Name: Ocena ekspresji i żywotności GFP za pomocą cytometru obrazowego Tali (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Naucz się oceniać żywotność i ekspresję GFP w komórkach za pomocą cytometru obrazowego Tali. Ta metoda dostarcza jednocześnie danych ilościowych i wizualnych o populacjach komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Barwienie komórek za pomocą zestawu Tali Viability Kit - odczynnik Dead Cell Red
<ol>
 <li>Procedurę rozpoczynamy od użycia komórek U2OS (American Type Culture Collection), które zostały transdukowane za pomocą CellLight Nucleus-GFP *BacMam 2.0*. (Uwaga: Komórki można również odwirować i zawiesić ponownie w medium lub PBS).</li>
 <li>Aby zabarwić martwe komórki jidkiem PI, przenieś 100 μL zawiesiny komórek do nowej probówki do mikrocentryfugi. Należy pamiętać, że dla tego testu zalecane jest stężenie od 1 x 105 do 1 x 107 cells/mL, choć stężenie nie musi być dokładne.</li>
 <li>Następnie, w celu zabarwienia martwych komórek, dodaj 1 μL odczynnika Tali Dead Cell Red opartego na PI. Krótko wymieszaj na wortexie. Inkubuj mieszaninę odczynnika Tali Dead Cell Red i komórek w temperaturze pokojowej, w ciemności, przez 1-5 minut.</li>
 <li>Po inkubacji niezwłocznie przystąp do analizy próbki na cytometrze obrazowym Tali Image-Based Cytometer.</li>
</ol>
2. Wykonywanie testu żywotności komórek przy użyciu cytometru obrazowego Tali
<ol>
 <li>Cytometr Tali wykorzystuje jednorazowe plastikowe płytki do analizy komórkowej Tali Cellular Analysis Slides, które są specjalnie dopasowane do cytometru i mogą pomieścić dwie próbki o objętości 25 μL w oddzielnych, zamkniętych komorach (A i B). Podczas manipulowania płytką należy ją zawsze trzymać za krawędzie.</li>
 <li>Aby załadować płytkę, należy powoli nalać pipetą 25 μL próbki do półksiężycowatego obszaru ładowania, dbając o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza ani odpryski. Nie należy przepełniać ani niedopełniać komory.</li>
 <li>W tym przypadku w komorze A ładuje się komórki kontrolne (niebarwione, nietransdukowane), a w komorze B komórki barwione wykazujące ekspresję GFP. Próbka kontrolna pomoże określić poziom autofluorescencji podczas analizy danych.</li>
 <li>Aby przeprowadzić test żywotności, należy dotknąć opcji GFP/RFP na ekranie głównym cytometru. Po prawej stronie pojawią się opcje testu. Należy wybrać GFP + Viability.</li>
 <li>Następnie, aby nazwać serię próbek, należy nacisnąć Name Now. Następnie, korzystając z ekranu dotykowego, wpisać nazwę serii próbek i nacisnąć Save. (Uwaga: Wybierz Select Name Later, aby automatycznie przypisać nazwę dla każdej serii próbek na podstawie daty i godziny).</li>
 <li>Po nazwaniu próbki cytometr Tali automatycznie przejdzie do ekranu Measure. Należy nacisnąć kartę Background w dolnej prawej części ekranu Measure.</li>
 <li>Następnie, trzymając próbkę kontrolną (A) od strony przeciwnej do cytometru, należy wsunąć płytkę do portu ładowania, aż zostanie zatrzymana. Nie należy używać siły.</li>
 <li>Na ekranie tła należy dotknąć Press to Insert New Unstained Cell Control. Płytka zostanie automatycznie wciągnięta do cytometru, a na ekranie wyświetli się obraz komórek w czasie rzeczywistym.</li>
 <li>Za pomocą pokrętła ostrości należy ustawić komórki w odpowiedniej płaszczyźnie widzenia. Komórki powinny być jednolicie ciemne z jasną aureolą wokół każdej z nich (Rysunek 1, lewo).</li>
 <li>Komórki mogą zostać niedoszacowane, gdy przejście między tłem a krawędziami komórek jest rozmyte, przez co granice komórek nie są dobrze zdefiniowane (Rysunek 1, środek). Komórki mogą zostać przeszacowane, gdy mają jasne centra i ciemne obwody (Rysunek 1, prawo).</li>
 <li>Aby lepiej widzieć populację komórek podczas ustawiania ostrości, należy przesunąć czerwony przycisk wskaźnika Zoom na 4X lub 16X.</li>
 <li>Po ustawieniu ostrości komórek należy dotknąć Press to Run Unstained Cell Control, aby zmierzyć fluorescencję tła.</li>
 <li>Cytometr automatycznie zarejestruje i przeanalizuje obrazy próbki. Przechwycenie i analiza obrazów w domyślnym trybie (9 obrazów) trwa około 1 minuty.</li>
 <li>Miniatury każdego pola widzenia są wyświetlane w miarę ich rejestrowania, a pasek postępu zapewnia aktualizację w czasie rzeczywistym. Po zakończeniu rejestracji obrazów cytometr automatycznie wysuwa płytkę i przedstawia dane z analizy zarejestrowanych obrazów.</li>
 <li>Zapisane dane zostaną wyświetlone w menu rozwijanym karty Background w cytometrze. Próbce kontrolnej tła zostanie przypisana ta sama nazwa, co eksperymentowi, i zostanie ona zaimportowana do menu rozwijanego. Uwaga: Jeśli kontrola tła nie zostanie przeprowadzona, cytometr automatycznie przypisze próg fluorescencji. Można go zmienić ręcznie po przeprowadzeniu testu.</li>
 <li>Aby zbadać transdukowaną próbkę barwioną PI, należy wyjąć płytkę z cytometru, obrócić ją i ponownie włożyć z transdukowaną próbką skierowaną od strony przeciwnej do instrumentu.</li>
 <li>Należy nacisnąć kartę Sample, a następnie dotknąć Press to Insert New Sample. Gdy obraz pojawi się na ekranie, należy użyć pokrętła regulacji obrazu, aby ustawić ostrość komórek jak wcześniej. Następnie należy dotknąć Press to Run Sample.</li>
 <li>Po zakończeniu rejestracji obrazów dane z analizy pojawią się w karcie Sample, a cytometr automatycznie wysunie płytkę.</li>
 <li>Używaną płytkę Tali Cellular Analysis Slide należy zutylizować jako odpad biologiczny. Płytek Tali Cellular Analysis Slides nie można używać ponownie.</li>
</ol>
3. Ustawianie progów i bramek
<ol>
 <li>Po analizie próbki można zastosować progi, aby wyodrębnić konkretną populację komórek. W tym przypadku dostosujemy progi, aby określić procent żywych i martwych komórek wśród komórek transdukowanych GFP.</li>
 <li>W zakładce Sample wyświetlane są: liczba i procent komórek wykazujących ekspresję GFP, żywe i martwe komórki wykazujące ekspresję GFP, całkowita żywotność, średnia wielkość komórek, liczba policzonych komórek oraz stężenie komórek.</li>
 <li>Dodatkowo w dolnej części ekranu wyświetlane są histogramy przedstawiające wielkość komórek, fluorescencję zieloną oraz fluorescencję czerwoną (PI).</li>
