Name: Cyfrowa platforma mikroprzepływowa oparta na elektrozwilżaniu do zautomatyzowanego testu immunoenzymatycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Poznaj cyfrową mikroprzepływową platformę opartą na elektrozwilżaniu do automatycznego wykrywania patogenów wirusowych. Metoda łączy magnetyczną immunoprecypitację z manipulacją kroplami, skracając czas testu do 6-10 minut.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować naszym kolegom z Grupy Badawczej Mikrofluidyki i Mikroinżynierii za ich pracę nad projektowaniem mechanicznym i integracją systemów. Autorzy chcieliby podziękować Dstl Porton Down za ich nieocenione wsparcie i wkład finansowy w przeszłe i trwające projekty, które dalej rozwijają technologię DMF i jej zastosowania.

1. Wstępne kroki niezbędne do przeprowadzenia testu
UWAGA (WAŻNE): Wszystkie wstępne kroki muszą być przeprowadzone w sterylnym środowisku, aby uniknąć zanieczyszczeń. Azydek sodu nie powinien być stosowany do przechowywania, ponieważ hamowałby on aktywność enzymu peroksydazy chrzanowej (HRP).
<ol>
	<li>Przygotować bufor do pracy (100 mM HEPES, pH 7,5), używając kwasu (4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowego, i dodać Tween 80 do stężenia 0,01% (v/v).</li>
	<li>Unieruchomić przeciwciała pierwszorzędowe (przeciwciała wychwytujące) na powierzchni mikrokulek magnetycznych aktywowanych przez NHS, postępując zgodnie z protokołem dostarczonym przez dostawcę. Krótko mówiąc, protokół Magnetic IP/Co-IP Kit (tabela materiałów) obejmuje następujące kroki.
	<ol>
		<li>Podaniec 0,2 ml granulek (2 mg) do plastikowej probówki i usunąć supernatant.</li>
		<li>Umyj kulki, dodając 1 ml lodowatego 1 ml lodowatego 1 mM HCl.</li>
		<li>Zwiąż wybrane przeciwciało (albuminę surowicy ludzkiej [15C7], poliklonalną anty-BG Rb, poliklonalną anty-E.coli MRE 162 lub poliklonalną anty-MS2 przeciw MS2 kozy), 40 μg/ml w 67 mM buforze boranowym, kowalencyjnie z kulkami przez 1 godzinę z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C. Tabela 1 zawiera listę wszystkich przeciwciał stosowanych w obecnym protokole i patogenach antygenowych6.</li>
		<li>Przemyć niezwiązane przeciwciała dwukrotnie 0,8 ml buforu elucyjnego.</li>
		<li>Ugasić reakcję 1 ml buforu hartowniczego przez 1 godzinę.</li>
		<li>Przemyj kulki raz zmodyfikowanym buforem boranowym i raz buforem IP Lysis/Washer.</li>
		<li>Ponownie zawiesić kulki w 0,5 ml buforu do lizy/płukania IP i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będą potrzebne do użycia. 
		UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, nowa partia mikrogranulek jest sprzęgana z przeciwciałami na dzień przed izolacją EWOD i testem ELISA na chipie. Jednak mikrogranulki sprzężone z przeciwciałem pierwszorzędowym mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca. W przypadku wystąpienia aglomeracji należy stuknąć w fiolkę, aby rozbić osad i ponownie zawiesić kulki w roztworze.</li>
		<li>Zablokuj mikrogranulki sprzężonym przeciwciałem przez noc, stosując końcowe stężenie 4 mg / ml dla mikrogranulek, w kazeinie blokującej (1% w/v) w 100 mM soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). 
		UWAGA: Etap blokowania jest zawsze przeprowadzany dzień przed przebiegiem testu biodetekcji.</li>
		<li>Oddziel kulki od kazeiny blokującej za pomocą magnesu i usuń supernatant.</li>
		<li>Zawiesić w 1 ml bieżącego buforu i mieszać przez 1 minutę.</li>
		<li>Oddziel koraliki za pomocą magnesu i usuń supernatant.</li>
		<li>Powtórzyć powyższe kroki mycia (1.2.10 i 1.2.11) dwukrotnie. 
		UWAGA: Wystarczą trzy etapy mycia, aby zmniejszyć przyleganie kulek do powierzchni i ułatwić swobodne przemieszczanie się kropli.</li>
		<li>Zawiesić kulki w buforze bieżącym w stężeniu 2,5 mg/ml. To rozwiązanie mikrogranulek jest gotowe do użycia z chipem EWOD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór peroksydazy chrzanowej sprzężonej z neutrawidyną (HRP) i drugorzędowego przeciwciała biotynylowanego do końcowego stężenia dla każdego z 1 μg/ml w buforze biegowym (używanym do wykrywania BG6). 
	UWAGA: Aby celować w antygeny (Tabela 1), z powodzeniem przetestowano różne stężenia drugorzędowego przeciwciała biotynylowego, w zakresie od 0,5 do 4,0 μg/ml.</li>
	<li>Zmieszać równe objętości luminolu z roztworem nadtlenku wodoru tuż przed przeprowadzeniem testu 
	UWAGA: Luminol służy do ilościowego określania liczby zdarzeń wiązania w oparciu o enzym HRP, który jest kowalencyjnie związany z przeciwciałem drugorzędowym, które jest skierowane przeciwko antygenowi (np. patogenowi). Jednak do wykrywania można użyć różnych cząsteczek raportujących i strategii17 zamiast chemiluminescencji i Luminolu.</li>
</ol>
2. Produkcja i obróbka powierzchni komponentów chipa EWOD
UWAGA: Układ EWOD składa się z płytki uruchamiającej z wzorzystymi elektrodami chromowymi do zmiany pozornego kąta zwilżania kropli oraz płytki pokrywowej do określania wysokości kropel.
<ol>
	<li>Narysuj projekt elektrod i złączy w 2D za pomocą standardowego oprogramowania CAD. Dołącz również pojemnik na odpady o wymiarach 5 x 5 mm2 do przechowywania zużytych rozpuszczalników (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1). 
	UWAGA: Do manipulowania kropelkami używamy 47 elektrod, każda o wymiarach 1,7 x 1,7 mm2. Ten rozmiar elektrody może pomieścić objętości kropel w zakresie od 1,5 μl do 3 μl (dla odstępu 500 μm). Z doświadczenia wynika, że podczas pracy ze szczeliną 500 μm minimalna wielkość kropli, którą można uruchomić, wynosi 1,5 μl. Odpowiada on w przybliżeniu konturowi kropli (rzutowanemu) opisanemu na kwadratowej podkładce. Nie ma jednak teoretycznego ograniczenia wielkości innego niż spowodowane oporem (tarciem) ciała płynu. Niemniej jednak zaleca się, aby objętość nie przekraczała 3 μl, aby zapewnić niezawodne uruchamianie przy użyciu szczeliny 500 μm. Elektrody są adresowane przez 48-kanałową elektronikę. 
	UWAGA: Wymiary konstrukcyjne i rozmiary elektrod mogą się różnić w zależności od zamierzonych objętości i operacji jednostki laboratoryjnej (LUO), które składają się na protokół.</li>
	<li>Wyślij rysunek projektowy do firmy produkującej maski w celu wydrukowania maski chromowej na szklanym podłożu. Grubość warstwy chromu wynosi 100 nm. 
	UWAGA: Warstwa chromu na fotomasce używanej jako podłoże dla chipa EWOD jest z definicji nieprzezroczysta. Konstrukcja każdej z naszych elektrod obejmuje układ siatki, aby zapewnić półprzezroczystość.</li>
	<li>Przytnij płytę do rozmiaru 56 x 56 mm2 za pomocą precyzyjnej piły CNC do krojenia w kostkę/cięcia.</li>
	<li>Przyklej taśmę maskującą na styki elektryczne, aby je odizolować podczas dwóch etapów powlekania.</li>
	<li>Pokryj płytkę ze szkła chromowego warstwą dielektryczną, osadzając na jej powierzchni 6 μm Parylenu-C. Metoda Gorhama18 jest używana z 7,4 g DPX-C w systemie osadzania parylenu (Tabela materiałów).</li>
	<li>Przędzić amorficzne fluoropolimery (tabela materiałów) za pomocą powlekarki wirowej z prędkością 1500 obr./min przez 30 s na wierzchu płyty i piec w temperaturze 140 °C przez 30 min. 
	UWAGA: Powoduje to, że powierzchnia jest hydrofobowa. Można sprawdzić, czy powłoka została pomyślnie osadzona, umieszczając kroplę wody na powierzchni. Kąt zwilżania kropli i płytki musi wynosić około 110º.</li>
	<li>Usuń taśmę maskującą ze styków elektrycznych.</li>
	<li>Powlekaj amorficzne fluoropolimery (tabela materiałów) za pomocą powlekarki wirowej z prędkością 1500 obr./min przez 30 s na wierzchu 4-calowej płytki krzemowej i wypalaj ją w temperaturze 140 °C przez 30 min. 
	UWAGA: Ważne jest, aby zarówno powierzchnia płyty uruchamiającej, jak i pokrywy były hydrofobowe, aby ułatwić płynny ruch dyskretnych kropel podczas testu.</li>
</ol>
3. Ładowanie, montaż i eksploatacja układu EWOD na platformie DMF
UWAGA: Układ EWOD działa w konfiguracji równoległej z precyzyjnie zdefiniowaną szczeliną 0,5 mm między płytką uruchamiającą a przewodzącą, uziemioną płytą pokrywy. Ten zespół warstwowy jest opisany w bieżącym rozdziale.
<ol>
	<li>Zdejmij pokrywę z platformy DMF6 i umieść ją na ławce. 
