Name: Indukowana światłem ekspresja GFP w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu optogenetycznego systemu TAEL/C120 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Poznaj metodę indukowanej światłem ekspresji genu w zarodkach Danio rerio przy użyciu systemu optogenetycznego TAEL/C120. Technika zapewnia precyzyjną kontrolę przestrzenną i czasową aktywacji genu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Stefanowi Maternie i członkom laboratoriów Woo i Materna za pomocne sugestie i komentarze na temat tego protokołu. Dziękujemy Annie Reade, Kevinowi Gardnerowi i Laurze Motta-Mena za cenne dyskusje i spostrzeżenia podczas opracowywania tego protokołu. Prace te były wspierane przez granty z National Institutes of Health (NIH; R03 DK106358) oraz Komitetu Koordynacyjnego ds. Badań nad Rakiem Uniwersytetu Kalifornijskiego (CRN-20-636896) do S.W.

To badanie zostało przeprowadzone za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Kalifornijskiego w Merced.
1. Krzyżowanie się danio pręgowanego i zbieranie zarodków
<ol>
	<li>Utrzymuj oddzielne transgeniczne linie danio pręgowanego zawierające aktywator transkrypcji TAEL lub gen reporterowy kontrolowany przez C120, aby zminimalizować fałszywą aktywację.</li>
	<li>Skrzyżuj 6-8 dorosłych ryb danio pręgowanego z każdej linii przy użyciu standardowych metod9, aby uzyskać podwójne transgeniczne zarodki, które zawierają zarówno składniki TAEL, jak i C120 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). 
	UWAGA: Alternatywnie, oba składniki mogą ulegać przejściowej ekspresji poprzez mikroiniekcję mRNA lub plazmidowego DNA przy użyciu standardowych metod10.</li>
	<li>Zebrać zarodki na szalkach Petriego zawierających wodę jajeczną (60 μg/ml soli morskiej Instant Ocean rozpuszczonej w wodzie destylowanej), z około 30 zarodkami na stan do przetestowania.</li>
	<li>Umieść naczynia w światłoszczelnym pudełku lub przykryj folią aluminiową, aby zminimalizować niezamierzoną aktywację przez światło otoczenia (patrz Tabela 1).</li>
</ol>
2. Globalna indukcja światła
<ol>
	<li>Użyj panelu LED o niebieskim świetle (465 nm), aby dostarczyć aktywujące niebieskie światło do kilku zarodków jednocześnie.</li>
	<li>Ustaw panel LED względem szalek Petriego zawierających zarodki tak, aby rzeczywista moc światła odbieranego przez zarodki wynosiła około 1,5 mW/cm2, mierzona za pomocą miernika mocy i energii światła (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Pulsuj światłem w odstępach 1 h wł./1 h wyłącz za pomocą przekaźnika czasowego, jeśli świeci dłużej niż 3 godziny, aby zmniejszyć ryzyko fotouszkodzenia aktywatora transkrypcji TAEL5,8. 
	UWAGA: Dokładny czas świecenia może wymagać optymalizacji pod kątem określonych zastosowań. W niniejszym protokole podano przykłady czasu trwania oświetlenia wynoszącego 30 min, 1 h, 3 h i 6 h.</li>
	<li>Zdejmij pokrywki szalki Petriego, aby zminimalizować rozpraszanie światła w wyniku kondensacji.</li>
	<li>Umieścić szalki Petriego zawierające zarodki kontrolne w światłoszczelnym pudełku lub przykryć folią aluminiową do ciemnych kontroli.</li>
</ol>
3. Ilościowa ocena indukcji metodą qRT-PCR
<ol>