 <li>Aby ustawić bramkę wielkości komórek, dotknij miniatury Cell Size, aby otworzyć histogram wielkości komórek. O ile w hodowlach komórkowych rzadko występują zanieczyszczenia, o tyle inne próbki mogą zawierać debris większy lub mniejszy od komórek.</li>
 <li>Aby wykluczyć te zanieczyszczenia, przesuń niebieskie przyciski na pasku suwaka, aby odrzucić zdarzenia zarówno duże, jak i małe. Następnie dotknij Apply, aby ponownie przeanalizować dane i zaktualizować wyniki.</li>
 <li>Następnie, aby uwzględnić fluorescencję GFP w analizie, dotknij miniatury histogramu GFP, aby go otworzyć. Przesuń niebieski pasek, aby ustawić próg tuż po prawej stronie najniższego piku, korzystając z próbki kontrolnej jako punktu odniesienia.</li>
 <li>Pozwala to na włączenie do analizy komórek GFP-dodatnich przy jednoczesnym wykluczeniu komórek autofluorescencyjnych. Autofluorescencję często obserwuje się podczas wzbudzenia cząsteczek biologicznych wewnątrz komórek.</li>
 <li>Dotknij Apply, aby zatwierdzić zmiany i powrócić do poprzedniego ekranu. Dane wyświetlane w zakładce Sample powinny teraz odzwierciedlać bramki i progi ustawione dla obu kanałów fluorescencji.</li>
 <li>Następnie, aby oddzielić komórki barwione PI od autofluorescencji, naciśnij miniaturę PI histogram, aby otworzyć histogram PI.</li>
 <li>Ponownie, pik próbki kontrolnej zostanie wyświetlony jako szary pik na histogramie. Czerwony pik to fluorescencja próbki. Fluorescencja tła jest wyświetlana jako pik najbliższy wartości 0 RFU w tym cytometrze.</li>
 <li>Aby wyeliminować fluorescencję tła w kanale PI, przesuń niebieski przycisk na pasku suwaka, aby dostosować próg w sposób wykluczający pik reprezentujący fluorescencję tła, używając szarego piku z próbki kontrolnej jako referencji. Dotknij Apply, aby zatwierdzić i powrócić do poprzedniego ekranu.</li>
 <li>Następnie, aby wizualnie potwierdzić prawidłowe przypisanie każdej komórki, wybierz do przeglądu zarejestrowane pole widzenia, naciskając miniaturę obrazu w zakładce Zoom, a następnie naciskając zakładkę Layers.</li>
 <li>Następnie naciśnij przycisk GFP lub PI, aby wyświetlić obraz zarejestrowany w danym kanale. Naciśnij ten sam przycisk ponownie, aby usunąć warstwę z wyświetlania; aby nałożyć warstwy na siebie, dotknij przycisku Multiple Layer.</li>
 <li>Aby sprawdzić, jak komórki są liczone w danym kanale, dotknij Circles. Komórki, które zostały policzone tylko w kanale jasnego pola i nie wykazują fluorescencji, zostaną obwiedzione niebieskimi okręgami. Wskazuje to, że dana komórka jest żywa (tj. PI-ujemna).</li>
 <li>Komórki wykazujące ekspresję GFP będą widoczne w kanale GFP i zostaną obwiedzione zielonymi okręgami. Martwe komórki barwione barwnikiem Dead Cell Red będą widoczne w kanale PI i zostaną obwiedzione czerwonymi okręgami.</li>
 <li>Komórki policzone zarówno w kanale czerwonym, jak i zielonym zostaną obwiedzione żółtymi okręgami; wskazuje to, że komórka wykazuje ekspresję GFP, ale jest również zabarwiona PI, a zatem jest martwa.</li>
 <li>Okazyjnie na ekranie pojawią się czarne okręgi; są to obiekty, które zostały zidentyfikowane, ale wykluczone z analizy na podstawie wielkości komórek.</li>
 <li>Kontynuuj precyzyjne dostrajanie progu na histogramie fluorescencji, korzystając z opisanych kroków, aż każda komórka wykazująca fluorescencję zostanie obwiedziony okręgiem w odpowiednim kolorze.</li>
 <li>Wszystkie parametry analizy są automatycznie zapisywane w zakładce danych. Cytometr Tali może przechowywać pliki danych z około 500 analiz próbek.</li>
 <li>Każdy plik zapisany w zakładce danych jest dostępny do ponownej analizy. Po wybraniu pliku z zakładki Data zostanie on otwarty, a wszystkie histogramy i warstwy staną się aktywne.</li>
 <li>Aby zarchiwizować dane i wygenerować raporty, dane przechowywane w cytometrze można przenieść na komputer za pomocą dysku USB.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
Cytometr obrazowy Tali został wykorzystany do pomiaru poziomu ekspresji białka fluorescencyjnego w komórkach transdukowanych konstruktem ekspresyjnym GFP BacMam 2.0 nakierowanym na jądro komórkowe. Przetransdukowano cztery reprezentatywne typy komórek (U2OS, 293MSR, HEKn oraz CHO-S). Dla tych linii komórkowych cytometr Tali określił liczbę komórek wykazujących ekspresję GFP, a wyniki te porównano z danymi z tych samych próbek analizowanych za pomocą cytometru przepływowego. Dodatkowo komórki barwiono odczynnikiem Dead Cell Red z zestawu Tali Viability Kit w celu zidentyfikowania populacji martwych komórek zarówno na cytometrze Tali, jak i na cytometrze przepływowym.
Reprezentacje graficzne na Rysunku 2 przedstawiają procent całkowitej populacji każdego typu komórek, które wykazują ekspresję GFP. Dane te dowodzą, że cytometr Tali generuje wyniki porównywalne z danymi uzyskanymi za pomocą cytometru przepływowego.
<img alt="Schemat porównania ostrości podczas liczenia komórek, przedstawiający prawidłową i nieprawidłową ostrość dla dokładnej analizy." src="/files/ftp_upload/3659/3659fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przed analizą należy prawidłowo ustawić ostrość obrazu komórek. Slajdy Tali Cellular Analysis z stężeniami komórek odpowiednimi do analizy (zaleca się od 1 x 105 do 1 x 107 komórek). (LEWO) Komórki w ostrości są jednorodnie ciemne w całej swojej objętości, z jasną aureolą wokół każdej komórki. (ŚRODEK) Liczba komórek może zostać niedoszacowana, gdy przejście między tłem a krawędziami komórek jest rozmyte, a komórki mają nieokreślone granice. (PRAWO) Liczba komórek może zostać przeszacowana, gdy mają one jasne centra i ciemne obwody.
<img alt="Analiza żywotności komórek; wykres słupkowy ekspresji GFP; porównanie cytometrii obrazowej z cytometrią przepływową." src="/files/ftp_upload/3659/3659fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Dane dotyczące ekspresji białka fluorescencyjnego uzyskane za pomocą cytometru obrazowego Tali są porównywalne z danymi uzyskanymi metodą cytometrii przepływowej. Porównanie obok siebie obliczonych wyników ekspresji GFP w 4 różnych liniach komórkowych w komórkach żywych.

