Ocena ekspresji i żywotności GFP za pomocą cytometru obrazowego Tali
November 17th, 2011
Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać testy żywotności komórek i ekspresji fluorescencji za pomocą cytometru Tali opartego na obrazie.
Ten film przedstawia procedurę określania żywotności komórek w komórkach wykazujących ekspresję GFP za pomocą cytometru opartego na obrazie tally. Komórki transdukowane GFP są barwione za pomocą zestawu do żywotności martwych komórek na czerwono, który barwi wszystkie martwe komórki na czerwono jodkiem propidyny, komórki są pipetowane do szkiełka analizy komórkowej i ładowane do cytometru, który pozyskuje i analizuje jasne pole oraz obrazy fluorescencji czerwonej i zielonej. Następnie generowane są histogramy w celu wyświetlenia liczby komórek, wielkości komórki, intensywności fluorescencji PI i intensywności fluorescencji GFP w porównaniu z tradycyjną cytometrią przepływową.
Tali może dostarczyć podobnych danych dotyczących żywotności i ekspresji komórek. Jednak ta cytometria oparta na obrazie dostarcza dodatkowych informacji wizualnych o badanej populacji komórek. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak cytometria przepływowa lub mikroskopia fluorescencyjna, jest to, że cytometr oparty na obrazie tally dostarcza jednocześnie informacji ilościowych i wizualnych o próbce komórki.
Ponadto przyrząd do pomiaru jest łatwiejszy w użyciu, tańszy i zajmuje mniej miejsca niż cytometr przepływowy lub mikroskop fluorescencyjny. Dzięki temu naukowcy mogą szybko przeprowadzać testy ilościowe, takie jak żywotność komórek wykazujących ekspresję GFP na stole laboratoryjnym. W tej procedurze komórki U2 OS w stężeniu od jednego razy 10 do sześciu komórek na mililitr transdukowano ukierunkowanym na komórkę konstruktem wirusa GFP w celu podtrzymania martwych komórek za pomocą jodku propidyny, przenosząc 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do nowej probówki mikrowirówki.
Należy zauważyć, że do testu zaleca się stężenie od jednego razy 10 do piątego do jednego razy od 10 do siódmych komórek na mililitr, chociaż stężenie nie musi być dokładne. Następnie dodaj jeden mikrolitr odczynnika do liczenia martwych krwinek czerwonych. Następnie krótko wirować, aby wymieszać, inkubować odczynnik barwiący i mieszaninę komórek w temperaturze pokojowej w ciemności przez jedną do pięciu minut.
Po inkubacji natychmiast przystąp do analizy na cytometrze opartym na obrazie tally. Licznik wykorzystuje jednorazowe plastikowe szkiełka do analizy komórkowej zaprojektowane specjalnie dla tego instrumentu. Zawsze pamiętaj, aby trzymać suwak za krawędzie, aby go załadować.
Powoli odpipetować 25 mikrolitrów próbki do jednego z obszarów ładowania próbki w kształcie półksiężyca. W tym przypadku niebarwione komórki kontrolne transdukowane nont są ładowane do komory A, a barwione komórki eksprymujące GFP są ładowane do komory, B.To przeprowadzić test żywotności w komórkach eksprymujących GFP, dotknij G-F-P-R-F-P na ekranie głównym cytometru. Opcje testu pojawią się następnie po prawej stronie, wybierz GFP plus żywotność.
Przyrząd zapyta następnie, czy seria próbek powinna być nazwana, aby nazwać serię próbek. Naciśnij teraz nazwę. Następnie za pomocą ekranu dotykowego wpisz nazwę serii próbki i naciśnij zapisz, cytometr tally automatycznie przejdzie do ekranu pomiaru.
Następnie, aby zmierzyć fluorescencję tła, naciśnij zakładkę tła w prawej dolnej połowie ekranu pomiaru, jak można zobaczyć tutaj. Ustawienie domyślne wskazuje, że obrazem zostanie zobrazowanych dziewięć pól komórek. Teraz, gdy próbka kontrolna jest skierowana od przyrządu, włóż szkiełko do portu ładowania, aż się zatrzyma.
Nie przykładaj siły do ekranu tła, naciśnij dotykowo, aby wstawić nową niepoplamioną kontrolkę komórki. Slajd zostanie automatycznie wciągnięty do instrumentu, a na ekranie zostanie wyświetlony obraz komórek na żywo. Za pomocą pokrętła ostrości ustaw komórki w odpowiedniej płaszczyźnie view podczas ustawiania ostrości.