	<li>Usuń zarodki z oświetlenia po pożądanym czasie aktywacji.</li>
	<li>Wyodrębnij całkowite RNA z 30-50 aktywowanych światłem i 30-50 ciemnych zarodków za pomocą zestawu do izolacji RNA, postępując zgodnie z instrukcjami zestawu.
	<ol>
		<li>Przenieś zarodki do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i usuń nadmiar wody z jaj. Dodaj bufor do lizy i homogenizuj zarodki plastikowym tłuczkiem.</li>
		<li>Przenieś lizat do kolumny dostarczonej przez zestaw i postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu. Natychmiast przejdź do kroku 3.3 lub przechowuj oczyszczony RNA w temperaturze od -20 °C do -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj 1 μg całkowitego RNA do syntezy cDNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA zgodnie z instrukcjami zestawu.
	<ol>
		<li>Weź cienkościenną probówkę PCR o pojemności 0,2 ml, dodaj 1 μg RNA do 4 μl 5 μl głównej mieszanki reakcji cDNA (zawierającej zoptymalizowany bufor, oligo-dT i losowe startery oraz dNTP), 1 μl 20 x roztworu odwrotnej transkryptazy i wodę wolną od nukleaz do całkowitej objętości 20 μl.</li>
		<li>Umieść probówkę w termocyklerze zaprogramowanym w następujący sposób: 22 °C przez 10 minut, 42 °C przez 30 minut, 85 °C przez 5 minut, a następnie trzymaj w temperaturze 4 °C. Natychmiast przejdź do kroku 3.4 lub przechowuj cDNA w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować reakcje qPCR zawierające mieszaninę główną zielonego enzymu SYBR, 5-krotnie rozcieńczony cDNA (etap 3.3) i 325 nM każdego startera dla GFP. 
	UWAGA: Startery używane w tym protokole w następujący sposób. GFP do przodu: 5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3'; Odwrócony GFP: 5'-GTCCTCCTTGAAGTCGATGC-3'; ef1a naprzód 5'-CACGGTGACACAACATGCTGGAG-3'; ef1a rewers: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCAT-3').</li>
	<li>Przeprowadzaj reakcje qPCR w maszynie do PCR w czasie rzeczywistym. 
	UWAGA: Program PCR: początkowa aktywacja w temperaturze 95 °C przez 10 minut, a następnie 40 cykli po 30 s w temperaturze 95 °C, 30 s w temperaturze 60 °C i 1 minuta w temperaturze 72 °C.</li>
	<li>Po zakończeniu PCR należy przeprowadzić analizę krzywej topnienia w celu określenia specyficzności reakcji. Dla każdej próbki należy wykonać trzy kontrpróby techniczne.</li>
	<li>Oblicz indukcję aktywowaną światłem jako zmianę krotności w stosunku do zarodków trzymanych w ciemności za pomocą metody 2-ΔΔCt11. Istotność statystyczną można określić za pomocą pakietu oprogramowania statystycznego.</li>
</ol>
4. Jakościowa ocena indukcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
<ol>
	<li>Usuń zarodki z oświetlenia po pożądanym czasie aktywacji.</li>
	<li>Unieruchomić zarodki do obrazowania w 3% metylocelulozie zawierającej 0,01% trikainy w szkiełkach wgłębieniowych.</li>
	<li>Uzyskuj obrazy fluorescencyjne i w jasnym polu za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego podłączonego do aparatu cyfrowego przy użyciu standardowych ustawień filtra GFP. Użyj identycznych ustawień akwizycji obrazu dla wszystkich próbek.</li>
	<li>Łącz obrazy jasnego pola i fluorescencji po akwizycji za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu.</li>
</ol>