	UWAGA: Ciemna komora klatki Faradaya jest niezbędna, aby zapobiec rozproszonemu światłu i zakłóceniom elektromagnetycznym podczas wykrywania. Na pokrywie nie ma blokady, dzięki czemu platforma pozwala nam obserwować ruch kropel.</li>
	<li>Umieść czystą płytkę uruchamiającą na obracającym się stage, chromem skierowanym do góry. Płytka musi być wyrównana z lewym górnym rogiem stolika wpuszczanego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Zacisnąć płytkę uruchamiającą od góry za pomocą panelu z 47 kołkami stykowymi. To zabezpiecza płytkę na miejscu i ułatwia wyrównanie z kołkami stykowymi.</li>
	<li>Ułożyć podkładkę o średnicy 0,5 mm i separator z polimetakrylanu metylu (PMMA) o średnicy 2 mm na stoliku obrotowym, aby zapewnić kontrolowaną szczelinę między elementem uruchamiającym a płytami pokrywy. 
	UWAGA: Opcjonalnie papier odprowadzający wilgoć można umieścić na podkładce do usuwania odpadów przed podzielonym kropelkami przed następnym krokiem. W miarę postępu testu odpady są bezpośrednio wchłaniane do papieru, który można usunąć po zakończeniu testu.</li>
	<li>Załaduj kropelki na proponowane podkładki ładujące (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).
	<ol>
		<li>Podwielokrotnić cztery krople o pojemności 2,5 μl z buforu biegnącego na elektrodki oznaczone w B, A, R, E, po jednej kropli na każdą elektrodę.</li>
		<li>Podwielokrotność 2,5 μl roztworu Luminolu:H2O2 (1:1, v/v) na podkładkę oznaczoną D.</li>
		<li>Podwielokrotność 2,5 μl neutrawidyny sprzężonej z HRP (1 μg/ml) na podkładce oznaczonej F.</li>
		<li>Podwielokrotność 2,5 μl biotynylowanego przeciwciała drugorzędowego (1 μg/ml) na podkładkę oznaczoną G.</li>
		<li>Podwielokrotność 2,5 μl mikrogranulek ze sprzężonym przeciwciałem pierwszorzędowym (2,5 mg/ml) trafia na podkładkę oznaczoną symbolem I.</li>
		<li>Podwielokrotność 2,5 μl nieznanej próbki na oznaczoną C pad. 
		UWAGA: Proponowany wzorzec ładowania jest tylko jednym z przykładów układu eksperymentalnego, jednak wzorzec ładowania może być zmieniany w celu dopasowania do potrzeb użytkowników, o ile zmiany te są zgodne z sekwencją zdefiniowaną w oprogramowaniu (Plik uzupełniający 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść pokrywę na powierzchni zestawu, poza okrągłym wgłębieniem, i wsuń ją bocznie do wgłębienia i na górze płyty uruchamiającej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B).</li>
	<li>Umieść magnes trwały na górze pokrywy i zabezpiecz go, przesuwając dwa zatrzaski (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Obróć stolik o 180° i sprawdź wzrokowo, czy załadowane kropelki są nadal na swoim miejscu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). 
	UWAGA: Powinno być w stanie dostrzec położenie i kształt kropel przez przezroczysty stolik i tylną część płytki uruchamiającej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D). Test jest gotowy do uruchomienia, jeśli na wierzchu elektrod ładujących można zobaczyć okrągłe kropelki. W przypadku przemieszczenia kropli można usunąć magnes i pokrywę, a następnie odzyskać przemieszczoną kroplę za pomocą czystej pipety i ponownie umieścić ją na podkładce ładującej.</li>
	<li>Sprawdź, czy pozycja ładowania dla każdej kropli jest zgodna z zaprogramowaną sekwencją uruchamiania w oprogramowaniu (szczegółowe informacje na temat oprogramowania znajdują się w pliku uzupełniającym 1). 
	UWAGA: Aby móc wizualnie sprawdzić położenie kropel, fotodetektor musi zostać zdemontowany (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
	<li>Umieść ekranowany fotodetektor "puszkę" w szczelinie obracającego się stolika. 
	UWAGA: System fotodetekcji obraca się wokół fotodiody, która ma duży obszar zbierania (10 x 10 mm2), aby zmaksymalizować zbieranie światła bez dodatkowej optyki, oraz wzmacniacz transimpedancji, aby zminimalizować szumy6. Jednak system jest niezwykle czuły i może zbierać minutowe sygnały. Aby zmniejszyć poziom hałasu, wdrożono szereg strategii opartych na elektronice (np. system fotodetekcji został zabezpieczony poprzez umieszczenie go w klatce Faradaya, metalowej obudowie zwanej ekranowaną "puszką").</li>
	<li>Podłącz do fotodetektora z ekranem "can". 
	UWAGA: Po wyrównaniu układu EWOD z fotodetektorem, platforma DMF jest całkowicie zmontowana i jest teraz gotowa do pracy.</li>
	<li>Umieść pokrywę na platformie DMF i rozpocznij sekwencję programu za pomocą interfejsu oprogramowania opracowanego na Uniwersytecie w Hertfordshire. 
	UWAGA: Dodatkowe oprogramowanie służy do odczytu i zapisu luminescencji z kropli w funkcji czasu w pliku CSV (patrz Plik uzupełniający 2).
	<ol>
		<li>Upewnij się, że na interfejsie pojawią się komunikaty informacyjne zaprogramowanej sekwencji (patrz Plik uzupełniający 1) informujące operatora, że "Kropla luminolu jest gotowa do zebrania wyekstrahowanych kulek magnetycznych" lub "Kropla wykrywania jest gotowa do przeniesienia do miejsca detekcji". W obu przypadkach wymagane jest potwierdzenie od operatora, aby kontynuować sekwencję.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Praca w trybie wizualnym (opcjonalnie do optymalizacji protokołów)
UWAGA: Jeśli jest to pożądane, aby zobrazować każdą operację opartą na kropelkach, test można przeprowadzić pomijając kroki 3.10-3.12 i zastępując je następującymi operacjami.
<ol>
	<li>Uruchom sekwencję programu za pomocą interfejsu oprogramowania. 
	UWAGA: Ruch kropli można zaobserwować podczas pracy w trybie wizualnym, co jest przydatne podczas optymalizacji protokołu. Po pierwsze, aby sprawdzić powtarzalność operacji separacji magnetycznej. Na przykład, jeśli ilość użytych kulek jest zbyt niska, separacja magnetyczna nie nastąpi, odwrotnie, jeśli ilość kulek jest zbyt duża, kropla może zostać unieruchomiona przez granulkę kulki. Po drugie, aby upewnić się co do wiarygodności nowego testu, ponieważ niektóre preparaty kropelkowe mogą powodować upośledzenie uruchamiania, które można wykryć za pomocą obserwacji.</li>
	<li>Zamontuj fotodetektor z ekranowaną "puszką" w szczelinie obracającego się stolika, gdy zostaniesz o to poproszony.</li>
	<li>Podłącz do fotodetektora ekranowanego "puszka", wkładając piny w gniazdko.</li>
	<li>Umieść pokrywę na platformie DMF i wznów test. 
	UWAGA: Użyj dodatkowego oprogramowania do odczytu i zapisu luminescencji z kropli w funkcji czasu w pliku CSV (patrz Plik uzupełniający 2)</li>
</ol>
5. Usuwanie odpadów płynnych i czyszczenie chipa
UWAGA: Upewnij się, że sprzęt jest wyłączony i odłączony od źródeł zasilania (komputer, główny) przed czyszczeniem. Podczas wyjmowania próbek biologicznych z chipa należy nosić rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne ze szkła ochronnego (PPE)!
<ol>
	<li>Aby uzyskać dostęp do elektrod i zużytych rozpuszczalników na płycie uruchamiającej, otwórz pokrywę platformy DMF i obróć stolik o 180°.</li>
	<li>Odkręć obudowę magnesu, wyjmij magnes z obracającego się stage i umieść go na stole.</li>
	<li>Zdejmij pokrywę, wafel silikonowy, ze szczeliny za pomocą pęsety, spłucz ją wodą DI, osusz sprężonym powietrzem i umieść na szalce Petriego, gdzie wafel może być przechowywany i ponownie używany.</li>
	<li>Użyj mikropipety, aby usunąć płynne odpady z podkładki bez dotykania powierzchni.</li>
	<li>Oczyść powierzchnię, odprowadzając płyn z płytki uruchamiającej za pomocą papieru chłonnego (materiału filtracyjnego). 
	UWAGA: Utrzymanie powierzchni w stanie nienaruszonym wydłuży żywotność płytki uruchamiającej, co pozwala na wielokrotne użycie.</li>
	<li>Wyczyść płytkę uruchamiającą, delikatnie zamiatając powierzchnię elektrod czystą kroplą wody DI za pomocą czystej pipety. Następnie usuń kroplę za pomocą bibuły odprowadzającej wilgoć (materiału filtracyjnego). 
	UWAGA: Chusteczki higieniczne, papiery, końcówki do pipet i rękawiczki, które są zanieczyszczone materiałem biologicznym, należy wyrzucić do pojemnika na bioodpady.</li>
	<li>Użyj płytki uruchamiającej do innego testu lub wyjmij ją z platformy DMF w celu przechowywania lub recyklingu.</li>
</ol>

