Analiza Open Source o wysokiej zawartości z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Ogólnym celem tej procedury jest pokazanie, w jaki sposób zaimplementować mikroskopię obrazowania czasu życia fluorescencji z bramką czasową (FLIM) w zautomatyzowanym przepływie pracy na płytkach wielodołkowych przy użyciu oprogramowania open source i podstawowego oprzyrządowania. Metodologia ta może być stosowana do odczytów opartych na FLIM w serii stałych lub aktywnych komórek. Jest to szczególnie przydatne do odczytywania przetwarzania sygnałów komórkowych lub interakcji białek.

Głównymi zaletami tej techniki jest to, że FLIM zapewnia solidne odczyty ilościowe i może dostarczyć frakcję populacji interakcji w jednym pomiarze. Zastosowanie globalnych technik analizy do tysięcy komórek w setkach pól widzenia pozwala nam wykorzystać wspomagający transfer energii żywicy lub odczyty FRET. I wykorzystując na przykład zmiany czasu życia do około 20 pikosekund.

Procedurę zademonstrują wraz z Frederikiem Görlitzem Sunil Kumar, nasz współpracownik naukowy i Ian Munro, nasz programista. Zacznij od uruchomienia mikromenedżera i otwórz wtyczkę openFLIM-HCA. Na karcie Sterowanie FLIM wybierz plik kalibracji skrzynki opóźniającej i otwórz pliki kalibracyjne.

Wybierz plik kalibracyjny dla określonej kombinacji generatora opóźniającego i interesującej nas częstotliwości powtarzania lasera. W menu plik wybierz ustaw folder podstawowy i wybierz folder, w którym dane zostaną zapisane. Po potwierdzeniu, że wszystkie odpowiednie parametry zostały ustawione, ręcznie ustaw szerokość bramki na cztery nanosekundy w skrzynce kontrolnej bramkowanego wzmacniacza optycznego dla całego eksperymentu.

Aby uzyskać dane obrazu funkcji odpowiedzi instrumentu, należy ręcznie umieścić blok wiązki w kasecie sześcianu filtra przed obiektywem, aby zapobiec ucieczce światła laserowego i ustawić blok wiązki pod kątem, aby zminimalizować odbicie z powrotem w ramie mikroskopu. Na karcie kontroli ścieżki światła ustaw filtry wzbudzenia, dichroicznego i emisyjnego w jednostce wirującego dysku w taki sposób, aby część światła wzbudzenia rozproszonego od wirującego dysku Nipkowa mogła być obrazowana bez nasycania systemu przez co najmniej 200 milisekund czasu integracji kamery. Na karcie sterowania FLIM użyj funkcji znajdź punkt max w pełnym zakresie opóźnień objętych programowalną skrzynką szybkiego opóźnienia.

Następnie sprawdź wyświetlany ślad wyjściowy. I ustaw czasy opóźnienia kursu, tak aby pełny profil funkcji odpowiedzi instrumentu znajdował się w zakresie skanowania skrzynki szybkiego opóźnienia. Dostosuj parametry neutralnej gęstości i czasu ekspozycji.

A także akumulacja klatek, dzięki czemu kamera nie jest nasycona bramką czasową jasności, a efektywny czas integracji wynosi nie mniej niż 200 milisekund. W menu sterowania FLIM wybierz pole szybkiego opóźnienia i ustaw 25 pikosekundowych kroków opóźnienia w pełnym zakresie opóźnienia. Następnie wybierz opcję wypełnij opóźnienia i kliknij przycisk snap FLIM image, aby uzyskać obraz funkcji odpowiedzi instrumentu.

I poczekaj, aż przejęcie zostanie zakończone. W menu sterowania ścieżką światła wybierz gęstość neutralną i kliknij zablokowane, aby zablokować laser. Otwórz menu sterowania FLIM i wybierz pole szybkiego opóźnienia, aby zmniejszyć liczbę kroków opóźnienia poprzez zwiększenie wartości w polu przyrostu.

Następnie kliknij przyciągnij obraz FLIM, aby uzyskać obraz z kamery w tle. Aby uzyskać dane matrycy referencyjnej, przejdź do zakładki Sterowanie XYZ i wprowadź dołek H4 w oknie dialogowym przejdź do studni. Następnie należy przejść do zakładki kontrola ścieżki światła i wybrać odpowiednie filtry wzbudzenia, dichroicznego i emisyjnego do obrazowania białka fluorescencyjnego turkusowego M za pomocą funkcji znajdź punkt max w pełnym zakresie skrzynki szybkiego opóźnienia.

Następnie ustaw odpowiednie parametry do uzyskania danych matrycy referencyjnej i odpowiadającego im obrazu tła, jak pokazano poniżej. Aby uzyskać dane FLIM z próbki płytki wielodołkowej, przejdź do menu konfiguracji sekwencjonowanej akwizycji HCA. Wybierz zakładkę Pozycje XYZ i ustaw, które dołki mają być obrazowane oraz liczbę pól widzenia, które mają być pozyskiwane dla każdego odwiertu.