<ol><li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li>
<li>Halloran, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+gene+expression+in+specific+cells+of+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish.</a> Development. 127 (9), Cambridge, England. 1953-1960 (2000).</li>
<li>Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+quiescent+and+proliferative+pancreatic+beta-cells+identified+by+HOTcre+mediated+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).</li>
<li>Tischer, D., Weiner, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cell+signalling+with+optogenetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Illuminating cell signalling with optogenetic tools.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).</li>
<li>Reade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAEL%3A+a+zebrafish-optimized+optogenetic+gene+expression+system+with+fine+spatial+and+temporal+control%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control.</a> Development. 144 (2), Cambridge, England. 345-355 (2017).</li>
<li>LaBelle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAEL+2.0%3A+An+improved+optogenetic+expression+system+for+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish.</a> Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).</li>
<li>Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+natural+and+artificial+DNA+substrates+for+light-activated+LOV-HTH+transcription+factor+EL222%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222.</a> Biochemistry. 51 (50), 10024-10034 (2012).</li>
<li>Motta-Mena, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196(2012).</li>
<li>Holder, N., Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+DNA%2C+RNA%2C+and+Protein+into+the+Fertilized+Zebrafish+Egg+for+Analysis+of+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Embryology%22%5BJournal%5D)">Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function.</a> Molecular Embryology. , 487-490 (1999).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).</li>
<li>Wang, X., Chen, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+gene+expression+by+a+light-switchable+transgene+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system.</a> Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).</li>
<li>Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+cell+ablation+in+zebrafish+using+optogenetic+transcriptional+control%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control.</a> Development. 147 (12), Cambridge, England. (2020).</li>
<li>Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+transcription+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of transcription in zebrafish.</a> PloS One. 7 (11), 50738(2012).</li>
<li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-switchable+gene+promoter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li>
<li>Krueger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+applications+of+optogenetics+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Principles and applications of optogenetics in developmental biology.</a> Development. 146 (20), Cambridge, England. (2019).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Protokół ten opisuje zastosowanie optogenetycznego systemu TAEL/C120 w celu uzyskania ekspresji genów indukowanej światłem niebieskim. System ten składa się z aktywatora transkrypcji, TAEL, który dimeryzuje po oświetleniu niebieskim światłem i aktywuje transkrypcję interesującego genu za elementem regulatorowym C120. Indukowaną ekspresję reportera GFP można wykryć już po 30 minutach ekspozycji na światło, co sugeruje, że podejście to ma stosunkowo szybką i responsywną kinetykę.
Na poziom induk...

Indukowane systemy ekspresji genów pomagają kontrolować ilość, czas i miejsce ekspresji genów. Jednak osiągnięcie dokładnej kontroli przestrzennej i czasowej w organizmach wielokomórkowych było wyzwaniem. Kontrolę czasową najczęściej osiąga się poprzez dodanie związków małocząsteczkowych1 lub aktywację promotorów szoku cieplnego2. Mimo to oba podejścia są podatne na problemy z czasem, siłą indukcji i niezamierzonymi reakcjami na stres. Kontrolę przestrzenną uzyskuje się głównie za pomocą specyficznych dla tkanek promotorów3, ale takie podejście wymaga odpowiedniego promotora lub elementu regulatorowego, które nie zawsze są dostępne i nie sprzyja indukcji na poziomie podtkankowym.
W przeciwieństwie do takich konwencjonalnych metod, aktywowane światłem optogenetyczne aktywatory transkrypcyjne mają potencjał do dokładniejszej przestrzennej i czasowej kontroli ekspresji genów4. System TAEL/C120 reagujący na niebieskie światło został opracowany i zoptymalizowany do stosowania w embrionach danio pręgowanego5,6. System ten opiera się na endogennym czynniku transkrypcyjnym aktywowanym światłem z bakterii E. litoralis7,8. System TAEL/C120 składa się z aktywatora transkrypcji o nazwie TAEL, który zawiera domenę transaktywacyjną Kal-TA4, domenę LOV (wykrywanie światła-tlenu-napięcia) reagującą na niebieskie światło oraz domenę wiążącą DNA helisa-skręt-helisa (HTH)5. Po oświetleniu domeny LOV ulegają zmianie konformacyjnej, która umożliwia dwóm cząsteczkom TAEL dimeryzację, wiązanie się z promotorem C120 reagującym na TAEL i inicjowanie transkrypcji dalszego genu będącego przedmiotem zainteresowania5,8. System TAEL/C120 charakteryzuje się szybką i solidną indukcją przy minimalnej toksyczności i może być aktywowany przez kilka różnych metod dostarczania światła. Ostatnio wprowadzono ulepszenia do systemu TAEL/C120 poprzez dodanie sygnału lokalizacji jądrowej do TAEL (TAEL-N) oraz sprzężenie elementu regulatorowego C120 z podstawowym promotorem cFos (C120F) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). Te modyfikacje poprawiły poziom indukcji ponad 15-krotnie6.
W tym protokole, prosty panel LED jest używany do aktywacji systemu TAEL/C120 i wywołania wszechobecnej ekspresji genu reporterowego, GFP. Indukcję ekspresji można monitorować jakościowo, obserwując intensywność fluorescencji lub ilościowo, mierząc poziomy transkryptów za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). Protokół ten zademonstruje system TAEL/C120 jako wszechstronne, łatwe w użyciu narzędzie, które umożliwia solidną regulację ekspresji genów in vivo.

