Name: Chirurgia powierzchownych węzłów chłonnych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: Naucz się chirurgicznego usuwania węzłów chłonnych u myszy do badania odpowiedzi immunologicznej w czasie. Technika obejmuje lokalizację, pobieranie i przygotowanie zawiesiny komórkowej do analizy cytometrii przepływowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Sylvie Lesage oraz wszystkim członkom laboratorium za krytyczną analizę protokołu. Praca ta była finansowana z grantu (MOP-77545) przyznanego przez Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Nathalie Labrecque korzysta ze wsparcia stypendium FRSQ Senior Scholarship, a Mélissa Mathieu otrzymała stypendium NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship.

1. Przygotowanie przed operacją
Myszy były traktowane zgodnie z wytycznymi Canadian Council on Animal Care.
<ol>
	<li>Zanurz myszy w narkozie poprzez wstrzyknięcie ketaminy/ksylazyny (150/300 mg/kg, i.p.) lub poprzez inhalację izofluranu (2%, 1L tlenu). Jeśli jest dostępny, należy stosować izofluran, ponieważ pozwala on na lepszą kontrolę czasu i głębokości znieczulenia. Jednocześnie podawany jest tlen, który wspiera funkcje fizjologiczne zwierzęcia. Co więcej, izofluran jest bezpośrednio usuwany przez płuca, w związku z czym nie wymaga metabolizmu wątrobowego ani nerkowego.</li>
	<li>Wstrzyknij buprenorfinę (0,05 - 0,1 mg/kg, s.c.) lub inny lek przeciwbólowy.</li>
	<li>Przed operacją nałóż maść na oczy myszy, aby zapobiec ich wysychaniu (w przypadku stosowania izofluranu).</li>
	<li>Sprawdź, czy mysz śpi, uciskając jej łapę i obracając ogonem. Jeśli mysz nie reaguje, przystąp do zabiegu chirurgicznego.</li>
</ol>
2. Operacja
Za pomocą zabiegu chirurgicznego możliwe jest usunięcie 4 powierzchownych węzłów chłonnych (LN): 2 pachwinowych oraz 2 ramiennych. Izolacja LN jest łatwiejsza u młodych, szczupłych myszy (6-8 tygodni), ponieważ obecność tkanki tłuszczowej u starszych myszy może utrudniać izolację LN. Ograniczenie to można jednak pokonać dzięki regularnej praktyce. Dla komfortu myszy pobieramy maksymalnie 2 LN jednocześnie, a w przypadku eksperymentów z analizą przebiegu czasowego, pobieramy LN co drugi dzień. Ponadto, aby zapobiec infekcji, myszy można podawać antybiotyki, jednak my tego nie robimy, a rany goją się prawidłowo. Należy mieć na uwadze, że w zależności od projektu eksperymentalnego zastosowanie antybiotyku może wpłynąć na zaobserwowany wynik (na przykład w przypadku pomiaru odpowiedzi na bakterię). Należy pamiętać, że wszystkie narzędzia są sterylizowane po każdym użyciu, a podczas wszystkich procedur zachowane są warunki aseptyczne.
<ol>
	<li>Połóż mysz na boku.</li>
	<li>Zlokalizuj obszar, w którym wykonasz nacięcie, w zależności od węzła chłonnego (LN), który chcesz pobrać (Rysunek 1).</li>
	<li>Nanieś chlorheksydynę lub inny środek dezynfekujący na ten obszar.</li>
	<li>Wykonaj niewielkie nacięcie ostrymi nożyczkami (około 5 mm) albo na tylnej części przedniej kończyny, albo nad tylną łapą w pobliżu brzucha (Rysunek 1).</li>
	<li>Za pomocą pęsety usuń luźne, odcięte włosy. Jeśli wolisz, możesz ogolić mysz przed wykonaniem nacięcia. Wydłuża to jednak procedurę, a naszym zdaniem nie jest to konieczne, ponieważ, jak pokazano tutaj, nie poprawia to gojenia ani nie zmniejsza ryzyka infekcji, które w obu przypadkach zdarzają się bardzo rzadko.</li>
	<li>Rozszerz nacięcie za pomocą dwóch pęset, aby zobaczyć LN. Nacięcie może osiągnąć 10 mm. LN ma kolor szary lub jest ciemniejszy niż otaczająca go tkanka tłuszczowa.</li>