<ol><li>Godfrey, W. L., Hill, D. M., Kilgore, J. A., Buller, G. M., Bradford, J. A., Gray, D. R., Ignatius, M. J., Janes, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementarity+of+Flow+Cytometry+and+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Complementarity of Flow Cytometry and Fluorescence Microscopy.</a> Microsc. Microanal. 11, 246-247 (2005).</li>
<li>Mittag, A., Pinto, F. E., Endringer, D. C., Tarnok, A., Lenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+analysis+by+open-source+software+for+affordable+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Cellular analysis by open-source software for affordable cytometry.</a> Scanning. 33, 33-40 (2011).</li>
<li>Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+green+fluorescent+protein+and+its+mutants+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).</li>
<li>Smyth, P. G., Berman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+apoptosis%3A+methods+for+elucidating+the+mechanism+of+apoptotic+cell+death+from+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system.</a> Biotechniques. 32, 648-654 (2002).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Koopman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+V+for+flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+B+cells+undergoing+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis.</a> Blood. 84, 1415-1420 (1994).</li>
<li>Tanke, H. J., van der Linden, P. W., Langerak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+fluorochromes+to+ethidium+bromide+for+automated+read+out+of+cytotoxicity+tests%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Alternative fluorochromes to ethidium bromide for automated read out of cytotoxicity tests.</a> J. Immunol. Methods. 52, 91-916 (1982).</li>
<li>King, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+dead+cells+and+measurement+of+cell+killing+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 243, 155-166 (2000).</li>
<li>Jones, K. H., Kniss, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propidium+iodide+as+a+nuclear+counterstain+for+immunofluorescence+studies+on+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Propidium iodide as a nuclear counterstain for immunofluorescence studies on cells in culture.</a> J. Histochem. Cytochem. 35, 123-125 (1987).</li>
<li>Dell'Arciprete, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+expression+gene+cloning+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">High-efficiency expression gene cloning by flow cytometry.</a> J. Histochem. Cytochem. 44, 629-640 (1996).</li>
<li>Lamm, G. M., Steinlein, P., Cotten, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+quantitative+and+inexpensive+method+for+detecting+apoptosis+by+flow+cytometry+in+transiently+transfected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid, quantitative and inexpensive method for detecting apoptosis by flow cytometry in transiently transfected cells.</a> Nucleic. Acids. Res. 25, 4855-4857 (1997).</li>
<li>Perfetto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine+reactive+dyes%3A+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).</li>
</ol>