<table><tbody><tr><td>Internetowe narzędzie do ilustracji naukowych BioRender</td><td></td><td></td><td>https://biorender.com/</td></tr> <tr><td>Kolorowa kamera cyfrowa CCD</td><td>Lumenara</td><td>755-107</td><td></td></tr><tr><td>Kompaktowa konsola miernika mocy i energii, cyfrowa 4-calowy wyświetlacz LCD</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>Filtr wzbudzenia, 545 nm</td><td>Olympus</td><td>ET545/25x</td><td></td></tr><tr><td>ilustrowany zestaw RNAspin Mini GE</td><td> Opieka zdrowotna</td><td>95017-491</td><td></td></tr><tr><td>Natychmiastowa sól morska oceaniczna</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>MARS AQUA Ściemnialne światło LED LED 165 W (niebiesko-białe)</td><td>Amazon</td><td>B017GWDF7E</td><td></td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7140</td><td></td></tr><tr><td>NEARPOW Programowalny cyfrowy wyłącznik czasowy</td><td>Amazon</td><td>B01G6O28NA</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa SYBR zielony szybki mix</td><td>Quantabio</td><td>101414-286</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazów Photoshop</td> Oprogramowanie <td>do</td> tworzenia wykresów i statystyk Adobe <td></td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qScript XLT cDNA SuperMix</td><td>Quantabio</td><td>10142-786</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3 System PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Applied Biosystems</td><td>A28137</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Trikaine (metanosulfonian etylu 3-aminobenzoesanu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 120 Fluorescencyjne źródło światła LED</td><td>Excelitas</td><td>010-00326R</td><td>Wycofane. Został on zastąpiony przez X-Cite mini+</td></tr></tbody></table>

indukowana światłem ekspresja gfp w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu optogenetycznego systemu tael/c120

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

Indukowane systemy ekspresji genów są nieocenionym narzędziem do badania procesów biologicznych. Optogenetyczne systemy ekspresji mogą zapewnić precyzyjną kontrolę nad czasem, lokalizacją i amplitudą ekspresji genów przy użyciu światła jako czynnika indukującego. W tym protokole zastosowano optogenetyczny system ekspresji w celu osiągnięcia indukowanej światłem ekspresji genów w zarodkach danio pręgowanego. System ten opiera się na zmodyfikowanym czynniku transkrypcyjnym o nazwie TAEL, opartym na naturalnie występującym, aktywowanym światłem czynniku transkrypcyjnym z bakterii E. litoralis. Po oświetleniu niebieskim światłem TAEL dimeryzuje, wiąże się z pokrewnym elementem regulatorowym zwanym C120 i aktywuje transkrypcję. W protokole tym wykorzystuje się transgeniczne zarodki danio pręgowanego, które wykazują ekspresję czynnika transkrypcyjnego TAEL pod kontrolą wszechobecnego promotora ubb. W tym samym czasie element regulatorowy C120 napędza ekspresję fluorescencyjnego genu reporterowego (GFP). Wykorzystując prosty panel LED do dostarczania aktywującego niebieskie światło, indukcja ekspresji GFP może być po raz pierwszy wykryta po 30 minutach oświetlenia i osiąga szczyt ponad 130-krotnej indukcji po 3 godzinach obróbki światłem. Indukcję ekspresji można ocenić za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) oraz mikroskopii fluorescencyjnej. Metoda ta jest wszechstronnym i łatwym w użyciu podejściem do optogenetycznej ekspresji genów.