<ol><li>Kokalj, T., Pérez-Ruiz, E., Lammertyn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+bio-assays+with+magnetic+particles+on+a+digital+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Building bio-assays with magnetic particles on a digital microfluidic platform.</a> New Biotechnology. 32 (5), 485-503 (2015).</li>
<li>Sista, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+digital+microfluidic+platform+for+point+of+care+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Development of a digital microfluidic platform for point of care testing.</a> Lab on a Chip. 8 (12), 2091-2104 (2008).</li>
<li>Starodubov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compact+USB-powered+mobile+ELISA-based+pathogen+detection%3A+design+and+implementation+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Environmental%2C+Chemical%2C+and+Biological+Sensing+Technologies+VIII%22%5BJournal%5D)">Compact USB-powered mobile ELISA-based pathogen detection: design and implementation challenges.</a> Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies VIII. 8024, 80240(2011).</li>
<li>Delattre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macro+to+microfluidics+system+for+biological+environmental+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Macro to microfluidics system for biological environmental monitoring.</a> Biosensors and Bioelectronics. 36 (1), 230-235 (2012).</li>
<li>Gooding, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor+technology+for+detecting+biological+warfare+agents%3A+Recent+progress+and+future+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Biosensor technology for detecting biological warfare agents: Recent progress and future trends.</a> Analytica Chimica Acta. 559 (2), 137-151 (2006).</li>
<li>Coudron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+integrated+digital+microfluidics+platform+for+automated+immunoassay%3B+A+versatile+tool+for+rapid%2C+specific+detection+of+a+wide+range+of+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Fully integrated digital microfluidics platform for automated immunoassay; A versatile tool for rapid, specific detection of a wide range of pathogens.</a> Biosensors and Bioelectronics. 128, 52-60 (2019).</li>
<li>Hua, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Real-Time+Polymerase+Chain+Reaction+on+a+Digital+Microfluidic+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Real-Time Polymerase Chain Reaction on a Digital Microfluidic Platform.</a> Analytical Chemistry. 82 (6), 2310-2316 (2010).</li>
<li>Zou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((real-time+chemiluminescent+detection+of+DNA+mutation+based+on+digital+microfluidics+and+pyrosequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">real-time chemiluminescent detection of DNA mutation based on digital microfluidics and pyrosequencing.</a> Biosensors and Bioelectronics. 126, 551-557 (2019).</li>
<li>Ng, A. H. C., Choi, K., Luoma, R. P., Robinson, J. M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+microfluidic+magnetic+separation+for+particle-based+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Digital microfluidic magnetic separation for particle-based immunoassays.</a> Analytical Chemistry. 84 (20), 8805-8812 (2012).</li>
<li>Vergauwe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+electrowetting-based+digital+microfluidic+platform+for+quantitative+homogeneous+and+heterogeneous+bio-assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">A versatile electrowetting-based digital microfluidic platform for quantitative homogeneous and heterogeneous bio-assays.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (5), (2011).</li>
<li>Choi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+digital+microfluidic+platform+for+magnetic-particle-based+immunoassays+with+optimization+by+design+of+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Automated digital microfluidic platform for magnetic-particle-based immunoassays with optimization by design of experiments.</a> Analytical Chemistry. 85 (20), 9638-9646 (2013).</li>
<li>Zhao, Y., Cho, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticle+sampling+by+electrowetting-actuated+droplet+sweeping%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microparticle sampling by electrowetting-actuated droplet sweeping.</a> Lab on a Chip. 6 (1), 137-144 (2006).</li>
<li>Jonsson-Niedziołka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EWOD+driven+cleaning+of+bioparticles+on+hydrophobic+and+superhydrophobic+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">EWOD driven cleaning of bioparticles on hydrophobic and superhydrophobic surfaces.</a> Lab on a Chip. 11 (3), 490-496 (2011).</li>
<li>Foat, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prototype+personal+aerosol+sampler+based+on+electrostatic+precipitation+and+electrowetting-on-dielectric+actuation+of+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Aerosol+Science%22%5BJournal%5D)">A prototype personal aerosol sampler based on electrostatic precipitation and electrowetting-on-dielectric actuation of droplets.</a> Journal of Aerosol Science. 95, 43-53 (2016).</li>
<li>Seale, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Microfluidics+for+Immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Digital Microfluidics for Immunoprecipitation.</a> Analytical Chemistry. 88 (20), 10223-10230 (2016).</li>
<li>Ng, A. H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digital+microfluidic+system+for+serological+immunoassays+in+remote+settings%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A digital microfluidic system for serological immunoassays in remote settings.</a> Science Translational Medicine. 10 (438), 6076-6088 (2018).</li>
<li>Wild, D., Davies, C. Immunoassay fundamentals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWild%2C+D+%22The+Immunoassay+Handbook%3A+Theory+and+Applications+of+Ligand+Binding%2C+ELISA+and+Related+Techniques%22">The Immunoassay Handbook: Theory and Applications of Ligand Binding, ELISA and Related Techniques</a>. , 1-26 (2013).</li>
<li>Gorham, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New%2C+General+Synthetic+Method+for+the+Preparation+of+Linear+Poly-p-xylylenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Polymer+Science+Part+A-1%3A+Polymer+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A New, General Synthetic Method for the Preparation of Linear Poly-p-xylylenes.</a> Journal of Polymer Science Part A-1: Polymer Chemistry. 4 (12), 3027-3039 (1966).</li>
<li>Soum, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affordable+fabrication+of+conductive+electrodes+and+dielectric+films+for+a+paper-based+digital+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Affordable fabrication of conductive electrodes and dielectric films for a paper-based digital microfluidic chip.</a> Micromachines. 10 (2), (2019).</li>
<li>Abdelgawad, M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost%2C+rapid-prototyping+of+digital+microfluidics+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">Low-cost, rapid-prototyping of digital microfluidics devices.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 4 (4), 349-355 (2008).</li>
<li>Jain, V., Devarasetty, V., Patrikar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+Two-Dimensional+Open+EWOD+System+using+Printed+Circuit+Board+Technology%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Journal+of+Researches+in+Engineering%3A+Electrical+and+Electronics+Engineering%22%5BJournal%5D)">Study of Two-Dimensional Open EWOD System using Printed Circuit Board Technology.</a> Global Journal of Researches in Engineering: Electrical and Electronics Engineering. 17 (6), (2017).</li>
<li>Luk, V. N., Mo, G. C. H., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluronic+additives%3A+A+solution+to+sticky+problems+in+digital+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Pluronic additives: A solution to sticky problems in digital microfluidics.</a> Langmuir. 24 (12), 6382-6389 (2008).</li>
<li>Latip, E. N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+droplet+actuation+on+superhydrophobic+surfaces%3A+A+new+approach+toward+anti-biofouling+electrowetting+systems%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Protein droplet actuation on superhydrophobic surfaces: A new approach toward anti-biofouling electrowetting systems.</a> RSC Advances. 7 (78), 49633-49648 (2017).</li>
<li>Yoon, J. Y., Garrell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+biomolecular+adsorption+in+electrowetting-based+biofluidic+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Preventing biomolecular adsorption in electrowetting-based biofluidic chips.</a> Analytical Chemistry. 75 (19), 5097-5102 (2003).</li>
<li>Dalvie, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost+analysis+of+ELISA%2C+solid-phase+extraction%2C+and+solid-phase+microextraction+for+the+monitoring+of+pesticides+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Cost analysis of ELISA, solid-phase extraction, and solid-phase microextraction for the monitoring of pesticides in water.</a> Environmental Research. 98 (1), 143-150 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół testu immunologicznego EWOD jest elastyczny i może obejmować różną liczbę operacji jednostki laboratoryjnej (np. wychwytywanie antygenu, mieszanie, inkubacja, ekstrakcja kulek, mycie) w zależności od rodzaju odczynnika, stabilności i wymagań dotyczących użycia określonych w protokole testu. Jako dowód zasadności, w niniejszym artykule rozważane są dwa protokoły testów immunologicznych pokazujące implementację ośmiu lub dziesięciu LUO (ryc. 4) z opisanym chipem EWOD. Taka miniaturyzacja zasługuje na mikrolitrowe, dyskretne objętości odczynników/analitu, które zwiększają skuteczność testu ELISA poprzez zmniejszenie zarówno zużycia odczynników, czasu wymaganego na operację, jak i zasadniczo całkowitego czasu eksperymentu (od 6 do 10 minut). Co więcej, test jest zautomatyzowany dzięki czasowej manipulacji kropelkami, co zmniejsza zmiany i poprawia precyzję testu immunologicznego17. W obecnym formacie eksperyment polega na ręcznym obchodzeniu się z kropelkami na początku każdego testu, co jest punktem do dalszej dyskusji w następnej sekcji.
Jednym z krytycznych kroków w obecnej metodzie DMF jest dozowanie kropel na powierzchnię chipa EWOD. Zazwyczaj mikropipeta z jednorazową końcówką służy do pomiaru dokładnej objętości i jej załadowania. Jednak unieruchomienie kropli na hydrofobowej powierzchni płytki uruchamiającej może stać się trudne ze względu na interakcje między kroplą a naładowaną powierzchnią jednorazowej końcówki. W rezultacie kropla może wystrzelić w górę zgodnie z zewnętrzną powierzchnią końcówki, zamiast pozostać na płytce. Aby tego uniknąć, mikropipetę należy trzymać w pozycji pionowej, prostopadle do powierzchni wióra, nie dotykając jej, a następnie kroplę można dozować na podkładkę ładującą, doprowadzając ją do kontaktu z powierzchnią. Jeśli kropla przyklei się do końcówki pipety, włóż ją z powrotem do roztworu podstawowego, wymień końcówkę i ponownie włóż nową kroplę. W ramach dalszego rozwoju obecnego systemu proof-of-concept można przewidzieć automatyczne dostarczanie kropli.
Kolejnym krytycznym krokiem, przed uruchomieniem testu, jest zamknięcie pokrywy zespołu równoległej płytki. Jak stwierdzono wcześniej w protokole, pokrywę należy nasunąć na płytkę uruchamiającą. Hydrofobowa powierzchnia pokrywy zapobiega zniekształceniom i przemieszczaniu się kropel znajdujących się na płytce uruchamiającej. Aby zagwarantować płynny ruch kropli, zdecydowanie zaleca się stosowanie nieskazitelnej płytki uruchamiającej, prawidłowe ładowanie kropel i montaż wiórów. Możliwe jest ponowne użycie płytek uruchamiających; jednak liczba cykli zależy od napięć uruchamiających (rysunek 3) i osadzania się analitu/odczynnika na powierzchni, czyli biofoulingu. Prezentowana platforma wykorzystywała chromowany układ scalony EBUD, który mógł być niezawodnie ponownie wykorzystany do kolejnych pomiarów do czterech razy przy napięciu roboczym 120 V i pośrednim czyszczeniu płytki po każdym eksperymencie. Płytki poddano recyklingowi, aby obniżyć koszt eksperymentu, poprzez odkażenie (szczotkowanie powierzchni nierozcieńczonym środkiem czyszczącym przed dokładnym spłukaniem) powłoki biofouled amorficznych fluoropolimerów (Tabela materiałów) i wirowanie świeżej powłoki na wierzchu płytki. Recykling płytek uruchamiających wymaga jednak ręcznej obsługi, kosztownych odczynników (amorficzne fluoropolimery (tabela materiałów)) i specjalistycznego sprzętu (powlekarka spinowa). Alternatywne układy scalone EWOD są z powodzeniem badane na opłacalnych podłożach, takich jak papier19, folie octanowe lub płytki obwodów drukowanych (PCB)20,21. Takie jednorazowe materiały eksploatacyjne mogą ułatwić niezawodne i niedrogie korzystanie z platformy DMF i mogą zapewnić środki do ominięcia problemu biofoulingu.
Zanieczyszczenie biologiczne jest głównym ograniczeniem EWOD do zastosowań biologicznych22,23. Wcześniejsze badania nad DMF zidentyfikowały dwa mechanizmy, które przyczyniają się do biofoulingu, a mianowicie pasywną adsorpcję spowodowaną oddziaływaniami hydrofobowymi oraz adsorpcję napędzaną elektrostatycznie, która objawia się po przyłożeniu pola elektrycznego24. Odkrycia zawarte w niniejszym artykule są zgodne z tą teorią, ponieważ udokumentowano, że możliwość ponownego użycia płytki uruchamiającej zmniejsza się przy wysokich napięciach uruchamiania. Jednym z możliwych wyjaśnień jest to, że białka łatwo adsorbują się na powierzchniach pokrytych fluoropolimerem (teflonowych) i agregują się szybciej na zanieczyszczonych powierzchniach w porównaniu z nieskazitelnymi powierzchniami24. W związku z tym testy związane z białkami DMF są trudne do określenia ilościowego i mogą powodować utratę analitu, zanieczyszczenie krzyżowe i zmniejszoną precyzję17. Najgorszym scenariuszem jest sytuacja, w której krytyczna ilość białka adsorbuje się, co sprawia, że urządzenie staje się bezużyteczne. Aby zminimalizować zanieczyszczenie biologiczne, badano różne podejścia, począwszy od minimalizacji czasu przebywania kropli na chipie, poprzez powłoki23, aż po dodatki (tj. środki powierzchniowo czynne lub kwas pluronowy) do kropelek zawierających biomateriał6,22. Dlatego ważnym aspektem testu immunologicznego na EWOD jest wybór strategii przeciwporostowych, które są zgodne z konkretnym protokołem.
Zautomatyzowana platforma DMF została zaprojektowana do wykonywania pojedynczego testu ELISA typu sandwich na przebieg przy użyciu mikrolitrów objętości zarówno dla odczynników, jak i analitu. Gdy jest to wymagane, dostępne są konwencjonalne zestawy ELISA typu sandwich oparte na wstępnie powlekanych płytkach 96-dołkowych lub 384-dołkowych, które w połączeniu z pomocniczym sprzętem laboratoryjnym zapewniają wyższą przepustowość na serię; tylko na podstawie ceny odczynników, przybliżony koszt testu / dołka wynosi odpowiednio 6,04 USD (580 USD / 96) i 0,33 USD (2×580 USD / 384). To sprawia, że konwencjonalne metody ELISA są idealne dla dużej liczby próbek przetwarzanych zazwyczaj przez przeszkolony personel techniczny w scentralizowanych obiektach laboratoryjnych. Jednak w odległych lokalizacjach szczegółowa analiza kosztów testu ELISA do monitorowania środowiska wykazała, że po uwzględnieniu kosztów kapitałowych (tj. kosztów operacyjnych laboratorium, kosztów stałych, transportu próbek, materiałów eksploatacyjnych i personelu) rzeczywista cena za test ELISA wynosiła 60 USD, z czego 34 USD przypadło na dostawy na próbkę25. W przeciwieństwie do tego, proponowana platforma DMF jest przenośna, wymaga minimalnego szkolenia w obsłudze, a dzięki wstępnie powlekanym kulkom może zapewnić analizę od próbki do odpowiedzi w ciągu kilku minut. W związku z tym prezentowana technologia może być wdrażana w miejscach zapotrzebowania i uzupełniać analizy dostępne w scentralizowanych laboratoriach.
W sekcji reprezentatywnych wyników wykorzystano zautomatyzowaną platformę testów immunologicznych DMF do bezpośredniego wykrywania patogenów do zastosowań obronnych. Inne możliwe zastosowania platformy DMF obejmują między innymi biodiagnostykę, ciągłe monitorowanie i automatyczne pobieranie próbek. Potencjalnie DMF może mieć wpływ na różne sektory, od opieki nad pacjentem w miejscu opieki nad pacjentem w celu zapewnienia spersonalizowanej opieki zdrowotnej, poprzez kontrolowane monitorowanie środowiska w celu ochrony pacjentów przed zakażeniami szpitalnymi przenoszonymi drogą powietrzną, aż po system monitorowania upraw w rolnictwie i produkcji żywności.

