Indukowana światłem ekspresja GFP w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu optogenetycznego systemu TAEL/C120
19 sierpnia 2021
Optogenetyka to potężne narzędzie o szerokim zastosowaniu. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób osiągnąć indukowaną światłem ekspresję genów w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu reagującego na niebieskie światło systemu TAEL/C120.
Protokół ten jest istotny, ponieważ jest to metoda optogenetyczna lub aktywowana światłem do indukowania ekspresji genów w nienaruszonym organizmie. W naszym przypadku zarodek danio pręgowanego. Zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona światło, jako czynnik indukujący, co pozwala na bardzo precyzyjną, przestrzenną i czasową kontrolę indukcji.
Protokół ten byłby przydatny w każdej sytuacji, w której przydatna byłaby indukowalna ekspresja genów. Obejmuje to takie rzeczy, jak śledzenie linii, testy wzmocnienia funkcji lub eksperymenty ratunkowe. Na początek ustaw panel LED względem szalek Petriego zawierających zarodki, aby dostarczyć 1,5 miliwata na centymetr kwadratowy mocy światła do kilku zarodków jednocześnie.
Aby zmniejszyć ryzyko uszkodzenia fotograficznego aktywatora transkrypcji ogona, należy umieszczać światło w odstępach jednej godziny włączania i wyłączania za pomocą przekaźnika czasowego, jeśli świeci dłużej niż trzy godziny. Zdejmij pokrywki szalki Petriego, aby zminimalizować rozpraszanie światła w wyniku kondensacji. Umieścić szalki Petriego zawierające zarodki kontrolne i pudełko odporne na światło do ciemnych kontroli.
Usuń zarodki z oświetlenia po pożądanym czasie aktywacji. Do ekstrakcji całkowitego RNA należy użyć zestawu do ekstrakcji RNA. Przenieś zarodki do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i usuń nadmiar wody jajecznej.
Po dodaniu buforu do lizy homogenizuj zarodki za pomocą plastikowego tłuczka. Przenieś lizat do dołączonej kolumny i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta w celu oczyszczenia RNA. Oczyszczony RNA należy przechowywać w temperaturze od minus 20 do minus 80 stopni Celsjusza do czasu użycia lub natychmiast zsyntetyzować cDNA z jednego mikrograma, całkowitego RNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
Dodaj jeden mikrogram RNA do cienkościennej 0,2 mililitrowej probówki PCR, zawierającej cztery mikrolitry, pięciokrotnej mieszanki głównej reakcji cDNA, a następnie dodaj jeden mikrolitr 20-krotnego roztworu enzymu odwrotnej transkryptazy. Następnie uzupełnij końcową objętość 20 mikrolitrów wodą wolną od nukleaz. Umieść probówkę w zaprogramowanym termocyklerze w celu syntezy cDNA.
Zsyntetyzowane cDNA należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu użycia lub natychmiastowego użycia do oceny ilościowej. Skonfiguruj ilościowe reakcje PCR zawierające główną mieszankę enzymów cyber green. Pięciokrotnie rozcieńczone startery cDNA i GFP o stężeniu 325 nanomolowym w trzech egzemplarzach i przeprowadzić reakcję w zaprogramowanej maszynie do PCR w czasie rzeczywistym.
Po zakończeniu reakcji należy przeanalizować krzywą topnienia, aby określić specyficzność reakcji. Oblicz indukcję aktywowaną światłem jako zmianę fałdowania w stosunku do zarodków kontrolnych za pomocą metody podwójnej Delta CT. I użyj oprogramowania statystycznego, aby określić istotność.
Po usunięciu zarodków z oświetlenia, unieruchomić zarodki do obrazowania w 3% metylocelulozie zawierającej 0,01% trikainy w szkiełkach wgłębieniowych. Rejestruj obrazy fluorescencyjne i w jasnym polu za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego podłączonego do aparatu cyfrowego przy użyciu standardowych ustawień filtra GFP. Łącz obrazy jasnego pola i fluorescencji po akwizycji za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu.