W tej demonstracji wykorzystano linię reporterową GFP reagującą na C120 (Tg(C120F:GFP)ucm107)) skrzyżowano z linią transgeniczną wykazującą powszechną ekspresję TAEL-N z ubikwityna B (ubb) promotor (Tg(ubb:TAEL-N)ucm113)) w celu otrzymania embrionów podwójnie transgenicznych zawierających oba elementy. 24 h po zapłodnieniu embriony poddano działaniu aktywującego światła niebieskiego, emitowanego w impulsach z częstotliwością 1 h włączone/1 h wyłączone. Indukcję ek...

Optogenetyka to potężne narzędzie o szerokim zastosowaniu. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób osiągnąć indukowaną światłem ekspresję genów w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu reagującego na niebieskie światło systemu TAEL/C120.

Indukowana światłem ekspresja GFP w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu optogenetycznego systemu TAEL/C120

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ jest to metoda optogenetyczna lub aktywowana światłem do indukowania ekspresji genów w nienaruszonym organizmie. W naszym przypadku zarodek danio pręgowanego. Zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona światło, jako czynnik indukujący, co pozwala na bardzo precyzyjną, przestrzenną i czasową kontrolę indukcji.Protokół ten byłby przydatny w każdej sytuacji, w której przydatna byłaby indukowalna ekspresja genów. Obejmuje to takie rzeczy, jak śledzenie linii, testy wzmocnienia funkcji lub eksperymenty ratunkowe. Na początek ustaw panel LED względem szalek Petriego zawierających zarodki, aby dostarczyć 1,5 miliwata na centymetr kwadratowy mocy światła do kilku zarodków jednocześnie.Aby zmniejszyć ryzyko uszkodzenia fotograficznego aktywatora transkrypcji ogona, należy umieszczać światło w odstępach jednej godziny włączania i wyłączania za pomocą przekaźnika czasowego, jeśli świeci dłużej niż trzy godziny. Zdejmij pokrywki szalki Petriego, aby zminimalizować rozpraszanie światła w wyniku kondensacji. Umieścić szalki Petriego zawierające zarodki kontrolne i pudełko odporne na światło do ciemnych kontroli.Usuń zarodki z oświetlenia po pożądanym czasie aktywacji. Do ekstrakcji całkowitego RNA należy użyć zestawu do ekstrakcji RNA. Przenieś zarodki do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i usuń nadmiar wody jajecznej.Po dodaniu buforu do lizy homogenizuj zarodki za pomocą plastikowego tłuczka. Przenieś lizat do dołączonej kolumny i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta w celu oczyszczenia RNA. Oczyszczony RNA należy przechowywać w temperaturze od minus 20 do minus 80 stopni Celsjusza do czasu użycia lub natychmiast zsyntetyzować cDNA z jednego mikrograma, całkowitego RNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.Dodaj jeden mikrogram RNA do cienkościennej 0,2 mililitrowej probówki PCR, zawierającej cztery mikrolitry, pięciokrotnej mieszanki głównej reakcji cDNA, a następnie dodaj jeden mikrolitr 20-krotnego roztworu enzymu odwrotnej transkryptazy. Następnie uzupełnij końcową objętość 20 mikrolitrów wodą wolną od nukleaz. Umieść probówkę w zaprogramowanym termocyklerze w celu syntezy cDNA.Zsyntetyzowane cDNA należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu użycia lub natychmiastowego użycia do oceny ilościowej. Skonfiguruj ilościowe reakcje PCR zawierające główną mieszankę enzymów cyber green. Pięciokrotnie rozcieńczone startery cDNA i GFP o stężeniu 325 nanomolowym w trzech egzemplarzach i przeprowadzić reakcję w zaprogramowanej maszynie do PCR w czasie rzeczywistym.Po zakończeniu reakcji należy przeanalizować krzywą topnienia, aby określić specyficzność reakcji. Oblicz indukcję aktywowaną światłem jako zmianę fałdowania w stosunku do zarodków kontrolnych za pomocą metody podwójnej Delta CT. I użyj oprogramowania statystycznego, aby określić istotność.Po usunięciu zarodków z oświetlenia, unieruchomić zarodki do obrazowania w 3% metylocelulozie zawierającej 0,01% trikainy w szkiełkach wgłębieniowych. Rejestruj obrazy fluorescencyjne i w jasnym polu za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego podłączonego do aparatu cyfrowego przy użyciu standardowych ustawień filtra GFP. Łącz obrazy jasnego pola i fluorescencji po akwizycji za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu.Kwantyfikacja ekspresji GFP wykazała indukcję ekspresji już po 30 minutach od ekspozycji na światło niebieskie. Poziomy ekspresji GFP następnie rosły do sześciu godzin, po aktywacji równomiernie. Indukcję GFP oceniono również jakościowo, badając intensywność fluorescencji w tych samych punktach czasowych po aktywacji.Fluorescencję GFP powyżej poziomów tła zaobserwowano po raz pierwszy po trzech godzinach od aktywacji i stała się zauważalnie jaśniejsza po sześciu godzinach od aktywacji. Natomiast zarodki kontrolne we wszystkich punktach czasowych, trzymane w ciemności, nie wykazywały żadnej znaczącej fluorescencji GFP. Światło aktywujące musi znajdować się w niebieskim zakresie widma światła widzialnego.Zarówno światło w pomieszczeniu, jak i światło słoneczne zawierają trochę niebieskiego światła. Dlatego zadbaj o ochronę swoich negatywnych kontroli przed wszelkimi źródłami światła otoczenia. System TAEL C120 jest genetycznie kodowany i modułowy i może sterować ekspresją dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania.Tak więc, w połączeniu z innymi technikami, może być używany do udzielania odpowiedzi na szereg pytań biologicznych.

