Transfer genów do rozwijającego się ucha wewnętrznego myszy za pomocą elektroporacji in vivo

Ucho wewnętrzne myszy to narząd zmysłu wywodzący się z placode, którego program rozwojowy jest rozwijany podczas ciąży. Definiujemy technikę transferu genów in utero składającą się z trzech etapów: laparotomii brzusznej myszy, mikroiniekcji przezmacicznej i elektroporacji in vivo. Używamy cyfrowej mikroskopii wideo, aby zademonstrować kluczowe eksperymentalne techniki embriologiczne.

Jane przeniosła się do rozwijającego się ucha wewnętrznego myszy za pomocą in vivo, elektroporacji Ling Wang, Han Jang i Johna Burgandy'ego, Oregon Hearing Research Center, Oregon Health and Science University. Nazywam się John Burgandy. Moje laboratorium znajduje się w Oregon Hearing Research Center na Oregon Health and Science University.

Nazywam się Ang. Jestem plakatem w laboratorium Johnsa. Nazywam się Ang również pracuję w laboratorium Johnsa jako asystent naukowy.

Nasza prezentacja podzielona jest na cztery części. Pierwszą z nich jest laparotomia brzuszna. Pokazujemy długopis sodowy, znieczulenie na bazie barbitalu, sposób testowania adekwatności znieczulenia, ochronę rogówki, przygotowanie pola operacyjnego, arkusz danych chirurgii przeżycia myszy dezynfekcji, nacięcie brzusznej linii środkowej przez skórę i ścianę brzucha w sali operacyjnej oraz eksternalizację rogów macicy.

Część druga to mikroiniekcja przezmaciczna. Pokazujemy trans illumination zarodka, zarodka, reorientację, mikroiniekcję, pipetę, wytwarzanie i mikrowstrzyknięcie do Otis w 11,5 dniu embrionalnym i 12,5 dniu embrionalnym. Część trzecia to elektroporacja in vivo.

Demonstrujemy umieszczenie elektrody w stylu łopatkowym i elektroporację embrionalnej diety O w dniu embrionalnym 11,5. Część czwarta to reprezentatywne wyniki. Pokazujemy ekspresję GFP w ślimakach późnoembrionalnych i wczesnopourodzeniowych.

Wynikało to z elektroporacji in vivo Otis z plazmidem ekspresyjnym w 11,5 dniu embrionalnym część pierwszej laparotomii brzusznej. Zapora jest bezpiecznie trzymana poprzez chwytanie skóry za szyją, ogonem i lewą tylną kończyną. Dootrzewnowe wstrzyknięcie środka znieczulającego na bazie pentobarbitalu sodu podaje się po pobraniu wymazu z jamy brzusznej z 70% etanolem.

Mysz umieszcza się w klatce domowej na cztery do pięciu minut, aby umożliwić działanie środka znieczulającego. Szczypanie stopy i ogona służy do oceny adekwatności znieczulenia. Ta zapora zamyka się w odpowiedzi na uszczypnięcie ogona i potrzebuje jeszcze dwóch minut, zanim przestanie reagować na szkodliwe bodźce.

Sterylną maść okulistyczną nakłada się na oczy w celu ochrony rogówki przed wysuszeniem. Przygotowujemy pole operacyjne w dygestoriach chemicznych, aby zminimalizować rozprzestrzenianie się sierści i sierści. Futro jest golone cienkim ostrzem, aby odsłonić skórę pokrywającą ścianę brzucha.

Całkowite usunięcie sierści ułatwia gojenie się nacięcia po operacji. Dezynfekcja skóry brzucha odbywa się poprzez naprzemienne podawanie 70% etanolu Betadiny i 70% etanolu. Zawsze przesuwaj palcem od rostralu do rozpieszczania i używaj świeżego wacika chirurgicznego lub aplikatora z bawełnianą końcówką.

Dla każdego przejścia oceniamy głębokość i jakość oddychania podczas dezynfekcji, aby upewnić się, że zapora nie reaguje Po, Po drugim przejściu 70% etanolu, natychmiast położyliśmy cholerną powierzchnię brzuszną na sterylnej zasłonie i położyliśmy ją na podgrzewanej podkładce na dwie do trzech minut, aby ją ogrzać. Jest to dogodny czas na zapisanie danych przedoperacyjnych w arkuszu dziennika operacji przeżycia myszy. Załączamy nasz arkusz danych chirurgii przetrwania myszy jako informacje uzupełniające.