Kwantyfikacja ekspresji GFP wykazała indukcję ekspresji już po 30 minutach od ekspozycji na światło niebieskie. Poziomy ekspresji GFP następnie rosły do sześciu godzin, po aktywacji równomiernie. Indukcję GFP oceniono również jakościowo, badając intensywność fluorescencji w tych samych punktach czasowych po aktywacji.
Fluorescencję GFP powyżej poziomów tła zaobserwowano po raz pierwszy po trzech godzinach od aktywacji i stała się zauważalnie jaśniejsza po sześciu godzinach od aktywacji. Natomiast zarodki kontrolne we wszystkich punktach czasowych, trzymane w ciemności, nie wykazywały żadnej znaczącej fluorescencji GFP. Światło aktywujące musi znajdować się w niebieskim zakresie widma światła widzialnego.
Zarówno światło w pomieszczeniu, jak i światło słoneczne zawierają trochę niebieskiego światła. Dlatego zadbaj o ochronę swoich negatywnych kontroli przed wszelkimi źródłami światła otoczenia. System TAEL C120 jest genetycznie kodowany i modułowy i może sterować ekspresją dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania.
Tak więc, w połączeniu z innymi technikami, może być używany do udzielania odpowiedzi na szereg pytań biologicznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół demonstruje wykorzystanie optogenetyki do uzyskania indukowalnej światłem ekspresji genów w embrionach rybek danio. System TAEL/C120, reagujący na światło niebieskie, umożliwia precyzyjną kontrolę nad ekspresją genów w nienaruszonym organizmie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Optogenetyka
- Ekspresja genów
- Modele rybek zebra
Wprowadzenie
- Optogenetyka jest metodą aktywowaną światłem, służącą do indukcji ekspresji genów.
- Technika ta zapewnia przestrzenną i czasową kontrolę indukcji.
- Jest ona szczególnie użyteczna w badaniach nad śledzeniem linii komórkowych oraz w testach funkcji wzmocnionej (gain-of-function).
- Zarodki zebrafish służą jako model do badania ekspresji genów in vivo.
Cel badania
- Zaprezentowanie metody indukowalnej światłem ekspresji genów.
- Udostępnienie protokołu dla badaczy zainteresowanych zastosowaniami optogenetycznymi.
- Ułatwienie przeprowadzania eksperymentów wymagających precyzyjnej kontroli nad ekspresją genów.
Zastosowane metody
- Ustawienie panelu LED względem szalek Petri zawierających embriony.
- Dostarczenie światła o mocy 1,5 mW/cm².
- Indukowanie ekspresji genów w wielu embrionach jednocześnie.
- Wykorzystanie systemu optogenetycznego TAEL/C120 do kontroli genów.
Główne wyniki
- Skuteczna indukcja ekspresji genów w embrionach danio pręgowanego.
- Wykazanie przestrzennej i czasowej kontroli nad aktywacją genów.
- Opracowanie niezawodnego protokołu dla przyszłych badań optogenetycznych.
- Wskazanie zalet wykorzystania światła jako czynnika indukującego.
Wnioski
- Optogenetyka oferuje potężne narzędzie do badania funkcji genów.
- System TAEL/C120 jest skuteczny w indukowaniu ekspresji genów in vivo.
- Metoda ta może być stosowana w różnych scenariuszach badań biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Optogenetyczna kontrola ekspresji genów umożliwia precyzyjne przestrzennie i czasowo badanie celów biologicznych in vivo, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkryć. System TAEL/C120 stanowi genetycznie kodowaną, przełączalną światłem platformę do walidacji hipotez terapeutycznych z ilościowymi odczytami. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu, umożliwiając odwracalną, zależną od dawki modulację ekspresji genów w embrionach ryb zebrafish.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez indukowalną i odwracalną aktywację genów w nienaruszonym modelu kręgowca.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez powiązanie indukowanej światłem ekspresji z odczytami fenotypowymi za pomocą reportera GFP oraz ilościowego qRT-PCR.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia przeprowadzanie eksperymentów typu gain-of-function i rescue w celu oceny wystarczalności celu oraz istotności szlaku w kontekstach związanych z chorobami.