light-induced-gfp-expression-zebrafish-embryos-using-optogenetic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Mikroskopia wielofotonowa umożliwia sterowanie fotonami o niskiej energii przy głębokiej penetracji optycznej i zredukowanej fototoksyczności. Opisujemy zastosowanie tej technologii do znakowania żywych komórek w embrionach danio pręgowanego. Protokół ten można łatwo dostosować do fotoindukcji różnych cząsteczek reagujących na światło.

Fotoaktywacja oparta na dwufotonach w żywych zarodkach danio pręgowanego

Ten film opisuje techniki optogenetyczne poprzez aktywację genetycznie zmodyfikowanych neuronów somatosensorycznych i rejestrowanie wywołanych reakcji behawioralnych za pomocą szybkiej kamery wideo.

Optogenetyka danio pręgowanego: aktywacja genetycznie zmodyfikowanego neuronu somatosensorycznego w celu zbadania reakcji behawioralnych larw

W tym filmie demonstrujemy procedurę generowania stabilnej transgenicznej linii danio pręgowanej, konstytutywnie wyrażającej fluorescencyjne białko wskaźnika napięcia po jednoczesnym wstrzyknięciu systemu transpozonów Tol2 składającego się z mRNA transpozazy i konstruktu transpozonu Tol2 kodującego wskaźnik napięcia fluorescencyjnego.