Rozważ dołączenie arkusza danych i protokołu opieki nad zwierzętami, aby instytucjonalna komisja ds. opieki nad zwierzętami i ich użytkowania mogła zobaczyć, w jaki sposób będziesz monitorować dane przedoperacyjne, operacyjne i pooperacyjne. Wypełniamy jeden arkusz dziennika dla każdego tematu chirurgicznego. Preferujemy przeprowadzanie operacji w sterylnym środowisku, chociaż zazwyczaj nie jest to wymagane w przypadku gryzoni.

Powierzchnia robocza jest oddzielona od silnika dmuchawy i obudowy komory, dzięki czemu wibracje nie są przenoszone na użytkownika. Podczas mikroiniekcji dołączyliśmy jako informacje uzupełniające schemat modyfikacji, które wprowadziliśmy do naszego okapu z przepływem laminarnym, aby ułatwić transfer genów in utero, istotnymi zmianami są wycięcia w oświetleniu o niskiej wartości wody i toru oraz ukryte gniazda na przewody zasilające instrumenty oraz ścieżka prowadzenia dla dodatkowych obwodów elektrycznych. Blok operacyjny składa się z elektrycznego worka dożylnego z dzwonkami laktowanymi, ciepłej kąpieli, manipulatora XY, Z, fluorescencji stereo, mikroskopu preparacyjnego, światłowodowego źródła światła i narzędzi chirurgicznych.

Pedały nożne służą do wyzwalania mikrowtryskiwacza, elektro perter wchodzi w ostrość. Narzędzia chirurgiczne lunety są sterylizowane w autoklawie. Narzędzia muszą być ponownie wysterylizowane między myszami za pomocą sterylizatora z kulkami szklanymi lub przez ponowne autoklawowanie wkrętaka igły.

Nożyczki Balli, kleszcze pierścieniowe i kleszcze naczyniowe to niezbędne narzędzia. Nacięcie brzusznej linii środkowej, chwyć skórę kleszczami naczyniowymi i wytnij powłokę nożyczkami z końcówką kulkową, przedłuż nacięcie o 10 do 14 milimetrów. Zidentyfikuj biały pasmo jałowości połączonej tkanki zwane linea alba i brzuszną linię środkową brzucha, naciąć liniową albę nożyczkami z końcówką kulkową.

Uważając, aby nie naciąć jelit ani pachwinowych poduszek tłuszczowych. Natychmiast przepłukać jamę brzuszną sterylnym wstępnie ciepłym roztworem dzwonka z mleczanami. Oceń miejsca nacięć w skórze i ścianie brzucha pod kątem krwawienia.

Bezpośredni nacisk kleszczami zatrzyma niewielkie krwawienie, jeśli jest obecne, uzewnętrznij prawy i lewy róg macicy za pomocą kleszczy z pierścieniem. Delikatnie chwyć prawy róg macicy jednym obrączkowanym końcem kleszcza i przyciągnij macicę w kierunku nacięcia linii środkowej. Wolną ręką delikatnie manipuluj boczną stroną zapory, aby ułatwić zaczepienie macicy.

Kleszcze nigdy nie są używane do ściskania macicy i wyciągania jej. Ponieważ może to uszkodzić unaczynienie macicy lub zarodki, powtórz procedurę eksternalizacji dla lewego rogu macicy. Natychmiast przepłukać nowo uzewnętrznione rogi macicy wstępnie ciepłym roztworem dzwonka z mleczanem, delikatnie ponownie włóż poduszeczki tłuszczowe lub jelita, jeśli uzewnętrzniają się z macicą.

Nie spotyka się tego często. Część druga: mikroiniekcja macicy. Zapora jest umieszczona pod obiektywem o dużej odległości roboczej, a miękkie światło światłowodowe z jest umieszczone przy ścianie macicy.

Macicę delikatnie naciska się palcem wolnej ręki. Aby ułatwić identyfikację orientacji zarodka. Światło z światłowodowego powinno mieć najmniejsze natężenie wymagane do dokładnej oceny orientacji zarodka.

Intensywne światło może przenosić ciepło do macicy, co może powodować komplikacje. Trzymamy światło światłowodowe i macicę w jednej ręce i używamy palca wolnej ręki, aby zmienić położenie zarodka za pomocą delikatnego badania palpacyjnego. Pokazujemy w poniższych trzech filmach za pomocą mikroskopii, klipów EC i typowych orientacji zarodków obserwowanych przez macicę.

Widz zobaczy mikroskopowy widok, który widzimy podczas trans illuminacji, choć w czerni i bieli trans illumination macicy pozwala na wykrycie orientacji zarodka in vivo. W tym przykładzie zarodek znajduje się w pozycji stania na głowie, a jego brzuszna powierzchnia jest skierowana w stronę widza. Przełączając macicę w przód iw tył, możemy wykryć prawą i lewą tylną kończynę, ogon i głowoc lewego oka.