Przesiew i opracowanie testu
- Gotowość testu: Generuje ilościową, zależną od światła ekspresję GFP, którą można zmierzyć za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i qRT-PCR w celu przesiewania związków lub warunków.
- Powtarzalność: Umożliwia zastosowanie standaryzowanych protokołów indukcji z określoną intensywnością światła (1.5 mW/cm²) i kontrolą czasową w celu zminimalizowania zmienności między powtórzeniami.
- Skalowalność: Kompatybilność z formatami wielodołkowymi z wykorzystaniem paneli LED do jednoczesnego traktowania wielu embrionów w kontrolowanym oświetleniu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Modelowanie chorób: Wspiera prekliniczne modele oparte na rybach zebrafish, w których czasowa kontrola ekspresji genów naśladuje indukowalne interwencje terapeutyczne.
- Dostrojenie biomarkerów: Wyniki z użyciem GFP oraz qRT-PCR służą jako przekładalne odczyty farmakodynamiczne w celu oceny aktywacji szlaku i modulacji celu.
- Mitygacja ryzyka: Pozwala na obniżenie ryzyka związanego z celami terapeutycznymi poprzez testowanie ich konieczności i wystarczalności za pomocą indukowalnego wzmocnienia funkcji (gain-of-function) i projektów ratunkowych (rescue) przed rozpoczęciem badań na ssakach.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania – od testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych po identyfikację związków wiodących – umożliwiając iteracyjną walidację celów molekularnych w systemie kręgowców.
- Biologia odkrywcza: Testowanie wystarczalności celu i aktywacji szlaku poprzez indukowaną światłem ekspresję in vivo w określonym czasie.
- Przesiewanie: Dostarczanie ilościowych, znormalizowanych wyników (krotność zmiany GFP) w celu porównania warunków genetycznych lub farmakologicznych.
- Analityka: Wykorzystanie metody qRT-PCR double delta CT oraz intensywności fluorescencji do porównania statystycznego między grupami indukowanymi a kontrolami w ciemności.
- Badania translacyjne: Powiązanie indukowalnej ekspresji z efektami fenotypowymi u rybek danio-ostroskrzelnych, co zapewnia ciągłość w przejściu do przedklinicznych testów skuteczności.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Modularny system TAEL/C120 może sterować dowolnym genem zainteresowania, umożliwiając ponowne zastosowanie w wielu celach i projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez zapewnienie precyzyjnej kontroli czasowej nad ekspresją genów w złożonym organizmie.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanemu dostarczaniu światła i wewnętrznym kontrolom w ciemności w celu uwzględnienia zmienności środowiskowej.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, umożliwiając szybką i odwracalną modulację celu w celu oceny konsekwencji fenotypowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez walidację celów w fizjologicznie istotnym, indukowalnym systemie przed zasobochłonnym etapem rozwoju.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli rybek danio-ostrobramych, mikroiniekcji oraz konfiguracji sprzętu optogenetycznego.
- Zależny od systemów oświetlenia LED zdolnych do dostarczania precyzyjnej intensywności światła niebieskiego i kontroli czasu naświetlania.
- Wymaga standaryzowanych protokołów czasu ekspozycji na światło oraz utrzymania kontroli w ciemności w celu zapewnienia porównywalności danych.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania parametrów przy skalowaniu do różnych stadiów embrionalnych lub tła genetycznego.
- Ograniczony przez penetrację światła w tkankach nieprzezroczystych, choć efekt ten jest łagodzony w embrionach rybek danio-ostrobramych dzięki ich przejrzystości optycznej.