Proponowana metoda ma na celu ułatwienie automatycznego przygotowania próbki do testu ELISA z ilościowym wykrywaniem antygenów przy użyciu podejścia opartego na EWOD z cyfrowymi mikroprzepływami (DMF) i separacją magnetoforetyczną. Wykazano dla wielu zastosowań biologicznych, że DMF w połączeniu z magnetoforezą jest interesującą alternatywą dla zastosowań związanych z cieczami1. Mówiąc dokładniej, wykrywanie patogenów jest ukrytym aspektem w wielu sektorach, począwszy od opieki zdrowotnej2 po rolnictwo i środowisko3,4 po bezpieczeństwo narodowe5. Technologia wykrywania zdolna do przeciwdziałania zagrożeniom ze strony patogenów musi charakteryzować się wysoką przepustowością (np. krótki czas testu), wydajnością (dolna granica wykrywalności – LoD – i wysoką czułością) oraz swoistością (w stosunku do docelowego typu patogenu), aby była funkcjonalna6.
Poprzednio, DMF oparty na EWOD został z powodzeniem zaimplementowany do reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR), wykrywania patogenu opornego na antybiotyki (Staphylococcus aureaus oporny na metycylinę lub MRSA), M.pneumonia i C.albicans przy użyciu niskobudżetowego układu scalonego na płytce drukowanej i magnetoforezy7. Technika ta została również zastosowana do wykrywania mutacji kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) poprzez pirosekwencjonowanie i detekcję chemiluminescencyjną8. Platformy oparte na EWOD rozszerzają również swoją funkcjonalność o zastosowania w testach immunologicznych, umożliwiając w ten sposób jednoczesne odzyskiwanie i wykrywanie próbek w ramach jednej, zintegrowanej platformy. Na przykład, pojedynczy projekt chipa EWOD został pomyślnie zademonstrowany z platformą DMF do testów przyłóżkowych zarówno dla testów immunologicznych troponiny I serca opartych na kulkach z próbki krwi pełnej, jak i jako oddzielny eksperyment RT-PCR do wykrywania MRSA2. Chip ten wykorzystuje wlew oleju, który zapobiega parowaniu kropel i ułatwia niezawodną automatyczną manipulację objętościami nanolitrów. Zbadano wszechstronne zastosowania biologiczne z zastosowaniem podobnych podejść DMF obejmujących ilościowe jednorodne i heterogeniczne testy immunologiczne9,10, w tym projektowanie eksperymentów (DoE) w celu optymalizacji parametrów testu11.
Pomimo oczywistych zalet intensyfikacji procesów ze względu na niewielkie objętości robocze, platforma DMF wypełniona olejem może być wyzwaniem i wymaga pewnego poziomu wiedzy specjalistycznej do obsługi. Systemy wypełnione olejem, ponieważ wymagają uszczelnionego komponentu, nie są idealne do niektórych zastosowań w terenie, w których ważna jest przenośność systemu. Ponadto system oparty na oleju byłby bardzo trudny, jeśli nie niemożliwy, do wykorzystania w niektórych konkretnych zastosowaniach wykorzystujących zbieranie suchego materiału na powierzchni, takich jak proponowane przez Zhao i Cho12, Jönsson-Niedziółka et al.13 oraz Foat et al.14. W przeciwieństwie do tego, systemy bezolejowe są łatwe do zintegrowania i mają tę zaletę, że zapewniają łatwą translację próbki chip-do-chip. Z tych powodów proponowana metoda została opracowana, aby zapewnić test immunologiczny oparty na EWOD na DMF, który nie wymagałby oleju, skutecznie upraszczając obsługę urządzenia.
W tym wpisie informujemy o użyciu specjalnie zaprojektowanej, niezależnej, w pełni zautomatyzowanej platformy DMF do testów immunologicznych i omawiamy protokół szybkiego wykrywania biomolekuł, a mianowicie: białek, bakterii wegetatywnych, zarodników bakterii i wirusów. Połączenie chipa EWOD z cząstkami magnetycznymi do automatycznego przygotowania próbki i immunoprecypitacji zostało już zademonstrowane za pomocą dodatkowego pomiaru MS off-line15. Ostatnio diagnostyka terenowa przeciwko odrze i różyczce IgG została zademonstrowana w odległej populacji północno-zachodniej Kenii przez grupę Wheelera16. Zarówno system Wheeler, jak i nasz, będąc przenośnym, samowystarczalnym, w pełni zautomatyzowanym z dołączonymi pomiarami chemiluminescencyjnymi w czasie rzeczywistym, są prawdopodobnie jednymi z najbardziej zaawansowanych dostępnych systemów biodetekcji DMF.
Oba systemy zostały zaprojektowane z myślą o bardzo różnych zastosowaniach. System Wheelera jest ukierunkowany na biomarkery, aby umożliwić diagnostykę biomedyczną pacjentów, podczas gdy nasz system biodetekcji jest zbudowany w oparciu o wymóg obrony w celu bezpośredniego wykrywania patogenu pobranego wcześniej z powietrza. Podobieństwo między nimi wynika z podstawowej zasady uruchamiania kropel, która pokazuje szeroki zakres sektorów wpływających na życie, na które może wpływać technologia oparta na EWOD. Mianowicie, platforma wykrywania oparta na DMF i związany z nią system EWOD mogą znaleźć kluczowe implikacje w dziedzinie zdrowia (diagnostyka biomedyczna); ochrona wojskowa i cywilna (wykrywanie zagrożeń); Agrotechnika (monitoring upraw) i bezpieczeństwo pracy (monitorowanie kontrolowanego środowiska)
Wydajność naszej platformy DMF jest oceniana pod kątem w pełni automatycznego wykrywania albuminy ludzkiej surowicy (HSA, białko globularne), Escherichia coli (E. coli, bakteria wegetatywna), Bacillus atrophaeus (BG, zarodnik bakterii) i MS2 (wirus bakteriofagowy). Co ważniejsze, proponowana metoda DMF jest niezwykle wszechstronna w tym sensie, że przeciwciała wychwytujące mogą być wymieniane w celu wykrycia innych antygenów innych niż cztery, które są rozważane w tym artykule. Całkowicie rezygnując z wykrywania opartego na przeciwciałach, platforma DMF może stać się potencjalnym zastosowaniem opartym na biodetekcji aptamerowej, w której kulki magnetyczne przenoszą określone aptamery do wychwytywania i/lub wykrywania nukleotydów. Projekt i realizacja różnych komponentów składających się na zintegrowaną, całkowicie samodzielną platformę DMF, w tym generatora przebiegów wysokiego napięcia i elektroniki napędowej, jest ujawniony w innym miejscu6.