W tym przykładzie zarodek jest ponownie w pozycji stania na głowie, ale obrócony o około 90 stopni w stosunku do przedniej tylnej osi. Delikatnie przełączając macicę w przód iw tył, możemy zobaczyć kształty łopatek, które definiują lewą tylną kończynę i lewą kończynę. Tylny mózg jest również widoczny.

Zarodek znajduje się w pozycji pionowej, lewą stroną skierowaną w stronę widza. Powstająca czwarta komora jest wykrywalna jako jasna plama w tylnej części mózgu. Widoczne jest również cefalon lewego oka, lewa czterokończynowa i lewe kończyny tylne.

Delikatny nacisk na macicę nieznacznie zmienia orientację zarodków, aby umożliwić wykrycie głównego pnia pierwotnej żyły głowy oraz jej przednich i tylnych gałęzi, które są oznaczone odpowiednio białą i czarną gwiazdką. Jak zobaczymy, Otis znajduje się w połowie drogi między przednią i tylną gałęzią pierwotnej żyły głowowej. Sam Otis nie może być widziany przez macicę przez transiluminację.

W dwóch kolejnych filmach z mikroskopii wideo pokazujemy, jak zmienić orientację zarodka w celu mikroiniekcji do aparatu Otis. Celem jest zidentyfikowanie embrionalnych punktów orientacyjnych, które umożliwiają interpolację lokalizacji otis w bocznej głowie. Naszym celem jest reorientacja zarodka z pozycji grzbietowej na boczną, abyśmy mogli zidentyfikować pierwotną żyłę głowową.

Czwarta komora śródmózgowia i lewa na kończynę są widoczne w pozycji grzbietowej. Delikatny nacisk na macicę zmienia orientację zarodka z grzbietowej na późniejszą. Cefalon lewego oka, śródmózgowie i czwarta komora są łatwo widoczne.

Oczywista jest również pierwotna żyła głowy i jej tylna gałąź oznaczona gwiazdką. Przednia gałąź pierwotnej żyły głowowej nie jest wyraźnie wykrywana. Naszym celem jest również zorientowanie zarodka w taki sposób, aby mógł zidentyfikować pierwotną żyłę głowową, ale w większym powiększeniu, odpowiednim do mikroiniekcji macicy.

Naczynia macicy, pasmo dziesiętne i lewe oko są widziane w tej perspektywie bocznej. Delikatny ucisk na macicę zmienia pozycję zarodka, dzięki czemu możemy wykryć czwarte oko lewego oka. Pierwotna żyła głowy i jej tylna gałąź oznaczona gwiazdką, pierwotna żyła głowy i jej gałęzie tworzą kształt słupków do futbolu amerykańskiego.

Pęcherzyk uszny nie jest widoczny przez macicę, ale znajduje się pośrodku słupków. Lynn zainicjowała sekwencję wstrzyknięć dla jednego zarodka. Ona trans oświetla macicę, zmienia orientację zarodka do mikroiniekcji i przynosi na pole pipetę do mikroiniekcji wypełnioną szybkim zielonym kolorem.

Pipeta do mikroiniekcji jest przymocowana do uchwytu na pipetę, który jest trzymany przez manipulator X, Y, z mikrom. Podstawka magnetyczna manipulatora jest przymocowana do stalowej płyty z teflonową podstawą, która umożliwia bezproblemowe ustawienie pipety do mikroiniekcji. Igła jest wysuwana za pomocą pokrętła mikrometru na manipulatorze do przodu.

Spreparowane pipety są niezbędne do traumatycznego mikrowstrzyknięcia do zarodka myszy we wczesnym stadium Otis. Wyciągamy grubościenne rurki kapilarne ze szkła borosilowego za pomocą poziomego ściągacza do pipet. Otrzymana pipeta pokazana w A jest łamana ręcznie za pomocą kleszczy w pozycji o średnicy zewnętrznej od 14 do 16 mikronów wskazanej przez grot strzałki w punkcie B. Szorstkie pęknięcie pipety pokazane w C jest postrzępione i kruche.

Ukosujemy pipetę pod kątem około 20 stopni, aby naostrzyć końcówkę pipety, jak pokazano w Panelu D, parametry dotyczące wyciągania i ukosowania pipet mikroiniekcyjnych są podane w załączonym tekście. W następnych dwóch filmach z mikroskopii wideo pokazujemy mikroiniekcję do asysty mysi w 11,5 i 12,5 dniu embrionalnym. Naszym celem jest zademonstrowanie mikroiniekcji macicy do dnia embrionalnego, 11,5 mysiego otics.