Transgeneza danio pręgowanego za pośrednictwem transpozonu Tol2: procedura generowania transgenicznego danio pręgowanego po jednoczesnym wstrzyknięciu systemu Tol2 do zapłodnionych zarodków danio pręgowanego

Techniki optogenetyczne umożliwiły badanie wpływu określonych neuronów na zachowanie.  Opisujemy metodę u larw danio pręgowanego do aktywacji pojedynczych neuronów somatosensorycznych wyrażających wariant rodopsyny kanałowej (ChEF) za pomocą lasera na ciele stałym pompowanym diodą (DPSS) i rejestrowania wywołanych zachowań za pomocą szybkiej kamery wideo.

Optogenetyczna aktywacja neuronów somatosensorycznych danio pręgowanego za pomocą ChEF-tdTomato

Rozwój danio pręgowanego można obserwować przez wiele dni za pomocą mikroskopii z lekkim arkuszem, gdy zarodki są umieszczane w optycznie przezroczystych rurkach polimerowych z agarozą o niskim stężeniu.

Wielowarstwowe mocowanie do długotrwałej mikroskopii świetlnej danio pręgowanego

Badanie najwcześniejszych zdarzeń progresji komórek przednowotworowych i interakcji wrodzonych komórek odpornościowych jest kluczowe dla zrozumienia i leczenia raka. W tym miejscu opisujemy metodę warunkowego wywoływania przemian komórek nabłonkowych i późniejszego obrazowania na żywo interakcji wrodzonych komórek odpornościowych z komórkami skóry wyrażającymi HRASG12V u larw danio pręgowanego.

Obrazowanie na żywo interakcji między komórkami immunologicznymi i przednowotworowymi przy użyciu indukowalnego systemu ekspresji Gal4/UAS w skórze larw danio pręgowanego

Śledzenie na żywo poszczególnych komórek progenitorowych siatkówki WT w różnych tłach genetycznych pozwala na ocenę udziału nieautonomicznej sygnalizacji komórek podczas neurogenezy. W tym celu wykorzystano kombinację knockdownu genów, generowania chimer poprzez przeszczep zarodka i poklatkowego obrazowania konfokalnego in vivo.

In vivo (in vivo)Obrazowanie ekspresji genów transgenicznych w poszczególnych progenitorach siatkówki w chimerycznych zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania nieautonomicznych wpływów komórek

Opisujemy protokół indukowania przejścia fazowego białka wiążącego DNA 43 (TDP-43) TAR przez światło w neuronach ruchowych rdzenia, używając danio pręgowanego jako modelu.

Optogenetyczne przejście fazowe TDP-43 w rdzeniowych neuronach ruchowych larw danio pręgowanego

Ta praca opisuje protokół dla modułowego systemu transgenezy Tol2, metody klonowania opartej na bramie, służącej do tworzenia i wstrzykiwania transgenicznych konstruktów do embrionów zebranego.

System Danio pręgowanego Tol2: modułowe i elastyczne podejście do transgenezy oparte na bramce

Optogenetyczne manipulowanie szlakami sygnałowymi może być potężną strategią do zbadania, w jaki sposób sygnalizacja jest dekodowana w rozwoju, regeneracji, homeostazie i chorobie. Protokół ten zawiera praktyczne wskazówki dotyczące stosowania aktywatorów sygnalizacyjnych białka węzłowego i morfogennego kości (BMP) opartych na dziedzinie wykrywania światła i tlenu we wczesnym zarodku danio pręgowanego.

Aktywacja sygnalizacji optogenetycznej w zarodkach danio pręgowanego

Ten protokół wykorzystuje obrazowanie za pomocą arkusza świetlnego do badania funkcji skurczu serca u larw danio pręgowanego i uzyskania wglądu w mechanikę serca poprzez śledzenie komórek i interaktywną analizę.

Obrazowanie 4D Light-sheet skurczu serca danio pręgowanego

Poznaj metodę indukowanej światłem ekspresji genu w zarodkach Danio rerio przy użyciu systemu optogenetycznego TAEL/C120. Technika zapewnia precyzyjną kontrolę przestrzenną i czasową aktywacji genu.

Indukowana światłem ekspresja GFP w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu optogenetycznego systemu TAEL/C120

Przeglądaj więcej filmów