	<li>Chwyć pęsetą powięź (cienką błonę pokrywającą tłuszcz i tkankę) nad LN i lekko pociągnij, nie uszkadzając otaczającej tkanki.</li>
	<li>Umieść drugą pęsetę jak najgłębiej pod LN. Pierwszą pęsetą przerwij powięź i usuń LN. Jeśli udało się pobrać LN, w miejscu, w którym wcześniej się znajdował, powinna pojawić się plamka krwi. Należy zauważyć, że LN tonie w roztworze izotonicznym. Ten prosty test pozwala potwierdzić, że wyizolowano LN, a nie tkankę tłuszczową.</li>
	<li>Upewnij się, że w ranie nie pozostały żadne włosy.</li>
	<li>Zamknij nacięcie, złączając obie części skóry (od wewnątrz) i spinając je klipsem. Używamy klipsów Michel Clip wraz z pęsetą aplikacyjną. Załóż jeden lub dwa klipsy, w zależności od wielkości nacięcia. Najczęściej klipsy odpadają samoistnie w miarę gojenia się tkanki.</li>
</ol>
3. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Na dnie klatki należy umieścić mokrą karmę, aby myszy mogły łatwo się żywić po operacji.</li>
	<li>Około 6 do 8 godzin po zabiegu należy sprawdzić stan myszy, aby upewnić się, że nie odczuwają one bólu. Należy uważnie obserwować ich zachowanie (postawę, chód, interakcje z osobnikami tego samego gatunku oraz wygląd futra). Jeśli ogólny stan myszy jest zły, należy podać drugą dawkę buprenorfiny. Do następnego dnia myszy powinny odzyskać normalne zachowanie; w przeciwnym razie należy kontynuować podawanie buprenorfiny. Myszy nie mogą osiągnąć punktów końcowych wcześniej określonych i zaakceptowanych przez właściwą Radę ds. Opieki nad Zwierzętami (Animal Care Council). W razie potrzeby można zwrócić się o poradę i pomoc do technika laboratorium zwierzęcego.</li>
</ol>
4. Postępowanie z węzłami chłonnymi
<ol>
	<li>W laboratorium, w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek, przeprowadź dysocjację LN zgodnie ze swoją standardową procedurą. My dociskamy LN do matowych szkiełek i rutynowo uzyskujemy 1-2 x 106 komórek z jednego LN. Alternatywnie przygotowujemy LN do ekstrakcji RNA.</li>
	<li>Przeprowadź barwienie komórek zgodnie ze swoim standardowym protokołem. Powinny zostać uzyskane oczekiwane profile cytometrii przepływowej LN.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Przykład wykresu rozproszenia przedniego i bocznego pokazano dla węzłów chłonnych (LN) pobranych od znieczulonej myszy drogą chirurgiczną lub od myszy uśmierconej (Rycina 2). Profil oraz odsetki komórek w bramce dla żywych limfocytów są takie same, co dowodzi, że chirurgiczne pobieranie LN jest odpowiednią techniką pozyskiwania komórek.
<img alt="Porównanie anatomii myszy; schematy widoku bocznego z zaznaczonymi strukturami szkieletowymi, badanie naukowe." src="/files/ftp_upload/3444/3444fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Lokalizacja węzłów chłonnych (LN) pachwinowych i ramiennych u myszy. A. Węzeł chłonny pachwinowy znajduje się tuż nad tylną łapą, lekko w stronę brzucha. B. Węzeł chłonny ramienny znajduje się za przednią nogą.
<img alt="Schemat cytometrii przepływowej; porównanie próbek pobranych od myszy znieczulonej i uśmierconej; analiza danych SSC-A vs. FSC-A." src="/files/ftp_upload/3444/3444fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Profil cytometrii przepływowej limfocytów uzyskanych po operacji węzłów chłonnych (LN). Przedstawiono profile rozproszenia przedniego (FSC) i bocznego (SSC) dla LN pobranych chirurgicznie od znieczulonej myszy (A) lub od uśmierconej myszy (B). Węzły chłonne zostały pobrane, zdysocjowane i przeanalizowane za pomocą cytometru przepływowego. Podano procenty komórek w bramce żywych limfocytów.