Po pierwsze, wstrzykujemy otics bez obecności macicy, aby jednoznacznie pokazać, jak wygląda prawidłowo ukierunkowane wstrzyknięcie. Następnie demonstrujemy autentyczne mikroiniekcję przezmaciczną. W przypadku tego pierwszego wstrzyknięcia macica została nacięta fałszywie, aby umożliwić woreczkowi trzewnemu wyciśnięcie pasma dziesiętnego pokrywającego woreczek żółtkowy trzewny.

Łożysko pozostaje przyczepione do macicy, a zarodek jest żywy. Po ogniskowym usunięciu macicy widzimy czwartą komorę, pierwotną żyłę głowy oraz jej przednie i tylne gałęzie, pipetę i przybliżoną lokalizację torbieli na biało. Na początku tej sekwencji wstrzyknięcia wykrywa się przepływ krwi w unaczynieniu woreczka żółtkowego trzewnego.

Pipetę przesuwa się przez woreczek żółtkowy trzewny, a dai wstrzykuje się do nuty osis, przewodu limfatycznego endo grzbietowo i położenia otics w środku słupków. Otics znajduje się w połowie drogi między przednimi i tylnymi gałęziami pierwotnej żyły głowowej, mikroiniekcja macicy do dnia embrionalnego. 11.5 Otics myszy wymaga wykrycia żyły pierwotnej głowy i co najmniej jednej z jej gałęzi w celu oszacowania lokalizacji asysty otycznej.

Nasz cel w tym schematycznym przykładzie, zarówno przednie, jak i tylne gałęzie pierwotnej żyły głowy są wykrywane z terytorium OUC zaznaczonym na biało. Bardziej realistyczna prezentacja zarodka to taka, w której główny pień pierwotnej żyły głowowej jest wykrywany wraz tylko z jedną z jej gałęzi, a w pokazanym przykładzie widoczna jest tylko tylna gałąź pierwotnej żyły głowowej, ale to wystarczy, aby zinterpretować lokalizację otics. PT jest wprowadzany przez macicę, a barwnik jest wstrzykiwany do otics.

Czekamy 30 sekund, aby barwnik usunął się z jamy owodniowej, w którym to momencie możemy zobaczyć przewód limfatyczny endo grzbietowo i przedsionek. Kończymy widokiem zarodka w małym powiększeniu, którego torbiel właśnie wstrzyknęliśmy, aby zapewnić perspektywę anatomiczną w tym widoku, widoczna jest czwarta komora, lewe oko i unaczynienie macicy. Pokazujemy trans i mikroiniekcje do torbieli myszy w 12 dniu embrionalnym oraz mikroiniekcję do powstającej czwartej komory tylnego mózgu.

Transiluminacja pozwala nam wykryć pierwotną żyłę głowy w tym lewym widoku bocznym, a także oko. Pipeta jest przesuwana przez macicę do pęcherzyka usznego i umiera wstrzyknięta w celu wypełnienia jego światła. Aby wstrzyknąć czwartą komorę, obracamy zarodek o 90 stopni, aby uzyskać widok grzbietowy tylnego mózgu.

Wstrzyknięta lewa torbiel znajduje się teraz po lewej stronie. Pipeta jest przesuwana przez macicę i szybko zielona miesza się z lor. Sprzężony dekstran wstrzykuje się do czwartej komory.

Należy pamiętać, że objętość wstrzykniętego barwnika nie dostaje się do śródmózgowia in vivo. Fluorescencję ocenia się po wstrzyknięciu w celu walidacji lokalizacji dekstranu w czwartej komorze. Zarodek jest następnie przekierowywany z pozycji grzbietowej na boczną.

Przewód limfatyczny endo jest tylko brzuszny do czwartej komory w tym widoku bocznym. Fluorescencja in vivo potwierdza lokalizację dekstranu w czwartej komorze. Po urodzeniu badamy młode pod kątem zielonej fluorescencji w czwartej komorze za pomocą epifluorescencji.

Młode z zieloną fluorescencją w tylnych mózgach mają ucho wewnętrzne, które zostało zmanipulowane podczas embriogenezy część trzecią elektroporacji in vivo. Po wypełnieniu torbieli plazmidem ekspresyjnym, macica jest świeżo nawadniana wstępnie ciepłym roztworem dzwonka z mleczanami. Transillumination ułatwia wyśrodkowanie torbieli ODU w polu elektrody.

