Name: System podwójnej ekspresji oparty na komplementacji GFP do oceny kontaktu komórka-komórka, w którym pośredniczą cytonemy w żywych krążkach imaginalnych skrzydeł Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-22T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Poznaj metodę komplementacji GFP do wizualizacji kontaktów komórka-komórka poprzez cytonemy w żywych krążkach imaginalnych skrzydeł Drosophila. Technika ta umożliwia badanie komunikacji między komórkami w tkankach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została wsparta grantem CIHR (PJT-162109) dla D.H. M.J. otrzymał stypendium doktoranckie od Fundacji Institut de Recherches Cliniques de Montréal oraz od Programu Biologii Molekularnej Uniwersytetu w Montrealu. Autorzy bardzo cenią sobie pomoc, jaką przyniosła im platforma IRCM Microscopy and Imaging (Mikroskopia i Obrazowanie).

Sterownik nubbin-GAL4 służy do ekspresji CD4-spGFP1-10 w szczególności w obszarze kieszeni skrzydłowej DP (rysunek 1A). Sterownik PerM-LexA21 służy do ekspresji CD4-spGFP11 w specyficznym dla PerM (rysunek 1A). Te dwa systemy ekspresji są od siebie niezależne, umożliwiając jednoczesną i specyficzną ekspresję różnych transgenów w DP i PerM (ryc. 1B, C).
Podstawowy schemat genetyczny polega na krzyżowaniu much w celu wytworzenia larw o genotypie nub-GAL4/UAS-CD4-spGFP1-10; PerM-LexA/LexAop-CD4-spGFP11. Jako kontrolę negatywną pomijamy transgen LexAop-CD4-spGFP11 . Inne transgeny (np. kodujące białka, dwuniciowy RNA) mogą być dowolnie wyrażane w warstwie DP (pod kontrolą sekwencji UAS ) lub w PerM (pod kontrolą operatora LexA).
Jest to protokół obrazowania na żywo, którego nie można przerwać. Przygotowanie materiału szacuje się na ~10 min. Sekcje nie powinny być wykonywane jednorazowo dłużej niż 20 minut przed obrazowaniem. Obrazowanie trwa ~30 min i nie powinno trwać dłużej niż ~1 h. W przypadku wielu warunków lub dużej liczby próbek, procedura musi być przeprowadzana w wielu rundach, aby zapewnić najlepsze wyniki.
1. Przygotowanie materiału
<ol>
	<li>Przed sekcją wyczyść pęsetę, 9-dołkową szklaną płytkę punktową (lub inny pojemnik odpowiedni do zbierania i czyszczenia larw) oraz pokrytą silikonem szalkę Petriego wielokrotnego użytku pokrytą silikonem używaną do sekcji z 70% etanolem.</li>
	<li>Przygotuj szkiełka mikroskopowe, wykonując płukanie 70% etanolem, a następnie przyklejając przekładkę obrazową do wysuszonego szkiełka. Wytnij nożyczkami poszczególne studzienki z 8-dołkowego paska i przetnij na pół (ryc. 2A). Usuń podkład ochronny z jednej strony każdej połówki i przyklej przekładki do suwaka, lekko rozstawione od siebie, aby stworzyć osłoniętą przestrzeń pośrodku, w której zostaną umieszczone dyski (Rysunek 2B). UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że upraszcza to montaż próbki, ponieważ dokładna objętość medium przenoszonego na szkiełko jest mniej krytyczna. Każdy niewielki nadmiar objętości po prostu wypłynie przez szczelinę po nakryciu. Ponieważ obrazujemy tylko przez stosunkowo krótki czas (zazwyczaj ~1 h), nie doświadczyliśmy żadnych problemów ze średnim suszeniem.</li>
	<li>Rozmrozić pożywkę do obrazowania na żywo (nieuzupełnioną pożywkę Schneider's Drosophila Medium przechowywaną w zamrożonych 10 ml porcji) i przechowywać w łatwo dostępnym pojemniku na lód.</li>
	<li>W probówce do mikrowirówek o pojemności 2 ml wymieszaj 1,5 ml pożywki z 20 μl 200 μg/ml Hoechst 33342 (stężenie końcowe 2,7 μg/ml). Trzymaj probówkę na lodzie. UWAGA: Ta specyficzna forma barwnika Hoechst jest stosowana, ponieważ jest wysoce przepuszczalna przez błonę. UWAGA: Podczas obchodzenia się z Hoechst 33342 należy używać rękawic. Narzędzia należy umyć po użyciu.</li>
</ol>
2. Rozwarstwienie tarczy skrzydła i przygotowanie ślizgu
<ol>
	<li>Po krzyżowaniu genetycznym i hodowli w temperaturze 25°C należy pobrać z probówki wędrujące larwy w trzecim stadium rozwojowym i umyć je w zimnym podłożu do obrazowania na żywo w 9-dołkowej szklanej płytce punktowej. UWAGA: Cytonemy są bardzo delikatne. W kolejnych krokach należy zachować ostrożność, aby manipulować tkankami wokół dysków, starając się unikać bezpośredniego kontaktu między dyskami a narzędziami preparacyjnymi. Przygotowujemy trzy lub cztery larwy na raz, ponieważ uszkodzenie kilku krążków jest nieuniknione, a może to stać się zauważalne dopiero na etapie obrazowania.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym przenieś larwy do kropli żywego podłoża obrazowego na pokrytej silikonem szalce Petriego i rozpocznij sekcję za pomocą dwóch kleszczy preparacyjnych. Aby to zrobić, najpierw przytrzymaj głowę i przednią część ciała stabilnie, ściskając larwy jedną parą kleszczy na około jednej trzeciej długości ciała (od przedniej). Używając drugiej pary kleszczy, uszczypnij ciało tuż za pierwszymi kleszczami. Następnie odciągnij tylną część larw, aby odizolować przednią "połowę".</li>