Przesuń czerwony przycisk zoomu na cztery x lub 16 x. Aby lepiej zobaczyć populację komórek, komórki powinny być jednolicie ciemne z jasną aureolą wokół każdej z nich. Jak pokazano tutaj, komórki mogą być niedostatecznie policzone, gdy przejście między tłem a krawędziami komórek jest rozmyte, tak że granice komórek nie są dobrze zdefiniowane.
Komórki mogą być przeliczone, gdy mają jasne centra i ciemne obwódki. Po ustawieniu ostrości na komórkach dotknij, naciśnij, aby uruchomić kontrolę niezabarwionych komórek. Aby zmierzyć fluorescencję tła, cytometr automatycznie przechwyci obrazy i wyświetli miniatury każdego pola widzenia.
Pasek postępu informuje o bieżącej aktualizacji analizy. Po zakończeniu przechwytywania obrazu cytometr automatycznie wysuwa szkiełko i dostarcza dane z analizy przechwyconych obrazów. Przechowywane dane są wyświetlane w menu rozwijanym na karcie w tle.
Próbie kontrolnej w tle zostanie przypisana taka sama nazwa, jak nazwa nadana eksperymentowi. Aby uruchomić próbkę transdukowaną GFP zabarwioną PI, wyjmij szkiełko z urządzenia, odwróć go i włóż ponownie tak, aby transdukowana próbka była skierowana od urządzenia. Naciśnij kartę sample, a następnie dotknij przycisku press, aby wstawić nową próbkę.
Gdy obraz pojawi się na ekranie, użyj pokrętła ostrości, aby ustawić ostrość komórek. Tak jak poprzednio, dotknij i naciśnij, aby uruchomić próbkę. Po zakończeniu przechwytywania obrazu dane z analizy pojawiają się w zakładce próbki, a cytometr automatycznie wysuwa szkiełko w odpowiedni sposób.
Wyrzuć slajd do analizy komórkowej. Jako odpady niebezpieczne biologicznie, zjeżdżalnie te nie mogą być ponownie użyte. Po uruchomieniu próbki można zastosować do niej progi.
Aby przeanalizować określone populacje komórek, dostosujemy progi, aby określić procent żywych i martwych komórek. W komórkach wykazujących ekspresję GFP pod zakładką próbki, liczba i procent komórek wykazujących ekspresję GFP żywych i martwych komórek wyrażających całkowitą żywotność GFP. Wyświetlany jest średni rozmiar komórki, liczba zliczonych komórek i koncentracja komórek.
Ponadto u dołu ekranu wyświetlane są wykresy histogramu przedstawiające rozmiar komórki, fluorescencję zieloną i fluorescencję czerwoną. Aby ustawić bramkę rozmiaru komórki, dotknij miniatury rozmiaru komórki, aby otworzyć histogram rozmiaru komórki i wykluczyć wszelkie zanieczyszczenia. Przesuń niebieskie suwaki, aby wykluczyć zarówno duże, jak i małe wydarzenia.
Dotknij opcji Zastosuj, aby uwzględnić komórki w bramkach. Obok opcji dodania fluorescencji GFP do analizy dotknij miniatury histogramu GFP. Aby go otworzyć.
Przesuń niebieski suwak, aby ustawić próg po prawej stronie najciemniejszego szczytu. Użyj próbki kontrolnej jako przewodnika. Dzięki temu analiza może obejmować komórki GFP dodatnie, ale wykluczać komórki autofluorescencyjne.
Autofluorescencja jest często obserwowana, gdy cząsteczki biologiczne w komórkach są stosowane w celu potwierdzenia i powrotu do poprzedniego ekranu. Dane wyświetlane w zakładce próbkowania powinny teraz odzwierciedlać bramki i progi ustawione dla obu kanałów fluorescencji. Następnie, aby oddzielić komórki barwiące PI od autofluorescencji lub dowolnego tła obecnego w próbce, naciśnij miniaturę histogramu PI, aby ją ponownie otworzyć.
Pik próby kontrolnej zostanie wyświetlony na histogramie jako szary pik. Czerwony pik to fluorescencja próbki. Fluorescencja tła jest wyświetlana jako pik najbliższy zerowej wartości RFU na tym instrumencie.
Aby wyeliminować fluorescencję tła w kanale PI, przesuń niebieski suwak, aby dostosować próg. Aby wykluczyć ten pik, użyj szarego piku z próbki kontrolnej jako odniesienia. Gdy próg w kanale PI zostanie odpowiednio ustawiony, dotknij zastosuj, aby potwierdzić i powrócić do poprzedniego ekranu, przyrząd do pomiaru automatycznie ponownie przeanalizuje dane i zaktualizuje wyniki w zakładce próbkowania.