Krissy Remple i Laurel Stone są pracownikami firmy Life Technologies, która wyprodukowała instrument użyty w niniejszym artykule. Firma Life Technologies sfinansowała produkcję tego artykułu wideo.

Właśnie szczegółowo opisaliśmy procedurę wykonywania zliczeń żywotności oraz oceny ekspresji GFP przy użyciu cytometru obrazowego Tali. Zastosowanie tej samej procedury pozwala temu cytometrowi na przeprowadzenie szeregu innych analiz, w tym: oceny apoptozy, ekspresji RFP oraz analizy żywotności komórek w przypadku komórek nietransdukowanych.
Fluorometryczne testy żywotności komórek, ekspresji genów i apoptozy stały się kluczowymi metodologiami w badaniach biomedycznych7-12. W przeszłości do uzyskiwania ilościowych i wizualnych informacji o komórkach stosowano oddzielną aparaturę. Podczas gdy informacje ilościowe dotyczące komórek w populacji heterogenicznej pozyskiwano za pomocą cytometrii przepływowej, informacje wizualne lub jakościowe gromadzono przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej 1-4. W niniejszej pracy przedstawiamy technologię, która niweluje lukę między badaniami populacyjnymi a badaniami pojedynczych komórek. Dzięki zastosowaniu cytometru obrazowego Tali, ilościowe dane oraz wizualne dane o pojedynczych komórkach lub populacjach komórkowych mogą być zbierane jednocześnie. Instrument Tali może być wykorzystywany w szeregu zastosowań, w tym do oceny ekspresji genów, testów apoptozy, badań skuteczności leków oraz oceny progresji choroby.
Cytometr obrazowy Tali rejestruje i analizuje obrazy w jasnym polu, fluorescencji czerwonej i zielonej, co pozwala na uzyskanie informacji o subpopulacjach komórek. Na przykład w tym badaniu, przy użyciu barwnika Dead Cell Red, byliśmy w stanie odróżnić komórki martwe od żywych w populacji komórek wykazujących ekspresję GFP. Zapewnia to dokładność pomiaru żywotnych komórek wykazujących ekspresję GFP i pozwala zidentyfikować populację komórek nadających się do dalszej obróbki. Należy zauważyć, że martwe komórki w populacji mogą pochodzić z różnych źródeł, w tym z naturalnej śmierci komórek w hodowli lub śmierci spowodowanej warunkami środowiskowymi (np. trypsynizacją lub śmiercią wywołaną wybraną metodą transfekcji/transdukcji).
W niniejszym materiale demonstrujemy zastosowanie cytometru Tali z użyciem komórek U2OS. Podobne metody można zastosować w przypadku większości komórek ssaków i owadów. Dla każdej linii komórkowej cytometr Tali dostarczył ilościowych danych dotyczących ekspresji GFP, co nie jest możliwe przy wizualnej ocenie komórek za pomocą standardowego mikroskopu fluorescencyjnego. Choć wyniki te są porównywalne z wynikami cytometrii przepływowej, są one zbierane w znacznie krótszym czasie. Cytometr umożliwia dokładne zliczanie komórek o średnicy od 5 μm do 60 μm, najlepiej przy stężeniu od 1 x 105 do 1 x 107 komórek/mL.
Warto zaznaczyć, że większość standardowych protokołów barwienia, w tym opisany tutaj protokół barwienia Dead Cell Red, wykorzystuje jodek propidyny do rozróżnienia komórek żywych i martwych. Stanowi to wyzwanie przy ocenie żywotności komórek, które zostały permeabilizowane w celu barwienia markerów wewnątrzkomórkowych, ponieważ PI zabarwi każdą komórkę z uszkodzoną błoną. Ponieważ każdy barwnik fluorescencyjny lub białko, które można wykryć w kanałach fluorescencji zielonej lub czerwonej, może zostać przeanalizowany za pomocą cytometru obrazowego Tali, w przyszłych badaniach można rozważyć zastosowanie alternatywnych barwników, takich jak barwniki żywotności reaktywne względem grup aminowych4. Badanie przeprowadzone w 2006 roku przez Perfetto et al.12 wykazało, że barwniki te są łatwe w użyciu i powtarzalne w różnicowaniu populacji komórek żywych i martwych.


Należy zwrócić uwagę, że urządzenie Tali posiada ograniczenia w zakresie rodzajów analiz, jakie może przeprowadzać. Na przykład, ponieważ instrument wykorzystuje obiektyw 4X, operacje zliczania są ograniczone do większych typów komórek: nie można ilościowo określić struktur subkomórkowych, takich jak mitochondria lub pęcherzyki, ani komórek bakteryjnych. Należy również pamiętać, że kanały detekcji w Tali są ograniczone do fluoroforów, które wzbudzają i emitują światło w obrębie tych kanałów. O ile silne sygnały YFP i mCherry mogą zostać wykryte, o tyle słabsze sygnały mCherry nie są wykrywalne. Wreszcie, Tali analizuje wyłącznie komórki w zawiesinie. Nie będzie ono dokładnie zliczać komórek przylegających do szkiełka. Ponadto możliwości zliczania komórek o nieregularnym kształcie, w tym niektórych drożdży i komórek pierwotnych, są ograniczone.

Ponadto przyszłe badania prawdopodobnie będą dotyczyć zastosowania tego systemu w ocenie ekspresji markerów wewnątrzkomórkowych. W przypadku poszczególnych barwników można sprawdzić nakładanie się widm z sąsiednimi kanałami, korzystając z narzędzia SpectraViewer firmy Invitrogen dostępnego online (<a href="http://www.invitrogen.com/spectraviewer">www.invitrogen.com/spectraviewer</a>). Ze względu na nowość tej technologii pełny zakres jej zastosowań nie został jeszcze odkryty.
Podsumowując, zaprezentowany tutaj cytometr obrazowy Tali stanowi nową technologię umożliwiającą jednoczesną wizualizację i analizę populacji komórek, co pozwala na ocenę pojedynczych komórek, jak i całych populacji komórkowych w kompaktowym formacie przy prostym przebiegu pracy.

