę na platformie DMF i wznów test.

Kropelki są monitorowane za pomocą czujników pojemnościowych i można je obserwować w interfejsie użytkownika. Aby wyczyścić sprzęt, otwórz pokrywę platformy DMF i obróć stolik o 180 stopni. Odkręć obudowę magnesu i wyjmij magnes z obracającego się stage.

Usuń wafel silikonowy z płytki za pomocą pęsety i spłucz go wodą destylowaną. Następnie wysusz go sprężonym powietrzem i umieść na szalce Petriego, gdzie wafel może być przechowywany i ponownie używany. Za pomocą mikropipety usuń płynne odpady z podkładki bez dotykania powierzchni i wyczyść powierzchnię, odprowadzając płyn z płytki uruchamiającej za pomocą chłonnego papieru.

Aby zbadać wpływ napięcia uruchamiającego, kropla z bufora była napędzana przy różnych napięciach załączania i rejestrowano jej ruch. Wykazano korelację między Vrms a średnią prędkością i zaobserwowano plateau prędkości po określonej wartości Vrms. Żywotność płytki uruchamiającej uległa zmniejszeniu, gdy zastosowano wysokie wartości Vrms.

W przypadku pracy laboratorium ekstrakcyjnego kropla zawierająca zawieszone kulki została doprowadzona do miejsca separacji w środku strefy mieszania. Następnie magnes został automatycznie aktywowany, aby zbliżyć się do chipa i skupić koraliki. Następnie kropla została przesunięta w kierunku podkładki na odpady, pozostawiając koraliki.

Operacje laboratoryjne jednostki ekstrakcji i mieszania na chipie EWOD ułatwiły zminiaturyzowane, szybkie i powtarzalne przetwarzanie próbek z sekwencyjnym wykrywaniem patogenów w ciągu 6 do 10 minut. Czasy inkubacji i stężenia sprzężone były zróżnicowane w celu znalezienia optymalnych warunków dla testu. Stwierdzono, że czas inkubacji wynoszący 160 sekund i sprzężone stężenie wynoszące dwa mikrogramy na mililitr osiągnęły najlepszy stosunek sygnału do szumu.

Warianty protokołu mogą być wprowadzane w celu osiągnięcia pożądanych poziomów automatyzacji. Ośmioetapowy test ELISA wykorzystano do wykrycia różnych antygenów, takich jak przetrwalniki Bacillus atrophaeus i bakteriofag MS2. Tymczasem 10-etapowy protokół został wykorzystany do ilościowego określenia E. coli.

Ważne jest, aby upewnić się, że zastosowane napięcia, stężenia analitów i odczynników są optymalne dla aktywacji kropelek i pomyślnej separacji magnetycznej na chipie. Aby uzyskać precyzyjny pomiar, należy wziąć pod uwagę zdolność wiązania perełek i może być konieczne seryjne rozcieńczanie analitów. Wymieniając się rodzajem przeciwciał, można było wykryć inne patogeny niż ten opisany w sekcji wyników.

Metoda ta może być również stosowana na przykład do wykrywania biomarkerów lub diagnostyki w miejscu opieki nad pacjentem. Oprócz już zaprezentowanych zastosowań, system został opracowany z myślą o wykrywaniu patogenów przenoszonych drogą powietrzną w terenie. DMF jest idealną platformą do tego zastosowania, ponieważ objętość kropli odpowiada wynikowi innego samplera, który ostatnio opracowaliśmy.