Chirurgia powierzchownych węzłów chłonnych myszy
May 21st, 2012
Aby śledzić postęp odpowiedzi immunologicznej w czasie u tej samej myszy, węzły chłonne mogą być sekwencyjnie usuwane chirurgicznie. Tutaj opisujemy, jak można wykonać tę technikę.
Ogólnym celem tej procedury jest chirurgiczne usunięcie węzłów chłonnych ze znieczulonej myszy. Osiąga się to poprzez pierwszą lokalizację węzłów chłonnych. Pobiera się węzły chłonne, a następnie zamyka się nacięcie.
Na koniec można uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki do analizy eksperymentalnej. Ostatecznie żywotne populacje limfocytów można ocenić za pomocą cytometrii przepływowej. Wizualna demonstracja tej techniki ma kluczowe znaczenie, ponieważ lokalizacja i usuwanie węzłów chłonnych muszą być oglądane, aby można je opanować.
Po znieczuleniu myszy nałóż maść do oczu, wstrzyknij buprenorfinę i potwierdź sedację przez uszczypnięcie palca, a następnie obróć mysz na bok. Najpierw zlokalizuj węzeł chłonny ramienny, a następnie ogol obszar, który ma zostać wypreparowany. Po wyszczotkowaniu luźnych włosów nałóż środek dezynfekujący na ten obszar, a następnie wykonaj małe nacięcie o długości około pięciu milimetrów z tyłu czterech nóg.
Użyj dwóch par kleszczy, aby rozciągnąć nacięcie, aż do węzła chłonnego ramiennego, który może wydawać się szarawy lub ciemniejszy niż otaczający tłuszcz. Następnie ściśnij powięź pokrywającą węzeł chłonny jedną parą kleszczy. Umieść drugą parę kleszczy jak najdalej pod węzłem chłonnym i lekko pociągnij za błonę, nie przerywając otaczającej tkanki.
Następnie użyj pierwszej pary kleszczy, aby przełamać powięź i usunąć węzeł chłonny. Jeśli węzeł chłonny został pomyślnie pobrany, w miejscu, w którym wcześniej znajdował się węzeł chłonny, pojawi się plama krwi. Umieść wycięty węzeł chłonny w roztworze izotonicznym, jeśli tonie, co potwierdzi, że pobrana tkanka jest węzłem chłonnym, a nie tłuszczem.
Następnie sprawdź, czy w ranie nie ma włosów i zamknij nacięcie, sklejając ze sobą dwa wnętrza skóry i zszywając je jednym lub dwoma klipsami, w zależności od wielkości nacięcia. Teraz zlokalizuj pachwinowy węzeł chłonny i ogol obszar, który ma być wycięty. Po wyczesaniu luźnych włosów nałóż środek dezynfekujący na ten obszar, a następnie wykonaj małe nacięcie około pięciu milimetrów nad tylną łapą w pobliżu brzucha.
Po otwarciu nacięcia dwiema parami kleszczy, jak pokazano dla węzła chłonnego ramiennego, zidentyfikuj pachwinowy węzeł chłonny zagnieżdżony w otaczającej tkance tłuszczowej. Następnie usuń węzeł chłonny za pomocą dwóch par kleszczy, jak właśnie pokazano. Ponownie potwierdź pomyślne pobranie węzła chłonnego, zwracając uwagę na plamę krwi, która pojawia się w miejscu, w którym wcześniej znajdował się węzeł chłonny, a następnie wrzuć pachwinowy węzeł chłonny do osobnego pojemnika z roztworem izotonicznym.
Po pobraniu wszystkich węzłów chłonnych umieść mysz w klatce i dodaj mokrą karmę, aby mysz mogła łatwo się odżywiać. Po operacji około sześciu do ośmiu godzin później sprawdź mysz, aby upewnić się, że nie odczuwa bólu. Uważnie obserwuj, czy postawa, chód, interakcja z kongenem i wygląd futra są podobne do normalnej, zdrowej myszy.
Na koniec oddziel węzeł chłonny, dociskając go do matowych szkiełek na szalce Petriego, a następnie przenieś go do probówki, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Po wybarwieniu komórek pod kątem interesujących antygenów powierzchniowych komórek, przeanalizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej. Tutaj, próbka z przodu i z boku, pokazane są wykresy rozrzutu dla węzłów chłonnych pobranych od zwierząt znieczulonych lub uśmierconych.