Metalowa głowica światłowodu jest cofnięta z powierzchni macicy. Przed zainicjowaniem ciągu impulsów fali prostokątnej demonstrujemy w następnym klipie z mikroskopii wideo pełny cykl elektroporacji in vivo. Elektroporacja dnia embrionalnego, torbiel mysia 11,5 myszy wymaga delikatnego umieszczenia elektrod w stylu łopatkowym na macicy.

W tym przykładzie torbiel lewej błony usznej została wypełniona plazmidem ekspresyjnym, a macica została świeżo przepłukana obrączkami z mleczanami. Katoda jest ustawiona bocznie w stosunku do wypełnionej torbieli usznej, a oda jest umieszczona przyśrodkowo na początku sekwencji acji, torbiel uszna jest wyśrodkowana w polu łopatkowym. Macica jest delikatnie ściskana, a ciąg impulsów fali prostokątnej jest inicjowany za pomocą przełącznika nożnego.

Idealnie na impuls dostarczany jest prąd o natężeniu od 60 do stu miliamperów. Macica jest następnie uwalniana i natychmiast nawadniana. Świeżo przepłukana macica jest zawracana do jamy brzusznej poprzez delikatny ucisk kleszczykami pierścieniowymi.

Gdy macica zostanie zinternalizowana, jama brzuszna jest przepłukiwana około czterema mililitrami obrączek z mleczanem, pozostawiając około jednego miliona obrączek z mleczanem w jamie brzusznej, aby pomóc w utrzymaniu nawodnienia matki, która będzie pić mniej wody niż zwykle bezpośrednio po operacji jamy brzusznej. Ścianę brzucha, a następnie skórę zamyka się szwem resorbowalnym za pomocą wkrętaka igłowego. Nasz sterownik igłowy ma wbudowane nożyce, które upraszczają zamykanie.

Preferujemy ścieg biegowy zarówno na ścianę brzucha, jak i na skórę. Blokujemy co drugi ścieg, aby zapewnić dodatkowe wsparcie w miejscu nacięcia. Podajemy podskórnie niesteroidowy lek przeciwzapalny przed umieszczeniem matki w klatce rekonwalescencji.

Skonsultuj się z personelem weterynaryjnym, aby dowiedzieć się, które profilaktyczne leki przeciwbólowe są preferowane przez instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania. Zapora jest umieszczona w sterylnej zasłonie i umieszczona na podłodze podgrzewanej klatki rekonwalescencyjnej. Klatka rekonwalescencyjna zawiera materiał do gniazdowania, czerwoną rurkę do przykrycia, karmę laboratoryjną i butelkę z wodą.

Klatka jest ponownie montowana z maską filtra na górze rano po zabiegu. Matka jest pięknie zadbana, porusza się i jest w stanie balansować na tylnych kończynach, aby zapytać o otwartą górę klatki. Linia szwów w jamie brzusznej jest czysta, sucha i nie wykazuje śladów oddzielania, zaczerwienienia ani obrzęku.

Dołączyliśmy dokument, który omawia opracowanie protokołu opieki nad zwierzętami w celu transferu genów in utero. Dokument zawiera sformułowania, które mogą być przydatne podczas projektowania protokołu specyficznego dla danej instytucji w porozumieniu z komisją ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania. Część czwarta, reprezentatywne wyniki.

Reprezentatywne panele wyników A i B pokazują reprezentatywny ślimak od młodego szczeniaka po urodzeniu w szóstym dniu, któremu Otis wstrzyknięto wzmocniony plazmid o ekspresji białka zielonej fluorescencji w 11,5 dniu embrionalnym, a następnie elektro. Boczna ściana ślimaka została usunięta ze środka i wierzchołka. Tylko ekspresja GFP jest obecna od podstawy do połowy długości ślimaka i podąża za dystrybucją markera komórek rzęsatych miozyny siedem A pokazanego w panelu B. Panel C pokazuje projekcję konfokalną dnia embrionalnego w małym powiększeniu.

18,5 mysi narząd immunologiczny corde barwiony miozyną, siedem transfekowanych komórek przeciwciała A jest rozmieszczonych w całym narządzie corde. Panel D przedstawia konfokalną projekcję dnia embrionalnego w dużym powiększeniu. 18.5 Organ myszy Kordy barwiony cin. Siedem.

Ekspresję GFP wykrywa się w wewnętrznych i zewnętrznych komórkach rzęsatych, komórkach międzypaliczkowych, komórkach filarowych i komórkach TER. Transfer genów za pośrednictwem elektroporacji do Otis w 11,5 dniu embrionalnym Transfekcyjne komórki progenitorowe, które dają początek wszystkim typom komórek składowych w narządzie rdzenia.