<ol><li>Zehn, D., Lee, S. Y., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+but+curtailed+T-cell+response+to+very+low-affinity+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complete but curtailed T-cell response to very low-affinity antigen.</a> Nature. 458, 211-214 (2009).</li>
<li>Vezys, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+CD8+T-cell+compartment+grows+in+size+with+immunological+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Memory CD8 T-cell compartment grows in size with immunological experience.</a> Nature. 457, 196-199 (2009).</li>
<li>Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+persistence+of+memory+CD8%28%2B%29+T+cells+depend+on+T+cell+factor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Differentiation and persistence of memory CD8(+) T cells depend on T cell factor 1.</a> Immunity. 33, 229-240 (2010).</li>
<li>Wirth, T. C., Badovinac, V. P., Zhao, L., Dailey, M. O., Harty, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+central+memory+CD8+T+cells+is+independent+of+CD62L-mediated+trafficking+to+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of central memory CD8 T cells is independent of CD62L-mediated trafficking to lymph nodes.</a> J. Immunol. 182, 6195-6206 (2009).</li>
<li>Rooke, R., Waltzinger, C., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+complementation+of+MHC+class+II+deficiency+by+intrathymic+delivery+of+recombinant+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Targeted complementation of MHC class II deficiency by intrathymic delivery of recombinant adenoviruses.</a> Immunity. 7, 123-134 (1997).</li>
<li>Witherden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetracycline-controllable+selection+of+CD4%28%2B%29+T+cells%3A+half-life+and+survival+signals+in+the+absence+of+major+histocompatibility+complex+class+II+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Tetracycline-controllable selection of CD4(+) T cells: half-life and survival signals in the absence of major histocompatibility complex class II molecules.</a> J. Exp. Med. 191, 355-364 (2000).</li>
<li>Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+much+TCR+does+a+T+cell+need%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">How much TCR does a T cell need.</a> Immunity. 15, 71-82 (2001).</li>
<li>Leignadier, J., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+density+influences+CD8%2B+memory+T+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Epitope density influences CD8+ memory T cell differentiation.</a> PLoS One. 5, e13740(2010).</li>
<li>Leignadier, J., Hardy, M. P., Cloutier, M., Rooney, J., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T-lymphocyte+survival+does+not+require+T-cell+receptor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Memory T-lymphocyte survival does not require T-cell receptor expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20440-20445 (2008).</li>
<li>Obst, R., van Santen, H. M., Mathis, D., Benoist, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+persistence+is+required+throughout+the+expansion+phase+of+a+CD4%28%2B%29+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Antigen persistence is required throughout the expansion phase of a CD4(+) T cell response.</a> J. Exp. Med. 201, 1555-1565 (2005).</li>
<li>Bassett, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T-cell+expansion+and+maintenance+after+recombinant+adenovirus+immunization+rely+upon+cooperation+between+hematopoietic+and+nonhematopoietic+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD8+ T-cell expansion and maintenance after recombinant adenovirus immunization rely upon cooperation between hematopoietic and nonhematopoietic antigen-presenting cells.</a> Blood. 117, 1146-1155 (2011).</li>
<li>Lacombe, M. H., Hardy, M. P., Rooney, J., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7+receptor+expression+levels+do+not+identify+CD8%2B+memory+T+lymphocyte+precursors+following+peptide+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-7 receptor expression levels do not identify CD8+ memory T lymphocyte precursors following peptide immunization.</a> J. Immunol. 175, 4400-4407 (2005).</li>
<li>Leignadier, J., Rooney, J., Daudelin, J. F., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lowering+TCR+expression+on+naive+CD8%2B+T+cells+does+not+affect+memory+T-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lowering TCR expression on naive CD8+ T cells does not affect memory T-cell differentiation.</a> Immunol. Cell. Biol. 89, 322-325 (2011).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Opisaliśmy protokół operacyjnego usuwania węzłów chłonnych (LN), który może mieć zastosowanie w wielu systemach eksperymentalnych. Mimo że technika ta jest bardzo użyteczna do śledzenia odpowiedzi immunologicznych lub homeostazy komórek odpornościowych, posiada ona kilka ograniczeń. Po pierwsze, można pobrać tylko cztery LN. Po drugie, badana odpowiedź immunologiczna musi mieć charakter systemowy lub występować w powierzchownych LN pachwinowych lub ramiennych (odprowadzających chłonkę ze skóry). Wreszcie, liczba pobranyc...