Profile i procenty komórek w żywych bramach limfocytów dwóch wykresów rozrzutu są takie same. Wykazanie, że chirurgia węzłów chłonnych jest odpowiednią techniką pobierania komórek Po opanowaniu operacji węzłów chłonnych można ją wykonać w ciągu pięciu do 10 minut na mysz, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje technikę chirurgiczną sekwencyjnego usuwania węzłów chłonnych od myszy poddanej znieczuleniu w celu śledzenia odpowiedzi immunologicznej w czasie. Procedura obejmuje lokalizacje węzłów chłonnych, ich pobieranie i zamknięcie nacięcia, a następnie uzyskanie pojedynczej zawiesiny komórkowej do analizy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Techniki chirurgiczne
- Analiza eksperymentalna
Tło
- Rozumienie odpowiedzi immunologicznych jest krytyczne w badaniach.
- Węzły chłonne odgrywają kluczowa rolę w układzie odpornościowym.
- Sekwencyjne usuwanie umożliwia analizę czasową odpowiedzi immunologicznych.
- Techniki wizualne poprawiają naukę i opanowanie procedury.
Cel badania
- Aby pokazać chirurgiczne usuwanie węzłów chłonnych u myszy.
- Aby ułatwić badanie postępu odpowiedzi immunologicznej.
- Aby zapewnić wizualny przewodnik dla badaczy.
Zastosowane metody
- Lokalizacja węzłów chłonnych u znieczulonej myszy.
- Chirurgiczne usuwanie węzłów chłonnych.
- Zamknięcie nacięcia po zabiegu.
- Przygotowanie pojedynczej zawiesiny komórkowej do analizy.
Główne wyniki
- Udało się skutecznie usunąć węzły chłonne.
- Uzyskano żywe populacje limfocytów.
- Cytometria przepływowa została wykorzystana do oceny limfocytów.
- Wizualne demonstracje poprawiły zrozumienie techniki.
Wnioski
- Technika pozwala na skuteczne śledzenie odpowiedzi immunologicznych.
- Pomoce wizualne są niezbędne do opanowania procedur chirurgicznych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie dla głębszych wglądów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Sequential lymph node surgery enables longitudinal tracking of immune responses within the same animal, reducing experimental variability and supporting mechanistic de-risking in target validation. This approach provides sufficient viable lymphocytes for phenotypic and functional assays, enhancing predictive confidence in preclinical immunology studies. By facilitating time course experiments, the technique supports translational continuity from discovery through preclinical validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through temporal analysis of lymphocyte expansion in lymph nodes.
- Operational Value: Reduces animal usage and experimental variability by performing repeated sampling in the same mouse.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by characterizing lymph node-residing lymphocyte phenotypes over time.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Yields 1-2x10⁶ cells per lymph node, sufficient for phenotypic characterization and functional assays.
- Operational Value: Provides standardized, reproducible cell suspensions for downstream flow cytometry analysis.
- Scientific Value: Enables preparation of validated biological systems for reliable compound evaluation in immunology screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by tracking immune cell dynamics in lymph nodes over time.
- Operational Value: Facilitates translational biomarker alignment through longitudinal immune monitoring.
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in preclinical models by enabling mechanistic de-risking of immune-mediated pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through preclinical validation, supporting immune response tracking and lymphocyte functional analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via temporal immune response profiling.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible single-cell suspensions from harvested lymph nodes.
- Analytics: Generates quantitative lymphocyte populations for flow cytometry-based comparison across time points.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical validation through continuous immune monitoring in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable surgical capability for longitudinal immunology studies across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through longitudinal immune response tracking.
- Operational Value: Standardization and reproducibility in lymphocyte harvesting and processing.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions via reduced mechanistic ambiguity in immunology programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on temporal immune response data from sequential sampling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgical techniques and anesthesia protocols.
- Necessitates sterile instrumentation and isotonic solutions for tissue preservation.
- Demands cross-team standardization for consistent lymph node localization and harvesting.
- Involves adaptation considerations for different lymph node sites (brachial, inguinal) and mouse strains.
- Limited by postoperative recovery intervals, allowing sampling every second day per node.