<table><tbody><tr><td>Kwas (4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy, HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9897</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ludzka albumina surowicy [15C7]</td><td>Abcam</td><td>ab10241</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ludzka albumina surowicy [1A9] (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab24438</td><td></td></tr><tr><td>B. atrophaeus (BG) zarodniki</td><td>Dstl, Wielka Brytania</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowany Rb anty-BG poliklonalny</td><td>Dstl, Wielka Brytania</td><td>N/ </td><td></td></tr><tr><td>a Biotynylowany Rb anty-E. coli MRE 162 poliklonalny</td><td>Dstl, Wielka Brytania</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowanego Rb anty-MS2 poliklonalnego</td><td>Dstl, Wielka Brytania</td><td>Nie dotyczy kazeiny</td><td></td></tr><tr><td>blokującej Thermo</td><td>Scientific</td><td>TFS 37582</td><td></td></tr><tr><td>Piła do krojenia / cięcia CNC</td><td>MTI Corp, USA</td><td>SYJ-400</td><td></td></tr><tr><td>Cytop</td><td>AGC, Japonia</td><td>CTL-809M</td><td>Amorficzne fluoropolimery. Jest to powłoka dwuskładnikowa.</td></tr><tr><td>E. coli MRE 162</td><td>Dstl, Wielka Brytania</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>koziego anty-MS2 poliklonalnego</td><td>Dstl, Wielka Brytania</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>fotodiody Hamamatsu</td><td>Hamamatsu, Japonia</td><td>S9270</td><td></td></tr><tr><td>Kwas hidrochlorowy (32%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W530574</td><td></td></tr><tr><td>Usługa produkcji masek</td><td>Compugraphics, Szkocja, Wielka Brytania</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>wirusa MS2</td><td>Dstl, Wielka Brytania</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Parylene-C, DPX-C</td><td>Specialty Coating System, USA</td><td>Nr CAS: 28804-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>88828</td><td>Zawiera wszystkie i odczynniki wymagane do immobilizacji enzymów. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Rb anty-BG poliklonalny</td><td>Dstl, Wielka Brytania</td><td>Nie</td><td></td></tr> dotyczy <tr><td>Rb anty-E. coli MRE 162 poliklonalny</td><td>Dstl, UK</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowanego białka albuminy ludzkiej surowicy, HAS</td><td>Abcam</td><td>ab201876</td><td></td></tr><tr><td>SCS Parylene Deposition System</td><td>Specialty Coating System, USA</td><td>2010</td><td></td></tr><tr><td>Wafel krzemowy, 4'', typ p, < 100>, 1&ndash; 10 &Omega; cm</td><td>Pi Kem Ltd</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Powlekarka wirowa</td><td>S&Uuml; SS MicroTec AG, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal ELISA Femto Podłoże o maksymalnej czułości</td><td>Thermo Scientific</td><td>37075</td><td>Zawiera 50 ml roztworów luminolu / wzmacniacza i stabilnego nadtlenku. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Thermo Scientific</td><td>28328</td><td>Producentem jest Surfact-Amps Detergent Solution.</td></tr></tbody></table>

cyfrowa platforma mikroprzepływowa oparta na elektrozwilżaniu do zautomatyzowanego testu immunoenzymatycznego

Electrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Elektrozwilżanie to efekt, dzięki któremu zmienia się kąt zwilżania kropli wystawionej na działanie ładunku powierzchniowego. Elektrozwilżanie na dielektryku (EWOD) wykorzystuje właściwości dielektryczne cienkich warstw izolatorów w celu zwiększenia gęstości ładunku, a tym samym wzmocnienia efektu elektrozwilżania. Obecność ładunków powoduje elektrycznie indukowane rozprzestrzenianie się kropli, co pozwala na celową manipulację na powierzchni hydrofobowej. W tym miejscu demonstrujemy oparty na EWOD protokół przetwarzania próbek i wykrywania czterech kategorii antygenów, przy użyciu zautomatyzowanej platformy aktywacji powierzchniowej, za pomocą dwóch wariantów metody testu immunoenzymatycznego (ELISA). Test ELISA jest wykonywany na kulkach magnetycznych z unieruchomionymi przeciwciałami pierwszorzędowymi, które można wybrać tak, aby były ukierunkowane na określony antygen. Przeciwciało sprzężone z HRP wiąże się z antygenem i miesza się zH2O2/Luminol w celu ilościowego określenia wychwyconych patogenów. Osiągnięto czas wykonania testu od 6 do 10 minut, przy użyciu niewielkich objętości odczynników.