<table><tbody><tr><td>Cytometr obrazowy Tali Image-Based Cytometer</td><td>Invitrogen</td><td>T10796</td><td></td></tr><tr><td>Slajdy do analizy komórkowej Tali Cellular Analysis Slides, 50 slajdów</td><td>Invitrogen</td><td>T10794</td><td></td></tr><tr><td>Slajdy do analizy komórkowej Tali Cellular Analysis Slides, 500 slajdów</td><td>Invitrogen</td><td>T10795</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oceny żywotności Tali Viability Kit - Dead Cell Red</td><td>Invitrogen</td><td>A10786</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oceny żywotności Tali Viability Kit - Dead Cell Green</td><td>Invitrogen</td><td>A10787</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wykrywania apoptozy Tali Apoptosis Kit</td><td>Invitrogen</td><td>A10788</td><td></td></tr><tr><td>komórki U2OS</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ocena ekspresji gfp i żywotności z wykorzystaniem cytometru obrazowego tali

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Informacje na poziomie pojedynczych komórek oraz całej populacji są zazwyczaj pozyskiwane za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii fluorescencyjnej. Te dwie metody dostarczają jednak odmiennych danych. Cytometria przepływowa zapewnia ilościowe, wieloparametryczne informacje o charakterystyce fizycznej, barwieniu lub ekspresji, lecz nie umożliwia wizualizacji. Z kolei samodzielna mikroskopia fluorescencyjna dostarcza danych wizualnych, ale nie pozwala na bezpośrednie pomiary ilościowe1.
Cytometria obrazowa wypełnia lukę między tymi dwiema metodami, umożliwiając szybką wizualizację oraz jednoczesną analizę ilościową tysięcy komórek w populacjach heterogenicznych2. Przedstawiamy tutaj metodę przeprowadzania analizy żywotności komórek oraz ekspresji zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) przy użyciu cytometru obrazowego Tali3. Urządzenie Tali to 3-kanałowa (pole jasne, fluorescencja zielona, fluorescencja czerwona) platforma analityczna do użytku laboratoryjnego, która oferuje szereg zalet w porównaniu z cytometrią przepływową i mikroskopią fluorescencyjną. Cytometr Tali jest tańszy, zajmuje mniej miejsca na blacie, wymaga mniejszej konserwacji, a uproszczony przepływ pracy sprawia, że obsługa i analiza są znacznie prostsze i szybsze. Cytometr Tali umożliwia przeprowadzanie różnorodnych analiz w zawiesinach komórkowych, w tym analizę ekspresji GFP i czerwonego białka fluorescencyjnego (RFP), apoptozy4-6 oraz żywotności komórek z użyciem jodku propidyny (PI)7-11.
W niniejszym materiale demonstrujemy zastosowanie urządzenia Tali do przeprowadzenia testu żywotności komórek wykazujących ekspresję białka GFP. Komórki przetransdukowane białkiem GFP są barwione przy użyciu zestawu Tali Viability Kit - Dead Cell Red. Następnie komórki są przenoszone pipetą na slajd do analizy komórkowej Tali i umieszczane w cytometrze. Przechwytywane są obrazy w polu jasnym oraz obrazy fluorescencji czerwonej i zielonej, które następnie analizowane są za pomocą algorytmów specyficznych dla danego testu. W kolejnym kroku generowane są histogramy obrazujące wielkość komórek, intensywność fluorescencji PI oraz intensywność fluorescencji GFP. Parametry te mogą być następnie poddane progowaniu w celu wyodrębnienia konkretnej populacji komórek.
Porównanie zestawione obok siebie cytometru obrazowego Tali oraz tradycyjnej cytometrii przepływowej wykazuje, że obie metody dostarczają porównywalnych danych dotyczących żywotności komórek i ekspresji białek. Jednak instrument Tali dostarcza dodatkowych informacji wizualnych na temat populacji komórek, których nie można uzyskać za pomocą cytometru przepływowego.

Niniejszy protokół opisuje sposób wykonywania testów żywotności komórek oraz ekspresji fluorescencji przy użyciu cytometru obrazowego Tali.

Ocena ekspresji GFP i żywotności z wykorzystaniem cytometru obrazowego Tali

Informacje na poziomie pojedynczych komórek oraz populacji pozyskuje się zazwyczaj za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii fluorescencyjnej. Jednak obie te metody dostarczają...