<table><tbody><tr><td>Pinceta precyzyjna Graefe Premium</td><td>Harvard Apparatus</td><td>52-2144</td><td>Silnie zakrzywiona, 10 cm (4 in), końcówka 0.8 mm</td></tr><tr><td>Pinceta do zakładania i zdejmowania klipsów Michela</td><td>Harvard Apparatus</td><td>52-3779</td><td>12.5 cm (5 in)</td></tr><tr><td>Klips Michela 100</td><td>Harvard Apparatus</td><td>52-3746</td><td>7.5-1.75 mm</td></tr><tr><td>Temgesic (chlorowodorek buprenorfiny)</td><td>Merck &amp;amp; Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetalar (chlorowodorek ketaminy)</td><td>Bioniche Animal Health</td><td></td><td>DIN: 01989529</td></tr><tr><td>Rompun (ksylazyna)</td><td>Bayer AG</td><td></td><td>DIN: 02169592</td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Abbott Laboratories</td><td></td><td>DIN: 02032384</td></tr><tr><td>Maść do oczu Hypotears</td><td>Novartis AG</td><td></td><td>DIN: 02133288</td></tr><tr><td>Baxedin (glukonian chlorheksydyny 2% w alkoholu izopropylowym 70%)</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>L0000017</td><td>DIN: 02251477</td></tr></tbody></table>

chirurgiczne usuwanie powierzchownych węzłów chłonnych u myszy

Murine Superficial Lymph Node Surgery

W dziedzinie immunologii, aby zrozumieć przebieg odpowiedzi immunologicznej na szczepionkę, infekcję lub nowotwór, często monitoruje się tę odpowiedź w czasie. Podobnie, badanie homeostazy limfocytów wymaga eksperymentów w serii czasowej. Przeprowadzanie takich badań na tej samej myszy jest idealnym rozwiązaniem, pozwalającym ograniczyć zmienność eksperymentalną oraz liczbę wykorzystanych zwierząt. Pobieranie krwi umożliwia realizację eksperymentów w serii czasowej, lecz dostarcza informacji jedynie o limfocytach krążących i zapewnia ograniczoną liczbę komórek1-4. Ponieważ limfocyty krążące w organizmie oraz rezydujące w węzłach chłonnych posiadają różne właściwości, istotne jest zbadanie obu tych lokalizacji. Sekwencyjne usuwanie węzłów chłonnych drogą chirurgiczną stwarza wyjątkową okazję do śledzenia odpowiedzi immunologicznej lub ekspansji komórek odpornościowych u tej samej myszy w czasie. Co więcej, technika ta pozwala uzyskać od 1-2x106 komórek z jednego węzła chłonnego, co jest wystarczające do przeprowadzenia charakterystyki fenotypowej i/lub testów funkcjonalnych. Sekwencyjna chirurgia węzłów chłonnych lub limfadenektomia była z powodzeniem stosowana przez nas oraz innych badaczy5-11. W niniejszej pracy opisujemy, w jaki sposób można usunąć węzły chłonne ramienne i pachwinowe, wykonując niewielkie nacięcie skóry znieczulonej myszy. Ponieważ zabieg jest powierzchowny i przeprowadzany szybko, mysz bardzo szybko wraca do zdrowia, dobrze się goi i nie odczuwa nadmiernego bólu. Co drugi dzień możliwe jest pobranie jednego lub dwóch węzłów chłonnych, co pozwala na prowadzenie eksperymentów w serii czasowej. Technika ta jest zatem odpowiednia do badania charakterystyki limfocytów rezydujących w węzłach chłonnych w czasie. Podejście to nadaje się do różnych schematów eksperymentalnych i wierzymy, że wiele laboratoriów odniesie korzyść z przeprowadzania sekwencyjnych zabiegów chirurgicznych węzłów chłonnych.

Aby śledzić przebieg odpowiedzi immunologicznej w czasie u tej samej myszy, węzły chłonne można usuwać sekwencyjnie drogą chirurgiczną. W niniejszym materiale opisujemy sposób wykonania tej techniki.