Zbadano wpływ napięcia sterującego, aby ustalić optymalne warunki do przeprowadzenia analiz. Kropla buforu była przemieszczana przy różnych napięciach sterujących, a jej ruch był rejestrowany. Wyniki wykazały (Rysunek 3), że istnieje korelacja między skutecznym napięciem sterującym (Vrms) a średnią prędkością. Jednakże trwałość płyty sterującej ulegała zmniejszeniu przy zastosowaniu wysokich wartości Vrms. Na podstawie tych wyników jako standardowe napięcie sterujące wybrano 105 Vrms, stwierdzono, że dla kropli H2O2/Luminol najlepiej sprawdza się 120 Vrms, natomiast dla ekstrakcji LUO zastosowano 165 Vrms. Napięcia te zostały uwzględnione w zautomatyzowanej sekwencji programowania (Plik uzupełniający 1).
Dwa testy immunologiczne (Rycina 4) zostały z sukcesem przeprowadzone przy użyciu chipa EWOD z platformą DMF dla czterech różnych patogenów (Tabela 1). Chip EWOD umożliwił sekwencyjne przemieszczanie kropli z pól ładowania do obszaru mieszania, a ostatecznie do odpływu. W protokole wykonania testu ELISA powtarzano dwie podstawowe jednostki operacyjne (LUO). Pierwszą z nich była LUO ekstrakcji; w skrócie: kropla zawierająca zawieszone kuleczki była kierowana do miejsca separacji w środku strefy mieszania, a następnie automatycznie aktywowano magnes, który zbliżył się do chipa i zgromadził magnetyczne kuleczki w pelet (Rycina 5). Następnie kroplę przemieszczano w stronę pola odpływowego, pozostawiając kuleczki na płycie aktywacyjnej, co kończyło LUO ekstrakcji. Kolejną kluczową jednostką operacyjną realizowaną na chipie EWOD było mieszanie. Próbka analityczna o nieznanym stężeniu patogenów była przemieszczana na kuleczki za pomocą elektrowettingu. Następnie kuleczki resuspendowano, przemieszczając kroplę z aglomeratem kuleczek nad obszarem mieszania (łącznie 10 pól). Te dwie jednostki LUO były kluczowe, ponieważ umożliwiły zminiaturyzowane, szybkie i powtarzalne przetwarzanie próbek z następującą detekcją patogenów w czasie od 6 do 10 min. Rycina 6 przedstawia pełną sekwencję LUO dla testu immunologicznego wykonanego za pomocą chipa EWOD.
Aby osiągnąć pożądany poziom automatyzacji, można wprowadzić modyfikacje w protokole. Na przykład kuleczki oddzielono od kropli z usuniętym antygenem, którą następnie przeniesiono na podkładkę odpadową, powtarzając podstawową jednostkę operacyjną (LUO) ekstrakcji. Na tym etapie protokół może rozgałęziać się w zależności od tego, czy przeciwciało detekcyjne było już sprzężone z HRP, co w efekcie pozwala na wykorzystanie łącznie ośmiu LUO do detekcji różnych antygenów (Rysunek 7A-C). W takich przypadkach kropla z przeciwciałem detekcyjnym była doprowadzana do kuleczków, a następnie mieszana poprzez aktywację. Alternatywnie, wiązanie przeciwciała detekcyjnego z koniugatem Neutravidin-HRP można przeprowadzić sekwencyjnie in situ na chipie EWOD, co wykazano przy ilościowym oznaczaniu E. coli (Rysunek 7D). Oba protokoły, ośmio- i dziesięcioetapowe ELISA (Rysunek 4), pozwoliły na uzyskanie powtarzalnej detekcji antygenów.
Zmieniano czasy inkubacji oraz stężenia koniugatu, aby doświadczalnie ustalić optymalne warunki dla badania (Rycina 7A). Stwierdzono, że czas inkubacji wynoszący 160 s i stężenie koniugatu 2 μg/mL zapewniają najlepszy stosunek sygnału do szumu, przy wzroście natężenia sygnału o 36% i praktycznie niezmienionym poziomie szumu tła. Wszystkie ryciny i dane wykorzystane w sekcji wyników reprezentatywnych zostały zmodyfikowane na podstawie wcześniejszej pracy6.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Przeciwciało pierwotne / wychwytujące</td>
			<td>Przeciwciało detekcyjne</td>
			<td>Antygen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przeciwciało przeciwko ludzkiej albuminie surowicy [15C7] (anti-HSA, Abcam ab10241)</td>
			<td>przeciwciało anty-HSA [1A9] znakowane peroksydazą chrzanową (HRP) (Abcam ab24438)</td>
			<td>albumina ludzkiej surowicy (HSA, Abcam)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poliklonalne przeciwciało królicze anty-BG</td>
			<td>biotynilowane poliklonalne przeciwciała królika przeciwko BG</td>
			<td>zarodniki B. globigii (BG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poliklonalne przeciwciało królicze przeciwko E.coli MRE 162</td>
			<td>biotynylizowane przeciwciała poliklonalne królika przeciwko MRE E.coli 162</td>
			<td>E. coli MRE 162</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kozia przeciwciała poliklonalne anty-MS2</td>
			<td>Biotynilowane przeciwciało królicze anty-MS2 poliklonalne</td>
			<td>Bakteriofag MS2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Antygeny i przeciwciała przetestowane zgodnie z tym protokołem. W celu zademonstrowania możliwości chipa EWOD z platformą DMF wykorzystano cztery rodzaje antygenów patogenów.
<img alt="Schemat chipa mikroprzepływowego i powiększone obrazowanie siatki; wnętrze chipa do analizy sortowania komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60489/60489fig1a.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Projekt płytki EWOD. (a) Schematyczne oznaczenie płytki sterującej EWOD z konektorami (kwadraty, góra), które są połączone (linie) z elektrodami (kwadraty, dół). Każdemu polu przypisano numer, który może być adresowany w kodzie oprogramowania (Plik uzupełniający 1). Elektrody do ładowania są oznaczone strzałkami oraz wielką literą znajdującą się nad lub pod każdą z elektrod. Kluczowym elementem platformy DMF jest strefa mieszania, składająca się z dziesięciu elektrod (nr 31, 32, 3, 36, 37, 42, 43, 4, 46, 47). Dla ułatwienia strefa mieszania została zaznaczona czerwonym prostokątem. (b) Mikrofotografia projektu mikrogridy padów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60489/60489fig1alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Konfiguracja układu chipa EWOD na obrotowej platformie z magnesem; wykorzystywany w eksperymentach z wzbudzaniem optycznym, schemat." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60489/60489fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Komponenty i kluczowe etapy montażu cyfrowego systemu mikroprzepływowego (DMF). (A) Zamocuj płytkę sterującą EWOD, umieść podkładkę na stole obrotowym i naniesienie krople. (B) Umieść płytkę przykrywkową. (C) Zamocuj obudowę magnesu, zapięcie zatrzaski i obróć stolik 180°. (D) Zautomatyzowany magnes jest skierowany w dół. Należy sprawdzić położenie i kształt kropel, upewnić się, że piny płytki drukowanej (PCB) są wyrównane z stykami na chipie EWOD, podłączyć fotodetektor i umieścić go w gnieździe fotodetektora. Po podłączeniu elektroniki sterującej do komputera system jest gotowy do przeprowadzenia analizy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60489/60489fig2alarge.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres zależności prędkości kropli od napięcia; analiza liczby testów na płytkę; dane przedstawione z paskami błędów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60489/60489fig3large.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Powtarzalne użycie płyt uruchamiających i wpływ na napięcie uruchamiające. Prędkość średnia kropli z buforu roboczego została przedstawiona jako funkcja napięcia sterującego (niebieskie kółka) wraz z odchyleniem standardowym z trzech niezależnych pomiarów (N = 3). Liczba analiz na płytce (szare słupki) wskazuje tutaj na przyspieszoną degradację powierzchni przy wyższych napięciach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60489/60489fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat detekcji koniugatu kulek z antygenem i HRP w teście immunoanalitycznym, przedstawiający etapy ekstrakcji i detekcji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60489/60489fig4a.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Schemat immunoanaliz przetestowanych z wykorzystaniem EWOD. Każde koło na tym schemacie reprezentuje objętość 2.5 μL załadowane na chip EWOD. Pierwszy protokół (po lewej stronie) przedstawia osiem jednostek operacyjnych (LUO) z wykorzystaniem wcześniej zmieszanego koniugatu przeciwciała z HRP; natomiast drugi protokół obejmuje dziesięć LUO, z oddzielnym dodawaniem biotynilowanego przeciwciała detekcyjnego, ekstrakcją kulek oraz następującym po niej wiązaniem koniugatu Neutravidin-HRP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60489/60489fig4large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces separacji za pomocą kulek magnetycznych, sekwencja schematów; eksperyment z oczyszczania białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60489/60489fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5: Ekstrakcja za pomocą kulek magnetycznych. Proces ten podzielono na (a-c) przemieszczenie kropli z zawieszonymi kulkami magnetycznymi do miejsca separacji magnetycznej w środkowej części strefy mieszania (podkładka nr 3), (d, e) magnes przesuwa się na pozycję, skupiając kuleczki, (f, g, h) Kuleczki są utrzymywane w miejscu przez siłę magnetyczną, podczas gdy kropelka jest przemieszczana za pomocą EWOD w stronę podkładki odpadowej (podkładka nr 41). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60489/60489fig5alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.</a>
<img alt="Schemat cyfrowego mikroprzepływowego testu immunoenzymatycznego; etapy aktywacji kropel, odzyskiwania kulek oraz detekcji antygenu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60489/60489fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rycina 6: Pełna sekwencja immunoanalizy z wykorzystaniem EWOD, przedstawiająca odczynniki, wprowadzanie próbki oraz laboratoryjne operacje jednostkowe. Każdy wiersz zawiera sekwencję przykładowych obrazów przedstawiających charakterystyczne operacje na kropelce. Operacje są podzielone na kolumny. W przypadku kulek w zawiesinie, zaznaczonych czarną przerywaną linią, nie przeprowadzono mieszania. Kierunki ruchu kropelek wskazano niebieskimi strzałkami, a kulki wyróżniono na jednym z obrazów pomarańczową strzałką. Szary prostokąt (prawy dolny róg) oddziela dwa obrazy przedstawiające ruch i pozycję w obszarze detekcji, a okrąg z przerywanej linii zaznacza obszar detekcji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60489/60489fig6alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.</a>
<img alt="Wykres zależności sygnału z detektora od stężenia dla detekcji biomarkerów z użyciem sensorów nanowęglowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60489/60489fig7a.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Krzywe kalibracyjne z analiz immunoenzymatycznych przeprowadzonych na chipie EWOD z platformą DMF. Jak zgłoszono wcześniej6 zależność napięć wyjściowych (mV) od stężeń przedstawiono dla: (A) Albuminy surowicy ludzkiej, stosowane do badania wpływu stężenia [C] przeciwciała koniugatu oraz czasu inkubacji, tWłączony, mierzony od momentu zmieszania kulek z znanym analitym do ekstrakcji LUO, (B) B. atrophaeus zarodniki (BG) wykazujące powtarzalność testu immunoologicznego, (C) analiza immunoenzymatyczna bakteriofaga MS2 oraz (D) wyniki protokołu ten-LUO dla E. coliSkróty: jednostki tworzące kolonie (cfu), jednostki tworzące plak (pfu), liczba niezależnych doświadczeń (N), jednostkowa operacja laboratoryjna (LUO). Rysunek zmodyfikowany z poprzedniej publikacji6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60489/60489fig7large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Plik uzupełniający 1: Pełna sekwencja uruchamiania platformy DMF dla zautomatyzowanego testu ELISA z wykorzystaniem Neutravidyny-HRP jako koniugatu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60489/APPENDIX_A.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Przedstawiono interfejs graficzny (GUI) do pomiaru chemiluminescencji oraz przykład pomiaru wykonanego za pomocą tego oprogramowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60489/APPENDIX_B.docx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Cyfrowy mikrofluidyk oparty na elektrozwilżaniu to technika, która wykorzystuje sterowaną napięciem zmianę pozornego kąta zwilżania kropli o objętości mikrolitra, aby ułatwić jej manipulację. Połączenie tego z funkcjonalizowanymi kulkami magnetycznymi umożliwia integrację wielu operacji laboratoryjnych w celu przygotowania próbki i identyfikacji patogenów za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA).