Niniejszy film prezentuje procedurę oznaczania żywotności komórek wykazujących ekspresję GFP przy użyciu cytometru obrazowego tally. Komórki z transdukcją GFP barwi się za pomocą zestawu do oznaczania żywotności tally viability kit dead cell red, który barwi wszystkie martwe komórki na czerwono za pomocą jodku propidyny. Następnie komórki przenosi się pipetą na szkiełko do analizy komórkowej tally i umieszcza w cytometrze, który pozyskuje i analizuje obrazy w świetle przechodzącym oraz obrazy fluorescencji czerwonej i zielonej. Następnie generowane są histogramy przedstawiające liczbę komórek, wielkość komórek, intensywność fluorescencji PI oraz intensywność fluorescencji GFP w porównaniu z tradycyjną cytometrią przepływową.System Tali może dostarczyć podobnych danych dotyczących żywotności i ekspresji komórek. Jednak ta cytometria oparta na obrazowaniu dostarcza dodatkowych informacji wizualnych na temat badanej populacji komórek. Główną zaletą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak cytometria przepływowa czy mikroskopia fluorescencyjna, jest to, że cytometr obrazujący Tally dostarcza jednocześnie informacji ilościowych i wizualnych na temat próbki komórkowej.Dodatkowo urządzenie do zliczania jest łatwiejsze w obsłudze, tańsze i zajmuje mniej miejsca niż cytometr przepływowy czy mikroskop fluorescencyjny. Pozwala to badaczom na szybkie przeprowadzanie ilościowych analiz, takich jak ocena żywotności komórek ekspresujących GFP, bezpośrednio na blacie laboratoryjnym. W tej procedurze komórki U2 OS o stężeniu 1×10⁶ komórek/ml zostały przetransdukowane wirusowym konstruktem GFP celowanym do jądra komórkowego, a martwe komórki zabarwiono jodekiem propidyny; następnie 100 µL zawiesiny komórkowej przeniesiono do nowej probówki do mikrocentryfugi.Należy zauważyć, że do analizy zaleca się stężenie od 1 × 10⁵ do 1 × 10⁷ komórek na mililitr, choć stężenie nie musi być dokładne. Następnie należy dodać 1 µL odczynnika Tally Dead Cell Red. Po czym krótko wymieszać na wstrząsarku typu vortex i inkubować mieszaninę odczynnika barwiącego i komórek w temperaturze pokojowej, w ciemności, przez od 1 do 5 minut.Po inkubacji należy niezwłocznie przystąpić do analizy przy użyciu cytometru obrazowego tally. W urządzeniu tally stosuje się jednorazowe plastikowe slajdy do analizy komórkowej, zaprojektowane specjalnie dla tego instrumentu. Podczas ładowania slajdu należy go zawsze trzymać za krawędzie.Powoli pipetuj 25 µL próbki do jednego z półksiężycowatych obszarów ładowania próbek. W komorze A ładuje się niebarwione, nietransdukowane komórki kontrolne, a w komorze B barwione komórki wykazujące ekspresję GFP. Aby przeprowadzić analizę żywotności komórek wykazujących ekspresję GFP, dotknij pola G-F-P-R-F-P na ekranie głównym cytometru. Następnie po prawej stronie pojawią się opcje analizy; wybierz GFP plus viability.Następnie instrument zapyta, czy należy nazwać serię próbek. Naciśnij przycisk „name now”. Następnie za pomocą ekranu dotykowego wpisz nazwę serii próbek i naciśnij „save”; cytometr tally automatycznie przejdzie do ekranu pomiaru.Następnie, aby zmierzyć fluorescencję tła, naciśnij kartę background w dolnej prawej części ekranu pomiarowego, tak jak pokazano tutaj. Ustawienie domyślne wskazuje, że obrazowane będzie dziewięć pól komórek. Teraz, kierując próbkę kontrolną w stronę przeciwną do instrumentu, włóż preparas do otworu załadunkowego, aż do zatrzymania.Aby wprowadzić nową, niebarwioną kontrolę komórkową, nie należy naciskać z siłą ekranu w tle. Preparat zostanie automatycznie wciągnięty do instrumentu, a na ekranie pojawi się obraz komórek w czasie rzeczywistym. Za pomocą pokrętła ostrości należy ustawić komórki w odpowiedniej płaszczyźnie widzenia podczas ustawiania ostrości.Przesuń czerwony przycisk powiększenia na 4 x lub 16 x. Aby lepiej widzieć populację komórek, powinny być one jednolicie ciemne z jasną otoczką wokół każdej z nich. Jak pokazano tutaj, liczba komórek może zostać niedoszacowana, gdy przejście między tłem a krawędziami komórek jest rozmyte, przez co granice komórek nie są wyraźnie zdefiniowane.Komórki mogą zostać policzone w nadmiarze, gdy posiadają jasne centra i ciemne obrysy. Po ustawieniu ostrości komórek należy dotknąć lub nacisnąć przycisk, aby uruchomić kontrolę dla niebarwionych komórek. W celu pomiaru fluorescencji tła cytometr automatycznie przechwyci obrazy i wyświetli miniatury każdego pola widzenia.Pasek postępu zapewnia bieżące aktualizacje stanu analizy. Po zakończeniu przechwytywania obrazu cytometr automatycznie wysuwa preparat i dostarcza dane z analizy przechwyconych obrazów. Przechowywane dane są wyświetlane w menu rozwijanym w karcie tła.Próbka kontrolna tła otrzyma tę samą nazwę, co próbka eksperymentalna. Aby przeprowadzić analizę próbki transdukowanej GFP barwionej PI, należy wyjąć preparat z urządzenia, obrócić go i ponownie włożyć tak, aby próbka transdukowana była skierowana w stronę przeciwną do urządzenia. Naciśnij zakładkę próbki, a następnie dotknij przycisku wstawiania nowej próbki.Gdy obraz pojawi się na ekranie, należy użyć pokrętła ostrości, aby wyostrzyć obraz komórek. Następnie, jak wcześniej, należy nacisnąć przycisk „run sample”, aby uruchomić analizę próbki. Po zakończeniu przechwytywania obrazu dane z analizy zostaną wyświetlone w zakładce próbki, a cytometr automatycznie i w odpowiedni sposób wysunie preparat.Utylizuj preparat do analizy komórkowej Tally. Ze względu na to, że są to odpady biologicznie niebezpieczne, preparaty te nie mogą być używane ponownie. Po przeprowadzeniu analizy próbki można zastosować odpowiednie progi odcięcia.Aby przeanalizować tutaj konkretne populacje komórek, dostosujemy