Następnie, aby wizualnie potwierdzić, że każda komórka jest prawidłowo przypisana, naciśnij kartę powiększenia, a następnie wybierz przechwycone pole view do przeglądu, naciskając miniaturę obrazu. Następnie naciśnij zakładkę warstwy. Następnie naciśnij przycisk GFP lub PI, aby wyświetlić obraz przechwycony przez ten kanał.
Naciśnij ponownie ten sam przycisk, aby usunąć warstwę z wyświetlacza lub nałożyć warstwy, przyciski dotykowe odpowiadające każdemu kanałowi, aby określić, w jaki sposób komórki są zliczane przez określony kanał. Dotyk zakreśla kręgi Komórki, które zostały zliczone tylko przez kanał jasnego pola, które nie wyrażają fluorescencji, zostaną zakreślone na niebiesko. Oznacza to, że dana komórka jest żywymi komórkami wyrażającymi się w zielonym kanale.
GFP zostanie zakreślony w zielonych komórkach wyrażających się w kanale czerwonym. Zabarwione liczbą pi zostaną zakreślone na czerwono i w obu przypadkach zostaną zliczone martwe komórki. Czerwony i zielony kanał zostaną zakreślone na żółto.
Oznacza to, że komórka wykazuje ekspresję GFP, ale jest również zabarwiona liczbą pi i dlatego jest martwa. Od czasu do czasu na ekranie pojawi się czarne kółko. Są to obiekty, które zostały zidentyfikowane, ale zostały wykluczone z analizy na podstawie rozmiaru komórki.
Kontynuuj dostrajanie progu na histogramie fluorescencji, wykonując czynności opisane powyżej, aż każda komórka wyrażająca fluorescencję zostanie zakreślona odpowiednim kolorem. Wszystkie parametry analizy są automatycznie zapisywane w urządzeniu. Pod kranem danych.
Tally może przechowywać pliki danych z 500 próbnych przebiegów. Każdy plik zapisany w zakładce danych jest dostępny do ponownej analizy. Wybranie pliku z zakładki danych spowoduje jego ponowne otwarcie, a wszystkie histogramy i warstwy staną się aktywne w celu archiwizacji danych i generowania raportów.
Dane przechowywane w przyrządzie mogą być przesyłane do komputera za pomocą dysku USB. Cztery reprezentatywne typy komórek transdukowano za pomocą jądrowego światła komórkowego, konstrukt wirusa GFP wybarwiono zestawem żywotności tally przy użyciu czerwonego odczynnika martwego komórkowego i przeanalizowano za pomocą tally w cytometrze przepływowym, jak pokazano tutaj. Obie metody wykazały w przybliżeniu taki sam odsetek populacji dla każdego typu komórek, w których występowała ekspresja GFP, wraz z odsetkiem całej populacji, która była zarówno żywotna, jak i wykazywała ekspresję GFP.
Dane te pokazują, że cytometr Tali jest w stanie rozróżnić całkowitą ekspresję GFP w populacji od ekspresji GFP w żywej populacji. Właśnie pokazaliśmy, jak używać cytometru opartego na obrazie tally do oceny ekspresji fluorescencji i żywotności w próbce komórki. Technologia ta wypełnia lukę między badaniami indywidualnymi i populacyjnymi komórkami.
Korzystając z cytometru opartego na obrazie tally, możesz zbierać ilościowe i jakościowe informacje wizualne o pojedynczych komórkach, a także o większych populacjach komórek. Korzystając z tej samej procedury, można przeprowadzić kilka innych testów, w tym apoptozę, ekspresję RFP i żywotność komórek W przypadku komórek bez ekspresji potencjalne zastosowania obejmują ocenę ekspresji genów do badań skuteczności leków.
Przegląd
Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać testy żywotności komórek i ekspresji fluorescencji za pomocą Tali Image-Based Cytometer. Metoda ta pozwala badaczom analizować populacje komórek z wykorzystaniem zarówno danych ilościowych, jak i wizualnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Mikroskopia fluorescencyjna
- Cytometria
Tło
- Tali Image-Based Cytometer stanowi alternatywę dla tradycyjnej cytometrii przepływowej.
- Umożliwia jednoczesne zdobywanie danych ilościowych i wizualnych.
