Analiza Open Source o wysokiej zawartości z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie sposobu wdrożenia obrazowania czasu życia fluorescencji z bramkowaniem czasowym (time gated fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM) w zautomatyzowanym procesie analizy wielodobiernych płytek, z wykorzystaniem oprogramowania o otwartym kodzie źródłowym oraz podstawowej aparatury. Metodologia ta może być zastosowana do odczytów opartych na FLIM w serii utrwalonych lub żywych komórek. Jest ona szczególnie użyteczna przy analizie przetwarzania sygnałów komórkowych lub oddziaływań białkowych.

Głównymi zaletami tej techniki są fakt, że FLIM zapewnia solidne odczyty ilościowe i pozwala na wyznaczenie frakcji populacji oddziałującej w jednym pomiarze. Zastosowanie technik analizy globalnej do tysięcy komórek w setkach pól widzenia pozwala nam wykorzystać odczyty transferu energii fluorescencji, czyli FRET, wykorzystując przy tym na przykład zmiany czasu życia rzędu około 20 ps.

Procedurę z udziałem Frederika Gorlitza zademonstrują Sunil Kumar, nasz asystent badawczy, oraz Ian Munro, nasz programista. Rozpocznij od uruchomienia programu MicroManager i otwórz wtyczkę openFLIM-HCA. W karcie sterowania FLIM wybierz kalibrację pliku opóźnienia (delay box calibration file), a następnie otwórz pliki kalibracyjne.

Wybierz plik kalibracyjny dla konkretnej kombinacji generatora opóźnienia i interesującej nas częstotliwości repetycji lasera. W menu plików wybierz opcję ustawienia folderu bazowego (set base folder) i wskaż folder, w którym będą zapisywane dane. Po potwierdzeniu ustawienia wszystkich odpowiednich parametrów, ręcznie ustaw szerokość bramki na 4 ns w panelu sterowania bramkowanym intensyfikatorem optycznym dla całego eksperymentu.

Aby uzyskać dane obrazu funkcji odpowiedzi instrumentu, należy ręcznie umieścić blokadę wiązki w kasecie kostki filtrującej przed obiektywem, aby zapobiec wydostaniu się światła laserowego, i ustawić blokadę wiązki pod kątem tak, aby zminimalizować jakiekolwiek odbicia do obudowy mikroskopu. W zakładce sterowania ścieżką światła należy ustawić filtry wzbudzenia, dichroiczny i emisyjny w jednostce z wirującym dyskiem w taki sposób, aby frakcja światła wzbudzenia rozproszonego przez wirujący dysk Nipkowa mogła być obrazowana bez nasycania systemu przez co najmniej 200 milisekund czasu integracji kamery. W zakładce sterowania FLIM należy użyć funkcji znajdowania punktu maksymalnego (find max point) w pełnym zakresie opóźnień obsługiwanych przez programowalny moduł szybkich opóźnień.

Następnie sprawdź wyświetlony przebieg sygnału. Ustaw czasy opóźnienia ścieżki tak, aby pełny profil funkcji odpowiedzi instrumentu mieścił się w zakresie skanowania modułu szybkiego opóźnienia. Dostosuj parametry gęstości neutralnej oraz czasu ekspozycji.

Oraz akumulacja klatek, aby kamera nie uległa nasyceniu w bramce czasowej jasności, a efektywny czas integracji nie był krótszy niż 200 milisekund. W menu sterowania FLIM wybierz pole szybkiego opóźnienia i ustaw kroki opóźnienia 25 picosekund w pełnym zakresie opóźnień. Następnie wybierz opcję wypełnij opóźnienia i kliknij przycisk snap FLIM image, aby pozyskać obraz funkcji odpowiedzi instrumentu.

Następnie należy poczekać do zakończenia akwizycji. W menu sterowania toru optycznego (light path control) należy wybrać filtr gęstości neutralnej (neutral density) i kliknąć „blocked”, aby zablokować laser. Otwórz menu sterowania FLIM i wybierz pole szybkiego opóźnienia (fast delay box), aby zmniejszyć liczbę kroków opóźnienia poprzez zwiększenie wartości w polu przyrostu (increment box).

Następnie kliknij „snap FLIM image”, aby zarejestrować obraz tła z kamery. Aby uzyskać dane referencyjne dla barwnika, przejdź do karty sterowania XYZ i w polu dialogowym „go to well” wprowadź studzienkę H4. Następnie przejdź do karty sterowania ścieżką światła i wybierz odpowiednie filtry wzbudzenia, dichroiczne i emisyjne do obrazowania fluorescencyjnego białka M turquoise, korzystając z funkcji „find max point” w pełnym zakresie pola „fast delay”.

Następnie ustaw odpowiednie parametry dla akwizycji danych z matrycy referencyjnej oraz odpowiadającego im obrazu tła, tak jak przed chwilą zaprezentowano. Aby uzyskać dane FLIM z próbki na płytce wielodołkowej, przejdź do menu konfiguracji sekwencyjnej akwizycji HCA. Wybierz kartę pozycji XYZ i określ, które dołki mają zostać obrazowane oraz liczbę pól widzenia do akwizycji w każdym dołku.