progi w celu określenia odsetka komórek żywych i martwych. W zakładce próbki, w sekcji komórek wykazujących ekspresję GFP, podana jest liczba i procent komórek wykazujących ekspresję GFP, martwych komórek wykazujących ekspresję GFP oraz całkowita żywotność. Wyświetlane są również średnia wielkość komórki, liczba policzonych komórek oraz stężenie komórek.Dodatkowo w dolnej części ekranu wyświetlane są histogramy przedstawiające wielkość komórek oraz fluorescencję zieloną i czerwoną. Aby ustawić bramkę wielkości komórek, dotknij miniatury wielkości komórek, aby otworzyć odpowiedni histogram i wykluczyć resztki komórkowe (debris). Przesuń niebieskie suwaki, aby wykluczyć zarówno zdarzenia zbyt duże, jak i zbyt małe.Dotknij przycisku „apply”, aby uwzględnić komórki znajdujące się w obrębie bram. Następnie, aby dodać fluorescencję GFP do analizy, dotknij miniatury histogramu GFP, aby go otworzyć.Przesuń niebieski suwak, aby ustawić próg tuż po prawej stronie najniższego piku. Jako pomoc posłuż się próbką kontrolną. Pozwoli to na uwzględnienie w analizie komórek GFP-dodatnich przy jednoczesnym wykluczeniu komórek autofluorescencyjnych.Autofluorescencja jest często obserwowana, gdy cząsteczki biologiczne wewnątrz komórek są poddawane działaniu laserów. Zastosuj potwierdzenie i powróć do poprzedniego ekranu. Dane wyświetlane w zakładce próbki powinny teraz odzwierciedlać bramki i progi ustawione dla obu kanałów fluorescencji. Następnie, aby oddzielić komórki zabarwione PI od autofluorescencji lub jakiegokolwiek tła obecnego w próbce, naciśnij miniaturę histogramu PI, aby ponownie go otworzyć.Szczyt próbki kontrolnej zostanie wyświetlony na histogramie jako szczyt szary. Szczyt czerwony odpowiada fluorescencji próbki. Fluorescencja tła jest wyświetlana jako szczyt znajdujący się najbliżej wartości zero RFU w tym urządzeniu.Aby wyeliminować fluorescencję tła w kanale PI, przesuń niebieski suwak w celu dostosowania progu odcięcia. Aby wykluczyć ten pik, użyj szarego piku z próbki kontrolnej jako punktu odniesienia. Po odpowiednim ustawieniu progu w kanale PI dotknij przycisku zatwierdź, aby potwierdzić i powrócić do poprzedniego ekranu; urządzenie do zliczania ponownie automatycznie przeanalizuje dane i zaktualizuje wyniki w zakładce próbek.Następnie, aby wizualnie potwierdzić prawidłowe przypisanie każdej komórki, należy nacisnąć kartę przybliżania (zoom), a następnie wybrać do przeglądu przechwycone pole widzenia, naciskając miniaturę obrazu. Następnie należy nacisnąć kartę warstw (layers). W kolejnym kroku należy nacisnąć przycisk GFP lub PI, aby wyświetlić obraz przechwycony w danym kanale.Naciśnij ten sam przycisk ponownie, aby usunąć warstwę z wyświetlacza lub nałożyć warstwy na siebie; dotknij przycisków odpowiadających poszczególnym kanałom, aby sprawdzić, w jaki sposób zliczano komórki w danym kanale. Zakreślone okręgi oznaczają komórki zliczone wyłącznie w kanale jasnego pola, które nie wykazują fluorescencji – zostaną one obwiedzione na niebiesko. Wskazuje to, że dana komórka jest żywą komórką wykazującą ekspresję w kanale zielonym.Komórki wykazujące ekspresję GFP zostaną obwiedzione na zielono w kanale czerwonym. Komórki barwione PI zostaną obwiedzione na czerwono i są to komórki martwe liczone w obu kanałach. Komórki widoczne w kanale czerwonym i zielonym zostaną obwiedzione na żółto.Wskazuje to, że komórka wykazuje ekspresję GFP, ale jest również zabarwiona pi, a zatem jest martwa. Okazyjnie na ekranie może pojawić się czarne koło. Są to obiekty, które zostały zidentyfikowane, lecz wykluczone z analizy ze względu na rozmiar komórek.Należy kontynuować precyzyjne dostrajanie progu na histogramie fluorescencji, stosując opisane wcześniej kroki, aż do momentu, gdy każda komórka wykazująca fluorescencję zostanie otoczona obwódką w odpowiednim kolorze. Wszystkie parametry analizy są automatycznie zapisywane w urządzeniu w zakładce danych.Licznik może przechowywać pliki danych z 500 serii pomiarowych. Każdy plik zapisany w karcie danych jest dostępny do ponownej analizy. Po wybraniu pliku z karty danych zostanie on ponownie otwarty, a wszystkie histogramy i warstwy staną się aktywne, co umożliwia archiwizację danych oraz generowanie raportów.Dane zapisane w urządzeniu można przenieść na komputer za pomocą dysku USB. Cztery reprezentatywne typy komórek zostały przetransdukowane wirusowym konstruktem GFP, będącym białkiem fluorescencyjnym skierowanym do jądra komórkowego, a następnie zabarwione zestawem Tally Viability Kit przy użyciu odczynnika Dead Cell Red i przeanalizowane za pomocą Tally w cytometrze przepływowym, jak pokazano tutaj. Obie metody wykazały w przybliżeniu taki sam procent populacji dla każdego typu komórek wykazujących ekspresję GFP, a także procent całkowitej populacji, która była jednocześnie żywotna i wykazująca ekspresję GFP.Dane te wykazują, że cytometr Tali jest w stanie odróżnić całkowitą ekspresję GFP w populacji od ekspresji GFP w populacji żywych komórek. Przedstawiliśmy właśnie sposób wykorzystania cytometru obrazowego Tali do oceny ekspresji fluorescencji i żywotności w próbce komórek. Technologia ta wypełnia lukę między badaniami pojedynczych komórek a badaniami populacyjnymi.Korzystając z cytometru obrazowego tally, można gromadzić ilościowe i jakościowe informacje wizualne na temat pojedynczych komórek, jak i większych populacji komórkowych. Stosując tę samą procedurę, można przeprowadzić kilka innych analiz, w tym badanie apoptozy, ekspresji RFP oraz żywotności komórek. W przypadku komórek niewyrażających określonych białek, potencjalne zastosowania obejmują zarówno ocenę ekspresji genów, jak i badania skuteczności leków.