	<li>Odwróć przednią połowę, zabezpieczając ją jedną parą pęset po obu stronach odciętego końca i przepychając głowę drugą parą (jak odwrócenie skarpety na lewą stronę), aby odsłonić wewnętrzne struktury, w tym wyimaginowane krążki, tchawicę, gruczoły ślinowe, ciało tłuszczowe i jelita.</li>
	<li>Ostrożnie usuń gruczoły ślinowe, ciało tłuszczowe i jelita, uważając, aby nie naruszyć bocznych pni tchawicy, które powinny pokrywać i chronić krążki skrzydeł.</li>
	<li>Za pomocą kleszczyków ostrożnie przenieś oczyszczone przednie połówki z dołączonymi krążkami skrzydełkowymi do kropli czystego podłoża do obrazowania na żywo za pomocą Hoechst, umieszczonego między przekładkami na przygotowanym szkiełku (ryc. 2C). Odizoluj krążki skrzydeł od reszty tkanek, delikatnie tępo odcinając je od drobnych gałęzi tchawicy, które łączą się z dyskiem, używając jednego ostrza kleszczy preparacyjnych lub cienkiego drutu wolframowego przymocowanego do uchwytu igły preparującej. Resztę tuszy należy wyrzucić.</li>
	<li>Ustaw tarcze za pomocą jednego ostrza kleszczy preparacyjnych lub igły preparacyjnej z drutu wolframowego. Ze względu na ich spłaszczony kształt przypominający łzę, dyski skrzydeł będą opadać z DP lub PerM skierowanym do góry. W przypadku tego protokołu zorientuj wszystkie dyski stroną PerM do góry.</li>
	<li>Dostosuj objętość podłoża, aby całkowicie wypełnić studzienkę, do poziomu nieco powyżej poziomu przekładki obrazowania, dodając lub usuwając pożywkę w razie potrzeby. Usuń podkład ochronny z górnej strony każdej połówki przekładki obrazowania, a następnie ostrożnie opuść szkiełko nakrywkowe na próbkę. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe w miejscu, w którym styka się z przekładkami obrazowymi (np. zaokrąglonym końcem kleszczy preparacyjnych), aby upewnić się, że szkiełko nakrywkowe przylega do przekładki. UWAGA: Poziom medium powinien znajdować się nieco powyżej wysokości przekładki, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza, ale nie na tyle wysoko, aby generować znaczny przepływ, gdy szkiełko nakrywkowe jest opuszczone.</li>
</ol>
3. Obrazowanie
<ol>
	<li>Obrazowanie próbek w temperaturze pokojowej za pomocą mikroskopu konfokalnego (laser argonowo-jonowy o długości fali 488 nm dla GFP, laser UV o długości fali 350 nm dla Hoechst) wyposażony w soczewkę zanurzeniową olejową 40x/1,30 NA i oprogramowanie do mikroskopii. Uzyskuj stosy obrazów o rozmiarze kroku 1 μm, które rozciągają się od nieco powyżej najwyższego poziomu PerM (gdzie fluorescencja Hoechsta maleje) do podstawowej strony DP, co zwykle daje ponad 100 obrazów na stos. Pobieraj powtarzające się stosy obrazów, aby generować filmy poklatkowe. UWAGA: Obrazujemy slajd nie dłużej niż ~1-2 h.</li>
	<li>W przypadku ustawień oprogramowania mikroskopu należy rejestrować obrazy za pomocą kodowania 8-bitowego, uśredniania linii 2, wzmocnienia detektora zwykle od 650 do 750 oraz oddzielnych ścieżek kanałów, aby zmniejszyć wyciek sygnału. Używaj identycznych ustawień lasera i detektora dla wszystkich warunków, określonych z góry przez wcześniejsze wykonanie testów dla każdego stanu. UWAGA: Przy 40-krotnym powiększeniu nasze obrazy mają rozdzielczość 5,0386 pikseli na μm (rozmiar piksela: 0,1985 x 0,1985 μm2). W naszej konfiguracji optymalne ustawienia mikroskopu konfokalnego obejmowały najwyższą możliwą intensywność lasera (bez uszkadzania tkanki), aby uchwycić jak najwięcej sygnału, a jednocześnie zapewnić niewielkie lub zerowe nasycenie; oraz najniższy możliwy poziom hałasu oceniany na podstawie kontroli ujemnych, osiągnięty poprzez zmniejszenie przesunięcia detektora i prędkości akwizycji (w razie potrzeby). Zazwyczaj używamy mniej niż 5% mocy lasera i maksymalnej prędkości głowicy skanującej ("9" w ustawieniach oprogramowania Zen). Pozyskanie pojedynczego stosu obrazów zajmuje zwykle ~1 min 45 s, a zdjęcia są wykonywane co 2-3 minuty w celu analiz poklatkowych.</li>
</ol>
4. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Wyświetlaj stosy przy użyciu funkcji projekcji o maksymalnej intensywności w pakiecie oprogramowania ImageJ (kliknij na obraz | Stosy | Z wybierz z menu Maksymalna intensywność ).</li>
	<li>Na obrazach MIP określ obszar kieszeni skrzydła na podstawie wzoru składania tarczy skrzydła (przy użyciu kanału Hoechsta) przy użyciu wyboru wielokąta. Użyj tego samego wyboru na kanale GFP z funkcją Clear Outside ( kliknij Edytuj | Wyczyść na zewnątrz), aby ustawić wartość każdego piksela zewnętrznego na 0.</li>
	<li>Na obrazach MIP użyj kanału Hoechst, aby wyczyścić obrazy GFP, w szczególności usuwając wszelkie artefakty, które pojawiają się w obu kanałach, ustawiając odpowiednią wartość piksela na 0 (kliknij Wybór wielokąta, a następnie Edytuj | wyczyść).</li>
	<li>Na oczyszczonych obrazach MIP użyj funkcji Histogram (kliknij Analizuj | Histogram | Lista), aby uzyskać i skopiować listę wszystkich wartości pikseli do tabeli w arkuszu kalkulacyjnym.</li>
	<li>Ustalić wartość progową na podstawie analizy sygnału tła w kontrolach ujemnych (a następnie zweryfikować w innych próbkach; zob. dyskusję).</li>
	<li>Obliczyć procentowy udział powierzchni dodatniej według GFP, korzystając z następującego wzoru: %Powierzchnia dodatnia według GFP = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68411/68411eq01.jpg" style="margin: auto;"> × 100</li>
	<li>Znormalizuj dane na końcu, dzieląc każdą wartość przez średnią warunku odniesienia (który jest ustawiony na 1). UWAGA: Prawidłowy piksel = piksel o wartości ≥ 1, skutecznie ignorując usunięty piksel, którego wartość została ustawiona na 0. Wartości pikseli równe 0 nie występują naturalnie.</li>
	<li>Aby określić, gdzie w dyskach lokalizuje się odtworzony sygnał GFP, użyj reslices XZ stosów obrazów, aby spojrzeć na oś apikopodstawną nabłonka dysku. Wykonuj ponowne cięcie na Fidżi bez interpolacji i zwiększ wysokość obrazu na osi Z za pomocą funkcji Skala z interpolacją dwuliniową, aby poprawić widoczność.</li>
</ol>

<ol><li>Ng, J. K., Tamura, K., Buscher, D., Izpisua-Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+basis+of+pattern+formation+during+vertebrate+limb+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular basis of pattern formation during vertebrate limb development.</a> Curr Top Dev Biol. 41, 37-66 (1999).</li>
<li>Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytonemes+and+the+dispersion+of+morphogens%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytonemes and the dispersion of morphogens.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (6), 445-463 (2014).</li>
<li>Daly, C. A., Hall, E. T., Ogden, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+mechanisms+of+cytoneme-based+morphogen+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulatory mechanisms of cytoneme-based morphogen transport.</a> Cell Mol Life Sci. 79 (2), 119(2022).</li>
<li>Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytonemes%3A+cellular+processes+that+project+to+the+principal+signaling+center+in+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytonemes: cellular processes that project to the principal signaling center in Drosophila imaginal discs.</a> Cell. 97 (5), 599-607 (1999).</li>
<li>Hall, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme+delivery+of+Sonic+Hedgehog+from+ligand-producing+cells+requires+Myosin+10+and+a+Dispatched-BOC%2FCDON+co-receptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Cytoneme delivery of Sonic Hedgehog from ligand-producing cells requires Myosin 10 and a Dispatched-BOC/CDON co-receptor complex.</a> Elife. 10, e61432(2021).</li>
<li>Sanders, T. A., Llagostera, E., Barna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+filopodia+direct+long-range+transport+of+SHH+during+vertebrate+tissue+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specialized filopodia direct long-range transport of SHH during vertebrate tissue patterning.</a> Nature. 497 (7451), 628-632 (2013).</li>
<li>Stanganello, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia-based+Wnt+transport+during+vertebrate+tissue+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Filopodia-based Wnt transport during vertebrate tissue patterning.</a> Nat Commun. 6, 5846(2015).</li>