Wybierz reprezentatywne pole widzenia zawierające próbkę, która ma być zobrazowana i ustaw optymalny filtr o neutralnej gęstości w czasie integracji kamery, aby osiągnąć 75% zakresu dynamiki kamery odczytującej. Na karcie Kontrolka XYZ wybierz opcję powrotu kontroli ostrości w oknie dialogowym automatycznego ustawiania ostrości i ręcznie ustaw ostrość mikroskopu na interesujących komórkach lub strukturach. Ustaw zakres wyszukiwania autofokusa na 2000 mikrometrów i naciśnij enter.

Następnie kliknij AF teraz, aby rozpocząć procedurę automatycznego ustawiania ostrości. Wartość przesunięcia pojawi się w polu autofokusa z przesunięciem ostrości. Wprowadź tę wartość przesunięcia w oknie Przesunięcie AF i kliknij dwukrotnie przycisk AF teraz, aby powtórzyć procedurę automatycznego ustawiania ostrości.

Wartości przesunięcia powinny być teraz ustawione na zero, co wskazuje na prawidłowe działanie systemu automatycznego ustawiania ostrości. Następnie, w zakładce sterowania FLIM, wybierz funkcję automatycznego bramkowania, aby zapewnić logarytmiczne próbkowanie punktów opóźnienia. Ustaw akumulację ramek na wartość, która daje żądany łączny czas pozyskiwania danych.

Następnie w oknie dialogowym Akwizycja FLIM kliknij przycisk rozpocznij sekwencję HCA, aby uruchomić akwizycję płytki wielodołkowej FLIM i uzyskać obraz z kamery w tle, jak właśnie pokazano. Tutaj pokazano reprezentatywny test progów FLIM przy użyciu modelowego systemu progów wyrażonego w kokomórkach i płytce wielodołkowej, z przykładami automatycznie uzyskanych obrazów czasu życia fluorescencji typowych pól widzenia widocznych w każdym dołku. W tym eksperymencie studzienki kontroli ujemnej charakteryzowały się najdłuższymi czasami życia, a czasy życia dawców wykazywały najniższe konstrukcje progowe z najkrótszymi długościami łączników.

Ogólnie rzecz biorąc, średni czas życia uśredniony dla wszystkich pól widzenia w każdym studzience różnił się w zależności od płyt wielodołkowych. Uśrednienie profilu intensywności fluorescencji dawcy dla wszystkich komórek zobrazowanych w dołku A1 wraz z dopasowaniem do mono wykładniczego modelu rozpadu i funkcją odpowiedzi instrumentu ilustruje, że model dopasowania jest prawidłowy. Dalsza analiza średniego czasu życia fluorescencji dla każdej kolumny płytki wielodołkowej, uzyskana z wykładniczego dopasowania mono pod względem pikseli, pokazuje zmniejszenie żywotności konstrukcji progów przy krótszych długościach łączników, symulując eksperyment z różnymi wydajnościami progów.

W tym eksperymencie dane FLIM z testu fret działania różnych inhibitorów na oligomeryzację białek wyposażono w pojedynczy model rozpadu wykładniczego. Mapa czasu życia fluorescencji na płytce ilustruje średni czas życia na studzienkę uśredniony w ośmiu polach widzenia. Jeden mały zestaw, obrazowanie czterech pól widzenia na dołek, podczas gdy nasz test FLIM można wykonać w około dwie i pół godziny, wliczając w to czas na uzyskanie funkcji odpowiedzi instrumentu, danych matrycy referencyjnej i przeprowadzenie analizy w dopasowaniu FLIM.

Podczas wykonywania testu FLIM ważne jest, aby pamiętać o uzyskaniu funkcji odpowiedzi instrumentu i danych matrycy referencyjnej wraz z ich obrazami tła, aby uzyskać wszystkie informacje potrzebne do analizy danych FLIM. Korzystając z naszego oprogramowania opensource, FLIM fit, możliwe jest również dopasowanie tych danych do bardziej złożonych modeli rozpadu. Na przykład umożliwiając określenie frakcji populacji progów.

Nasza technologia FLIM HCA pomaga naukowcom zajmującym się odkrywaniem leków w dokonywaniu solidnych pomiarów progów. Mamy nadzieję, że w przyszłości technologia ta umożliwi pomiar stałych dysocjacji w testach komórkowych. Mamy nadzieję, że ten artykuł wideo, a także informacje zawarte w naszej Wiki, pomogą innym badaczom zbudować własne oprzyrządowanie FLIM HCA i zastosować je do progów i innych testów.

Nie zapominaj, że praca z laserami może być niebezpieczna i że podczas korzystania z takiego oprzyrządowania należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak zamknięcie wszystkich wiązek laserowych.