Chirurgiczne usuwanie powierzchownych węzłów chłonnych u myszy

W dziedzinie immunologii, aby zrozumieć przebieg odpowiedzi immunologicznej przeciwko szczepionce, infekcji lub nowotworowi, odpowiedź tę często...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest chirurgiczne usunięcie węzłów chłonnych u znieczulonej myszy. Realizuje się to poprzez najpierw zlokalizowanie węzłów chłonnych. Następnie pobiera się węzły chłonne, a po ich usunięciu zamyka się nacięcie.Na koniec, do analizy eksperymentalnej można uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. W ostateczności żywe populacje limfocytów można ocenić za pomocą cytometrii przepływowej. Wizualna demonstracja tej techniki jest kluczowa, ponieważ lokalizacja i usuwanie węzłów chłonnych muszą zostać zaprezentowane, aby można było opanować tę procedurę.Po znieczuleniu myszy należy nałożyć maść do oczu, podać buprenorfinę i potwierdzić sedację za pomocą ucisku palca u nogi, a następnie ułożyć mysz na boku. Najpierw należy zlokalizować węzeł chłonny pachwinowy, a następnie ogolić obszar przeznaczony do sekcji. Po usunięciu luźnych włosów pędzlem, należy zastosować środek dezynfekujący w tym obszarze, a następnie wykonać niewielkie nacięcie o długości około five millimeters na grzbiecie przedniej kończyny.Za pomocą dwóch par pęset rozszerz nacięcie, aż do momentu, gdy będzie widoczny węzeł chłonny pachowy, który może mieć szary kolor lub być ciemniejszy od otaczającej go tkanki tłuszczowej. Następnie jedną pęsetą uchwyć powięź pokrywającą węzeł chłonny. Drugą pęsetę umieść jak najgłębiej pod węzłem chłonnym i lekko pociągnij błonę, uważając, aby nie przerwać otaczającej tkanki.Następnie za pomocą pierwszej pary pęsety przerwij powięź i wyjmij węzeł chłonny. Jeśli węzeł chłonny został pomyślnie pobrany, w miejscu jego wcześniejszego położenia pojawi się ślad krwi. Umieść wycięty węzeł chłonny w roztworze izotonicznym; jeśli tkanka opadnie na dno, potwierdzi to, że pobrany materiał jest węzłem chłonnym, a nie tkanką tłuszczową.Następnie należy upewnić się, że w ranie nie znajdują się żadne włosy, a następnie zamknąć nacięcie, dociskając do siebie wewnętrzne brzegi skóry i staplując je za pomocą jednego lub dwóch zszywek, w zależności od wielkości nacięcia. Teraz należy zlokalizować węzeł chłonny pachwinowy i ogolić obszar przeznaczony do wycięcia. Po usunięciu szczotką luźnych włosów należy zastosować środek dezynfekujący w tym regionie, a następnie wykonać niewielkie nacięcie o długości około 5 mm powyżej tylnej łapy, w pobliżu brzucha.Po rozszerzeniu nacięcia za pomocą dwóch par pęset, tak jak pokazano przed chwilą w przypadku węzła chłonnego ramiennego, zidentyfikuj węzeł chłonny pachwinowy znajdujący się w otaczającej go tkance tłuszczowej. Następnie usuń węzeł chłonny za pomocą dwóch par pęset, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Ponownie potwierdź pomyślne pobranie węzła chłonnego, zwracając uwagę na ślad krwi pojawiający się w miejscu, w którym wcześniej znajdował się węzeł, a następnie przełóż węzeł chłonny pachwinowy do osobnego pojemnika z roztworem izotonicznym.Po pobraniu wszystkich węzłów chłonnych umieść mysz w klatce i podaj mokrą karmę, aby zwierzę mogło łatwo się odżywić. Około sześciu do ośmiu godzin po zabiegu sprawdź stan myszy, aby upewnić się, że nie odczuwa ona bólu. Uważnie obserwuj, czy postawa, chód, interakcje z towarzyszami z klatki oraz wygląd futra są zbliżone do tych u zdrowej myszy.Na koniec rozdziel węzeł chłonny, dociskając go do szkiełek matowych w szalce Petriego, a następnie przenieś go do probówki, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Po zabarwieniu komórek pod kątem interesujących antygenów powierzchniowych, poddaj je analizie za pomocą cytometrii przepływowej. Poniżej przedstawiono przykładowe wykresy rozproszenia forward scatter oraz side scatter dla węzłów chłonnych pobranych od zwierząt zanieczulonych lub uśmierconych.Profile oraz odsetki komórek w bramkach dla żywych limfocytów na obu wykresach rozrzutu są takie same. Dowodzi to, że operacja usunięcia węzła chłonnego jest odpowiednią techniką pozyskiwania komórek. Po opanowaniu metody, operacja usunięcia węzła chłonnego może zostać przeprowadzona w czasie od 5 do 10 minut na mysz, pod warunkiem właściwego wykonania.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Chirurgia węzła chłonnego powierzchownego u myszy