Wybierz reprezentatywne pole widzenia zawierające próbkę do obrazowania i ustaw optymalny filtr neutralnej gęstości w czasie integracji kamery, aby osiągnąć 75% zakresu dynamicznego kamery odczytującej. W karcie sterowania XYZ w oknie dialogowym autofokusa wybierz sterowanie powrotem ostrości i ręcznie ustaw ostrość mikroskopu na komórkach lub interesujących strukturach. Ustaw zakres wyszukiwania autofokusa na 2000 micrometers i naciśnij enter.

Następnie kliknij AF now, aby rozpocząć procedurę automatycznego ustawiania ostrości. W polu focus offset auto focus pojawi się wartość przesunięcia. Wpisz tę wartość w oknie AF offset i kliknij AF now dwukrotnie, aby powtórzyć procedurę automatycznego ustawiania ostrości.

Wartości offsetu powinny być teraz ustawione na zero, co wskazuje na prawidłowe działanie systemu automatycznego ostrzenia. Następnie, w karcie sterowania FLIM, należy wybrać funkcję autogatingu, aby zapewnić logarytmiczne próbkowanie punktów opóźnienia. Ustaw liczbę akumulowanych klatek (accumulate frames) na wartość, która zapewni pożądany całkowity czas akwizycji danych.

Następnie w oknie dialogowym akwizycji FLIM kliknij przycisk start HCA sequence, aby uruchomić akwizycję FLIM dla wielodobowej płytki i pobrać obraz tła z kamery, tak jak przed chwilą zaprezentowano. Poniżej przedstawiono reprezentacyjny test FRET metodą FLIM z wykorzystaniem modelowego systemu FRET ekspresowanego w ko-komórkach i płytce wielodobowej, wraz z przykładami automatycznie pozyskanych obrazów czasu życia fluorescencji dla typowych pól widzenia w każdej studzience. W tym eksperymencie studzienki kontrolne ujemne wykazywały najdłuższe czasy życia, natomiast czasy życia donora były najkrótsze dla konstruktów FRET z najkrótszymi łącznikami.

Ogólnie średni czas życia uśredniony dla wszystkich pól widzenia w każdej studzience różnił się w zależności od płytki wielodobowej. Uśrednienie profilu zaniku intensywności fluorescencji donora dla wszystkich obrazowanych komórek w studzience A1, wraz z dopasowaniem do modelu zaniku jednoexponentialnego oraz funkcji odpowiedzi instrumentu, pokazuje, że model dopasowania jest prawidłowy. Dalsza analiza średniego czasu życia fluorescencji dla każdej kolumny płytki wielodobowej, uzyskana z dopasowania jednoexponentialnego na poziomie pojedynczych pikseli, wykazuje, że czas życia maleje w konstruktach FRET o krótszych długościach łącznika, co symuluje eksperyment z różną wydajnością FRET.

W tym eksperymencie dane FLIM z testu FRET dotyczącego działania różnych inhibitorów na oligomeryzację białek dopasowano do modelu pojedynczego wykładniczego zaniku. Mapa płyty czasu życia fluorescencji przedstawia średni czas życia na każdą studzienkę, wyliczony jako średnia z ośmiu pól widzenia. Jeden mały zestaw, obrazujący cztery pola widzenia na studzienkę, pozwala na ukończenie testu FLIM w około dwie i pół godziny, wliczając czas potrzebny na pozyskanie funkcji odpowiedzi instrumentu, danych referencyjnych barwnika oraz przeprowadzenie analizy w programie FLIM fit.

Podczas przeprowadzania analizy FLIM ważne jest, aby pozyskać funkcję odpowiedzi instrumentu (IRF) oraz dane odniesienia dla barwnika wraz z obrazami tła, tak aby dysponować wszystkimi informacjami niezbędnymi do analizy danych FLIM. Korzystając z naszego oprogramowania open source, FLIM fit, możliwe jest również dopasowanie tych danych do bardziej złożonych modeli zaniku. Pozwala to na przykład na wyznaczenie frakcji populacji FRET.

Nasza technologia FLIM HCA pomaga badaczom z obszaru odkrywania leków w wykonywaniu solidnych pomiarów fret. W przyszłości mamy nadzieję, że technologia ta umożliwi pomiar stałych dysocjacji w testach opartych na komórkach. Mamy nadzieję, że niniejszy artykuł wideo oraz informacje zawarte w naszej Wiki pomogą innym badaczom w budowie własnej aparatury FLIM HCA oraz w jej zastosowaniu do fret i innych analiz.

Należy pamiętać, że praca z laserami może być niebezpieczna i podczas korzystania z takiej aparatury zawsze należy stosować środki ostrożności, takie jak osłanianie wszystkich wiązek laserowych.