Indukowana światłem ekspresja GFP w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu optogenetycznego systemu TAEL/C120

Protokół ten jest istotny, ponieważ jest to metoda optogenetyczna lub aktywowana światłem do indukowania ekspresji genów w nienaruszonym organizmie. W naszym przypadku zarodek danio pręgowanego. Zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona światło, jako czynnik indukujący, co pozwala na bardzo precyzyjną, przestrzenną i czasową kontrolę indukcji.

Protokół ten byłby przydatny w każdej sytuacji, w której przydatna byłaby indukowalna ekspresja genów. Obejmuje to takie rzeczy, jak śledzenie linii, testy wzmocnienia funkcji lub eksperymenty ratunkowe. Na początek ustaw panel LED względem szalek Petriego zawierających zarodki, aby dostarczyć 1,5 miliwata na centymetr kwadratowy mocy światła do kilku zarodków jednocześnie.

Aby zmniejszyć ryzyko uszkodzenia fotograficznego aktywatora transkrypcji ogona, należy umieszczać światło w odstępach jednej godziny włączania i wyłączania za pomocą przekaźnika czasowego, jeśli świeci dłużej niż trzy godziny. Zdejmij pokrywki szalki Petriego, aby zminimalizować rozpraszanie światła w wyniku kondensacji. Umieścić szalki Petriego zawierające zarodki kontrolne i pudełko odporne na światło do ciemnych kontroli.

Usuń zarodki z oświetlenia po pożądanym czasie aktywacji. Do ekstrakcji całkowitego RNA należy użyć zestawu do ekstrakcji RNA. Przenieś zarodki do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i usuń nadmiar wody jajecznej.

Po dodaniu buforu do lizy homogenizuj zarodki za pomocą plastikowego tłuczka. Przenieś lizat do dołączonej kolumny i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta w celu oczyszczenia RNA. Oczyszczony RNA należy przechowywać w temperaturze od minus 20 do minus 80 stopni Celsjusza do czasu użycia lub natychmiast zsyntetyzować cDNA z jednego mikrograma, całkowitego RNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.

Dodaj jeden mikrogram RNA do cienkościennej 0,2 mililitrowej probówki PCR, zawierającej cztery mikrolitry, pięciokrotnej mieszanki głównej reakcji cDNA, a następnie dodaj jeden mikrolitr 20-krotnego roztworu enzymu odwrotnej transkryptazy. Następnie uzupełnij końcową objętość 20 mikrolitrów wodą wolną od nukleaz. Umieść probówkę w zaprogramowanym termocyklerze w celu syntezy cDNA.

Zsyntetyzowane cDNA należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu użycia lub natychmiastowego użycia do oceny ilościowej. Skonfiguruj ilościowe reakcje PCR zawierające główną mieszankę enzymów cyber green. Pięciokrotnie rozcieńczone startery cDNA i GFP o stężeniu 325 nanomolowym w trzech egzemplarzach i przeprowadzić reakcję w zaprogramowanej maszynie do PCR w czasie rzeczywistym.

Po zakończeniu reakcji należy przeanalizować krzywą topnienia, aby określić specyficzność reakcji. Oblicz indukcję aktywowaną światłem jako zmianę fałdowania w stosunku do zarodków kontrolnych za pomocą metody podwójnej Delta CT. I użyj oprogramowania statystycznego, aby określić istotność.

Po usunięciu zarodków z oświetlenia, unieruchomić zarodki do obrazowania w 3% metylocelulozie zawierającej 0,01% trikainy w szkiełkach wgłębieniowych. Rejestruj obrazy fluorescencyjne i w jasnym polu za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego podłączonego do aparatu cyfrowego przy użyciu standardowych ustawień filtra GFP. Łącz obrazy jasnego pola i fluorescencji po akwizycji za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu.

Kwantyfikacja ekspresji GFP wykazała indukcję ekspresji już po 30 minutach od ekspozycji na światło niebieskie. Poziomy ekspresji GFP następnie rosły do sześciu godzin, po aktywacji równomiernie. Indukcję GFP oceniono również jakościowo, badając intensywność fluorescencji w tych samych punktach czasowych po aktywacji.

Fluorescencję GFP powyżej poziomów tła zaobserwowano po raz pierwszy po trzech godzinach od aktywacji i stała się zauważalnie jaśniejsza po sześciu godzinach od aktywacji. Natomiast zarodki kontrolne we wszystkich punktach czasowych, trzymane w ciemności, nie wykazywały żadnej znaczącej fluorescencji GFP. Światło aktywujące musi znajdować się w niebieskim zakresie widma światła widzialnego.

Zarówno światło w pomieszczeniu, jak i światło słoneczne zawierają trochę niebieskiego światła. Dlatego zadbaj o ochronę swoich negatywnych kontroli przed wszelkimi źródłami światła otoczenia. System TAEL C120 jest genetycznie kodowany i modułowy i może sterować ekspresją dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania.

Tak więc, w połączeniu z innymi technikami, może być używany do udzielania odpowiedzi na szereg pytań biologicznych.