Przedstawiono technikę wykonywania mikroskopii intravitalnej węzła chłonnego (LN) pachwinowego. Technika ta umożliwia badanie mikrokrążenia i struktury węzła chłonnego w czasie rzeczywistym, in vivo, zarówno w stanie homeostazy, jak i podczas infekcji. Metoda ta może zostać dostosowana do badań nad migracją komórek oraz do analizy innych lokalizacji węzłów chłonnych.

Mikroskopia wewnątrzżyciowa węzła chłonnego pachwinowego

Ten film demonstruje procedurę chirurgicznej izolacji węzła chłonnego drenującego pachwinę na modelu mysim. Nacięcie okolicy brzusznej zapewnia dostęp do pachwinowego węzła chłonnego, który jest pobierany chirurgicznie. Pobrany półprzezroczysty pachwinowy węzeł chłonny można wykorzystać do badań immunologicznych.

Pobieranie węzła chłonnego drenującego pachwiny z modelu mysiego

Tutaj opisujemy minimalnie inwazyjną technikę laparoskopową do seryjnego pobierania próbek wątroby i krezkowych węzłów chłonnych (MLN) u makaków, która pozwala na zwiększenie częstotliwości pobierania próbek i zmniejsza ryzyko powikłań chirurgicznych w porównaniu do wykonywania laparotomii.

Technika laparoskopowa do seryjnego pobierania węzłów chłonnych wątroby i krezki u makaków

Ten protokół opisuje technikę obrazowania różnych populacji komórek w drenujących węzłach chłonnych bez zmian w strukturze narządu.

Wizualizacja struktury węzłów chłonnych i lokalizacji komórkowej za pomocą mikroskopii konfokalnej ex-vivo

Ten model zwierzęcy umożliwia badaczom wywołanie statystycznie istotnego wtórnego obrzęku limfatycznego w tylnej kończynie myszy, trwającego co najmniej 8 tygodni. Model może być wykorzystany do badania patofizjologii obrzęku limfatycznego i badania nowych opcji leczenia.

Zmieniona metoda wywoływania wtórnego obrzęku limfatycznego w tylnej kończynie myszy

Przedstawiono protokół blokowania przepływu limfy poprzez chirurgiczne zszywanie doprowadzających naczyń limfatycznych.

Blokowanie przepływu limfy poprzez zszywanie aferentnych naczyń limfatycznych u myszy

Obrzęk limfatyczny to obrzęk kończyn spowodowany dysfunkcją układu limfatycznego. Opisujemy przewlekły model obrzęku limfatycznego mysiego ogona i nowatorskie zastosowanie technologii nanotransfekcji tkanek (TNT) do dostarczania ładunku genetycznego do ogona.

Model obrzęku limfatycznego mysiego ogona

Obecny protokół opisuje mysi model ablacji unerwienia adrenergicznego poprzez identyfikację i resekcję górnego zwoju szyjnego.

Technika chirurgiczna dla górnej ganglionektomii szyjki macicy w modelu mysim

Protokół ten opisuje procedurę przeżycia dla bezpiecznej i dobrze tolerowanej obustronnej limfadenektomii nerki u myszy.

Grzybicza limfadenektomia nerek u myszy

Protokół ten opisuje procedurę przeżycia dla bezpiecznej i dobrze tolerowanej mysiej krezki limfadenektomii na każdym z czterech stacji wzdłuż łańcucha węzłów chłonnych krezki. Procedura ta jest adaptowalna, aby umożliwić selektywne zakłócenie komunikacji limfatycznej z dalszym jelitem grubym, bliższym i/lub jelitem cienkim.

Mysia krezkowa limfadenektomia w celu selektywnego zakłócenia komunikacji limfatycznej z jelitem specyficznym dla regionu

Naucz się chirurgicznego usuwania węzłów chłonnych u myszy do badania odpowiedzi immunologicznej w czasie. Technika obejmuje lokalizację, pobieranie i przygotowanie zawiesiny komórkowej do analizy cytometrii przepływowej.

Chirurgiczne usuwanie powierzchownych węzłów chłonnych u myszy

Przeglądaj więcej filmów