- Metoda jest przyjazna dla użytkownika i opłacalna.
- Jest odpowiednia do analizy komórek ekspresujących GFP.
Cel badania
- Oceniać żywotność komórek w komórkach ekspresujących GFP.
- Demonstrować zalety cytometrii opartej na obrazie w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Dostarczać szczegółowego protokołu korzystania z Tali Image-Based Cytometer.
Stosowane metody
- Transdukcja komórek U2 OS z GFP.
- Barwienie reagentem Tali Dead Cell Red.
- Ładowanie próbek do szkieł Tali do analizy komórkowej.
- Używanie Tali Image-Based Cytometer do analizy.
Główne wyniki
- Dane ilościowe dotyczące żywotności komórek i ekspresji GFP.
- Wizualizacja populacji komórek.
- Histogramy przedstawiające wielkość komórek i intensywność fluorescencji.
- Porównanie wyników z tradycyjną cytometrią przepływową.
Wnioski
- Tali Image-Based Cytometer jest skuteczny w ocenie żywotności komórek.
- Zapewnia dodatkowe wizualne wgląd w populacje komórek.
- Metoda jest dostępna do użytku laboratoryjnego w środowiskach badawczych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The Tali Image-Based Cytometer bridges the gap between flow cytometry and fluorescence microscopy by delivering simultaneous quantitative and visual data for cell viability and GFP expression assays. This dual-output capability supports early discovery workflows where phenotypic confirmation and mechanistic de-risking require both population-level metrics and single-cell visualization. Its benchtop footprint, lower cost, and simplified operation enable decentralized use across discovery biology and assay development teams, reducing reliance on core facilities and accelerating go/no-go decisions in target validation pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating GFP expression with viability status in live-cell populations.
- Operational Value: Provides visual confirmation of transfection efficiency and protein localization alongside quantitative viability readouts.
- Predictive Value: Supports target confidence by distinguishing total GFP expression from expression in viable cells, reducing false-positive leads.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized histograms for cell size, PI fluorescence, and GFP intensity, enabling threshold-based gating for reproducible population analysis.
- Scalability: Processes thousands of cells per sample with consistent imaging and algorithmic analysis, supporting medium-throughput screening campaigns.
- Workflow Integration: Outputs are compatible with downstream analytics for hit selection and lead optimization in phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains assay consistency from discovery validation to preclinical models by providing comparable viability and expression data to flow cytometry.
- Mechanistic De-risking: Visual layering of brightfield, GFP, and PI signals confirms co-localization of transgene expression and cell death, clarifying mechanism of action.
- Predictive Confidence: Enables risk-adjusted advancement decisions by quantifying the fraction of live, transgene-expressing cells in heterogeneous populations.
Pipeline & Workflow Integration
The Tali cytometer fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification, where simultaneous viability and reporter gene assessment informs compound effects on cellular health and target engagement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking GFP reporter activity to cell survival, clarifying on-target versus off-target effects.
- Screening: Delivers quantitative fluorescence and viability outputs with visual validation, enhancing assay reproducibility and hit confirmation.
- Analytics: Provides histogram-based readouts for cell size, GFP intensity, and PI intensity, enabling statistical comparison across conditions and replicates.
- Translational Research: Ensures data continuity with preclinical workflows by mirroring flow cytometry outputs while adding visual context for mechanistic interpretation.
- Enterprise Reuse: Functions as a shared benchtop platform for multiple assays (viability, GFP/RFP expression, apoptosis), maximizing instrument utilization across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through correlated visual and quantitative data.
- Operational Value: Standardizes assay execution via disposable slides and automated image analysis, improving reproducibility and reducing user variability.
- Strategic Value: Accelerates discovery timelines by enabling rapid benchtop iteration without flow cytometry scheduling constraints.
- Portfolio Impact: Supports risk-based prioritization by quantifying live, transgene-positive cells, improving the quality of advancement candidates.
Implementation Considerations
- Requires basic training in fluorescence microscopy principles and threshold gating for fluorescence and scatter parameters.
- Depends on the Tali Image-Based Cytometer, Tali Cellular Analysis Slides, and Tali Viability Kit - Dead Cell Red reagent for PI-based viability detection.
- Necessitates standardization of staining protocols, incubation times, and focus procedures across users and sites for consistent results.
- Adaptation to other model systems may require optimization of cell concentration and staining conditions due to variations in size and autofluorescence.
- Practical limitations include inability to perform multi-parameter immunophenotyping beyond three channels and incompatibility with adherent cell assays without dissociation.