Cyfrowa platforma mikroprzepływowa oparta na elektrozwilżaniu do zautomatyzowanego testu immunoenzymatycznego

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits ...

Automatyzacja aktywacji poszczególnych kropel pozwala na przeniesienie złożonych sekwencji działania jednostki laboratoryjnej do jednego chipa. Nasza cyfrowa platforma mikroprzepływowa zajmuje się szybkim, specyficznym wykrywaniem patogenów wirusowych w terenie. Metoda ta opiera się na ilościowym wykrywaniu określonych antygenów za pomocą mikrofluidyki cyfrowej opartej na EWOD w połączeniu z immunoprecypitacją magnetyczną.W tym artykule metoda jest oceniana na próbkach zawierających różne stężenia bakterii, zarodników, wirusów i białek. Proces ten jest w pełni zautomatyzowany, sekwencyjny, skalowalny i wszechstronny. Sekwencja i objętość kropli mogą być modyfikowane w celu dopasowania do wymagań określonego protokołu.Całkowicie rezygnując z wykrywania opartego na przeciwciałach, cyfrowa platforma mikrofluidyczna może stać się potencjalnym zastosowaniem opartym na biodetekcji aptamerowej, w której kulki magnetyczne przenoszą określone aptamery do wychwytywania i wykrywania sekwencji nukleotydowych. Wypróbowując tę technikę po raz pierwszy, ważne jest, aby wziąć pod uwagę rodzaj środka powierzchniowo czynnego i jego interakcję z wybraną biochemią i hydrofobową powłoką polimerową. Zacznij od wyjęcia magnesu z platformy cyfrowej mikrofluidyki lub DMF i umieszczenia go na stole.Umieść czystą płytkę uruchamiającą na obracającym się stage z chromem skierowanym do góry, wyrównując płytkę z lewym górnym rogiem wpuszczanego stolika. Zacisnąć płytkę uruchamiającą od góry za pomocą panelu z 47 kołkami stykowymi, które zabezpieczą płytkę na miejscu i ułatwią wyrównanie z kołkami stykowymi. Następnie umieść podkładkę o średnicy 0,5 milimetra i separator PMMA o średnicy dwóch milimetrów na stoliku obrotowym, aby zapewnić kontrolowaną szczelinę między płytami uruchamiającymi a pokrywą.Aby załadować kropelki na proponowane podkładki ładujące, należy podzielić cztery krople o pojemności 2,5 mikrolitra z bufora roboczego na B, A, R i E oznaczone elektrodami przy użyciu jednej kropli na podkładkę. Następnie podwielokrotność 2,5 mikrolitra roztworu nadtlenku wodoru luminolu na E oznaczane podkładką. Następnie podwielokrotność 2,5 mikrolitra neutrawidyny sprzężonej z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym HRP i mikrogranulkami na F, G i I oznaczały odpowiednio elektrody.Na koniec podwielokrotność 2,5 mikrolitra nieznanej próbki na C oznaczała podkładkę. Umieść pokrywę na powierzchni zestawu obok okrągłego wgłębienia i wsuń ją bocznie do wgłębienia i na górze płyty uruchamiającej. Umieść magnes trwały na górze pokrywy i zabezpiecz go, przesuwając dwa zatrzaski, a następnie obróć stolik o 180 stopni i sprawdź go wizualnie, aby upewnić się, że załadowane kropelki są nadal na swoim miejscu.Sprawdź, czy pozycja ładowania każdej kropli jest zgodna z zaprogramowaną sekwencją uruchamiania w oprogramowaniu. Umieść puszkę z ekranowanym fotodetektorem w szczelinie obrotowego stage i podłącz. Umieść pokrywę na platformie DMF i rozpocznij sekwencję programu za pomocą interfejsu oprogramowania.Lokalizacja kropli jest rejestrowana za pomocą czujnika pojemnościowego, a następnie może być obserwowana w interfejsie użytkownika. Sekwencja programu wyświetli komunikaty, które pojawią się na interfejsie, aby poinformować operatora, że kropla luminolu jest gotowa do zebrania wyekstrahowanych kulek magnetycznych lub kropla wykrywania jest gotowa do przeniesienia do miejsca detekcji. W obu przypadkach wymagane jest potwierdzenie od operatora, aby kontynuować.Natężenie światła wytwarzanego w reakcji chemiluminescencyjnej jest odczytywane przez fotodetektor i rejestrowane w czasie rzeczywistym. Aby działać w trybie wizualnym w celu optymalizacji protokołów, uruchom sekwencję programu za pomocą interfejsu oprogramowania. Automatyczne uruchamianie kropli można wizualizować na chipie dla każdego z krytycznych etapów testu, takich jak ekstrakcja magnetyczna kulek, ponowne zawieszenie i mieszanie kulek.Po wyświetleniu monitu zamontuj puszkę z ekranowanym fotodetektorem w szczelinie obracającego się stolika. Podłącz puszki ekranowanej fotodetektora, wkładając piny do gniazda. Umieść pokrywę na platformie DMF i wznów test.Kropelki są monitorowane za pomocą czujników pojemnościowych i można je obserwować w interfejsie użytkownika. Aby wyczyścić sprzęt, otwórz pokrywę platformy DMF i obróć stolik o 180 stopni. Odkręć obudowę magnesu i wyjmij magnes z obracającego się stage.Usuń wafel silikonowy z płytki za pomocą pęsety i spłucz go wodą destylowaną. Następnie wysusz go sprężonym powietrzem i umieść na szalce Petriego, gdzie wafel może być przechowywany i ponownie używany. Za pomocą mikropipety usuń płynne odpady z podkładki bez dotykania powierzchni i wyczyść powierzchnię, odprowadzając płyn z płytki uruchamiającej za pomocą chłonnego papieru.Aby zbadać wpływ napięcia uruchamiającego, kropla z bufora była napędzana przy różnych napięciach załączania i rejestrowano jej ruch. Wykazano korelację między Vrms a średnią prędkością i zaobserwowano plateau prędkości po określonej wartości Vrms. Żywotność płytki uruchamiającej uległa zmniejszeniu, gdy zastosowano wysokie wartości Vrms.W przypadku pracy laboratorium ekstrakcyjnego kropla zawierająca zawieszone kulki została doprowadzona do miejsca separacji w środku strefy mieszania. Następnie magnes został automatycznie aktywowany, aby zbliżyć się do chipa i skupić koraliki. Następnie kropla została przesunięta w kierunku podkładki na odpady, pozostawiając koraliki.Operacje laboratoryjne jednostki ekstrakcji i mieszania na chipie EWOD ułatwiły zminiaturyzowane, szybkie i powtarzalne przetwarzanie próbek z sekwencyjnym wykrywaniem patogenów w ciągu 6 do 10 minut. Czasy inkubacji i stężenia sprzężone były zróżnicowane w celu znalezienia optymalnych warunków dla testu. Stwierdzono, że czas inkubacji wynoszący 160 sekund i sprzężone stężenie wynoszące dwa mikrogramy na mililitr osiągnęły najlepszy stosunek sygnału do szumu.Warianty protokołu mogą być wprowadzane w celu osiągnięcia pożądanych poziomów automatyzacji. Ośmioetapowy test ELISA wykorzystano do wykrycia różnych antygenów, takich jak przetrwalniki Bacillus atrophaeus i bakteriofag MS2. Tymczasem 10-etapowy protokół został wykorzystany do ilościowego określenia E. coli.Ważne jest, aby upewnić się, że zastosowane napięcia, stężenia analitów i odczynników są optymalne dla aktywacji kropelek i pomyślnej separacji magnetycznej na chipie. Aby uzyskać precyzyjny pomiar, należy wziąć pod uwagę zdolność wiązania perełek i może być konieczne seryjne rozcieńczanie analitów. Wymieniając się rodzajem przeciwciał, można było wykryć inne patogeny niż ten opisany w sekcji wyników.Metoda ta może być również stosowana na przykład do wykrywania biomarkerów lub diagnostyki w miejscu opieki nad pacjentem. Oprócz już zaprezentowanych zastosowań, system został opracowany z myślą o wykrywaniu patogenów przenoszonych drogą powietrzną w terenie. DMF jest idealną platformą do tego zastosowania, ponieważ objętość kropli odpowiada wynikowi innego samplera, który ostatnio opracowaliśmy.