assessment-gfp-expression-viability-using-tali-image-based

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ocena ekspresji GFP i żywotności za pomocą cytometru opartego na obrazie Tali

Opisujemy metodę wprowadzania, śledzenia i ilościowej analizy ekspresji GFP w komórkach roślinnych. Metoda ta wykorzystuje specjalnie zaprojektowany system robotyczny do półciągłego zbierania obrazów z dużej liczby próbek w czasie. Demonstrujemy również zastosowanie programów ImageJ i ImageReady do analizy serii obrazów.

Robotyka i dynamiczna analiza obrazu w badaniach ekspresji genów w tkankach roślinnych

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem testu bliskości opartego na FRET.

Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Opisano protokół analizy cyklu komórkowego żywych tkanek Drosophila za pomocą cytometru Attune Acoustic Focusing. Protokół ten jednocześnie dostarcza informacji o względnej wielkości komórki, liczbie komórek, zawartości DNA i typie komórki poprzez śledzenie linii lub specyficzną dla tkanek ekspresję białek fluorescencyjnych in vivo.

Analiza cyklu komórkowego żywych tkanek Drosophila przy użyciu cytometru akustycznego Attune i barwienia Vybrant DyeCycle Violet DNA

Złożone masy tkankowe, od organów po guzy, składają się z różnych elementów komórkowych. Wyjaśniliśmy udział fenotypów komórkowych w tkance przy użyciu wieloznakowanych fluorescencyjnych myszy transgenicznych w połączeniu z wieloparametrowym barwieniem immunofluorescencyjnym, a następnie rozmieszaniem widmowym w celu rozszyfrowania pochodzenia komórek, a także cech komórek na podstawie ekspresji białka.

Ilościowa analiza wielospektralna po przeszczepie tkanki fluorescencyjnej w celu wizualizacji pochodzenia, typów i interakcji komórek

Tutaj pokazujemy, jak cytometria obrazowa może być wykorzystana do ilościowego oznaczania grzybów chorobotwórczych w połączeniu z komórkami gospodarza w hodowli.  Ta technika może być używana jako alternatywa dla wyliczania CFU.

Zastosowanie cytometrii obrazowej do ilościowego oznaczania grzybów chorobotwórczych w połączeniu z komórkami gospodarza

Presented to elastyczny przepływ pracy w informatyce, umożliwiający multipleksowaną analizę obrazów fluorescencyjnie znakowanych komórek. Przepływ pracy określa ilościowo markery jądrowe i cytoplazmatyczne oraz oblicza translokację markerów między tymi przedziałami. Przedstawiono procedury perturbacji komórek z wykorzystaniem siRNA oraz wiarygodną metodologię wykrywania markerów za pomocą immunofluorescencji pośredniej w formatach 96-dołkowych.

Przepływ pracy dla wysokiej zawartości, indywidualnej kwantyfikacji komórek markerów fluorescencyjnych na podstawie danych z mikroskopu uniwersalnego, wspierany przez oprogramowanie Open Source

Na poziomie subkomórkowym, zdarzenia sygnalizacyjne są dynamicznie modulowane przez sygnały rozwojowe i środowiskowe. W tym miejscu opisujemy protokół, który wykorzystuje system przejściowej ekspresji tytoniu do monitorowania dynamicznej interakcji białko-białko i ujawniania przestrzennej organizacji transdukcji sygnału w komórkach roślinnych.

Obrazowanie przestrzennej reorganizacji szlaku sygnałowego MAPK przy użyciu systemu przejściowej ekspresji tytoniu

Prezentujemy otwarty instrument do analizy wysokiej zawartości (HCA) wykorzystujący automatyczne obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) do oznaczania interakcji białek za pomocą odczytów opartych na transferze energii rezonansu Förstera (FRET). Akwizycja danych dla tego urządzenia openFLIM-HCA jest kontrolowana przez oprogramowanie napisane w μManager, a analiza danych odbywa się w FLIMfit.

Analiza Open Source o wysokiej zawartości z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Obrazowanie żywych komórek dostarcza bogactwa informacji o pojedynczych komórkach lub całych populacjach, które są nieosiągalne przez samo obrazowanie komórek stałych. W tym miejscu opisano protokoły obrazowania żywych komórek w celu oceny decyzji dotyczących losu komórek po leczeniu lekiem antymitotycznym paklitakselem.

Długoterminowe obrazowanie żywych komórek w celu oceny losu komórek w odpowiedzi na paklitaksel

Opisujemy protokół pomiaru kontaktów między komórkami w sąsiednich warstwach nabłonka w żywych dyskach imaginalnych skrzydeł Drosophila przy użyciu podejścia opartego na rekonstytucji GFP.

System podwójnej ekspresji oparty na komplementacji GFP do oceny kontaktu komórka-komórka, w którym pośredniczą cytonemy w żywych krążkach imaginalnych skrzydeł Drosophila

Naucz się oceniać żywotność i ekspresję GFP w komórkach za pomocą cytometru obrazowego Tali. Ta metoda dostarcza jednocześnie danych ilościowych i wizualnych o populacjach komórkowych.

Ocena ekspresji GFP i żywotności z wykorzystaniem cytometru obrazowego Tali

Przeglądaj więcej filmów