electrowetting-based-digital-microfluidics-platform-for-automated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Cyfrowa mikroprzepływność to technika polegająca na manipulowaniu pojedynczymi kroplami (~nL - mL) na macierzy elektrod poprzez przykładanie pól elektrycznych. Jest ona odpowiednia do przeprowadzania szybkich, sekwencyjnych, zminiaturyzowanych zautomatyzowanych analiz biochemicznych. W niniejszej pracy przedstawiamy platformę zdolną do automatyzacji kilku etapów przetwarzania proteomicznego.

Cyfrowa mikroprzepływowość w zautomatyzowanym przetwarzaniu proteomicznym

Opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę do hodowli komórek i przesłuchań do eksperymentów stymulacji komórek na mikroskalę.  Platforma oferuje prostą, wszechstronną i precyzyjną kontrolę w hodowli i stymulacji małych populacji komórek oraz odzyskiwaniu lizatów do analiz molekularnych.  Platforma doskonale nadaje się do badań, w których wykorzystuje się cenne komórki i/lub odczynniki.

Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

W tym artykule prezentujemy mikroprzepływowy chip do analizy pojedynczych komórek. Umożliwia ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowych białek, enzymów, kofaktorów i drugich przekaźników za pomocą testów fluorescencyjnych lub testów immunologicznych.

Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

Prezentujemy metodę szybkiego, odwracalnego unieruchamiania małych cząsteczek i funkcjonalizowanych zespołów nanocząstek do badań powierzchniowego rezonansu plazmonów (SPR), wykorzystując sekwencyjną bioortogonalną chemię cykloaddycji na chipie i wychwytywanie przeciwciała-antygen.

Mikroprzepływowa reakcja wychwytywania-cykloaddycji w układzie scalonym w celu odwracalnego unieruchomienia małych cząsteczek lub struktur wieloskładnikowych do zastosowań w biosensorach

Prezentujemy mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do wykrywania hybrydyzacji DNA. Po funkcjonalizacji sondy ssDNA bada się swoistość, czułość i granicę wykrywalności za pomocą komplementarnych i niekomplementarnych celów ssDNA. Wyniki ilustrują wpływ zdarzeń hybrydyzacji DNA na układ elektrochemiczny, przy granicy wykrywalności wynoszącej 3,8 nM.

Mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do bezznacznikowej analizy hybrydyzacji DNA

Ten protokół pokazuje, jak osiągnąć czułość wykrywania femtomolowych białek w 10 μL pełnej krwi w ciągu 30 minut. Można to osiągnąć dzięki zastosowaniu elektroprzędzonych mat nanowłóknistych zintegrowanych w lab-on-a-disc, który oferuje dużą powierzchnię, a także skuteczne mieszanie i mycie w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu.

W pełni zautomatyzowane odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe do ultraczułego wykrywania białek z krwi pełnej

Systemy reakcji typu lab-in-a-drop pozwalają na wszechstronne przeprowadzanie złożonych reakcji w skali mikroprzepływowej. Opracowano zautomatyzowaną platformę uruchamiającą składającą się z matrycy cewek elektromagnetycznych o wymiarach 3 x 3, która z powodzeniem została wykorzystana do połączenia dwóch mikroreaktorów o pojemności 10 μl, a tym samym zainicjowania reakcji enzymatycznej w powstałych płynnych kulkach.

Kropelki wodne stosowane jako mikroreaktory enzymatyczne i ich elektromagnetyczne uruchamianie

Prezentujemy platformę mikroprzepływową ze zintegrowaną siecią elektrod powierzchniowych, która łączy rezystancyjne wykrywanie impulsów (RPS) z wielokrotnym dostępem z podziałem kodu (CDMA), do wielokrotnego wykrywania i wymiarowania cząstek w wielu kanałach mikroprzepływowych.

Platforma mikroprzepływowa z multipleksowaną detekcją elektroniczną do przestrzennego śledzenia cząstek

Zademonstrowano test immunologiczny oparty na naczyniach włosowatych, wykorzystujący komercyjną platformę do pomiaru docelowych białek z całkowitych preparatów białkowych. Ponadto parametry testowe czasu ekspozycji, stężenia białka i rozcieńczenia przeciwciał są zoptymalizowane pod kątem systemu modelowego hodowli komórkowych.

Procedura i kluczowe strategie optymalizacyjne dla zautomatyzowanej metody immunologicznego opartego na elektroforetycznych naczyniach włosowatych

Platforma mikroprzepływowego biosensoru została zaprojektowana i wykonana przy użyciu taniej technologii fotorezystu z suchą folią do szybkiej i czułej kwantyfikacji różnych analitów. Ten jednorazowy system pozwala na elektrochemiczny odczyt testów enzymatycznych immobilizowanych na chipie za pomocą techniki stop-flow.

Elektrochemiczna platforma biosensorów mikroprzepływowych oparta na suchym filmie fotorezystu: produkcja urządzenia, przygotowanie testu na chipie i obsługa systemu

Mikrofluidyka to potężne narzędzie do tworzenia testów diagnostycznych. Jednak często wymagany jest drogi sprzęt i materiały, a także pracochłonne techniki wytwarzania i obsługi. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół wytwarzania akrylowego urządzenia mikroprzepływowego do magnetycznych testów immunologicznych opartych na mikro- i nanocząsteczkach w tanich i prostych w użyciu.

Mikromielenie mikroprzepływowe urządzenia akrylowego sterowane numerycznie z ograniczeniem naprzemiennym dla testów immunologicznych opartych na nanocząstkach magnetycznych

Poznaj cyfrową mikroprzepływową platformę opartą na elektrozwilżaniu do automatycznego wykrywania patogenów wirusowych. Metoda łączy magnetyczną immunoprecypitację z manipulacją kroplami, skracając czas testu do 6-10 minut.

Cyfrowa platforma mikroprzepływowa oparta na elektrozwilżaniu do zautomatyzowanego testu immunoenzymatycznego

Przeglądaj więcej filmów