<li>Hall, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme+signaling+provides+essential+contributions+to+mammalian+tissue+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytoneme signaling provides essential contributions to mammalian tissue patterning.</a> Cell. 187 (2), 276-293.e23 (2024).</li>
<li>Zhang, C., Brunt, L., Ono, Y., Rogers, S., Scholpp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme-mediated+transport+of+active+Wnt5b-Ror2+complexes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cytoneme-mediated transport of active Wnt5b-Ror2 complexes in zebrafish.</a> Nature. 625 (7993), 126-133 (2024).</li>
<li>Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+signaling+at+cytoneme+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Glutamate signaling at cytoneme synapses.</a> Science. 363 (6430), 948-955 (2019).</li>
<li>Wood, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytonemes+with+complex+geometries+and+composition+extend+into+invaginations+of+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytonemes with complex geometries and composition extend into invaginations of target cells.</a> J Cell Biol. 220 (5), e202101116(2021).</li>
<li>Gonzalez-Mendez, L., Seijo-Barandiaran, I., Guerrero, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme-mediated+cell-cell+contacts+for+Hedgehog+reception%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Cytoneme-mediated cell-cell contacts for Hedgehog reception.</a> Elife. 6, e24045(2017).</li>
<li>Du, L., Sohr, A., Li, Y., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPI-anchored+FGF+directs+cytoneme-mediated+bidirectional+contacts+to+regulate+its+tissue-specific+dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">GPI-anchored FGF directs cytoneme-mediated bidirectional contacts to regulate its tissue-specific dispersion.</a> Nat Commun. 13 (1), 3482(2022).</li>
<li>Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme-mediated+contact-dependent+transport+of+the+Drosophila+decapentaplegic+signaling+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein.</a> Science. 343 (6173), 1244624(2014).</li>
<li>Feinberg, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+Reconstitution+Across+Synaptic+Partners+%28GRASP%29+defines+cell+contacts+and+synapses+in+living+nervous+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) defines cell contacts and synapses in living nervous systems.</a> Neuron. 57 (3), 353-363 (2008).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+coordination+of+the+dual+roles+of+the+Hedgehog+co-receptor+in+homophilic+adhesion+and+signal+reception%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Competitive coordination of the dual roles of the Hedgehog co-receptor in homophilic adhesion and signal reception.</a> Elife. 10, e65770(2021).</li>
<li>Patel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytonemes+coordinate+asymmetric+signaling+and+organization+in+the+Drosophila+muscle+progenitor+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cytonemes coordinate asymmetric signaling and organization in the Drosophila muscle progenitor niche.</a> Nat Commun. 13 (1), 1185(2022).</li>
<li>Chen, W., Huang, H., Hatori, R., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+basal+cytonemes+take+up+Hedgehog+in+the+Drosophila+wing+imaginal+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Essential basal cytonemes take up Hedgehog in the Drosophila wing imaginal disc.</a> Development. 144 (17), 3134-3144 (2017).</li>
<li>Huang, H., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoblast+cytonemes+mediate+Wg+signaling+from+the+wing+imaginal+disc+and+Delta-Notch+signaling+to+the+air+sac+primordium%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Myoblast cytonemes mediate Wg signaling from the wing imaginal disc and Delta-Notch signaling to the air sac primordium.</a> Elife. 4, e06114(2015).</li>
<li>Hatori, R., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+produced+by+the+Drosophila+wing+imaginal+disc+induces+distinct+responses+in+three+target+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog produced by the Drosophila wing imaginal disc induces distinct responses in three target tissues.</a> Development. 147 (22), dev195974(2020).</li>
<li>Rambaud, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slik+sculpts+the+plasma+membrane+into+cytonemes+to+control+cell-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Slik sculpts the plasma membrane into cytonemes to control cell-cell communication.</a> EMBO J. 44 (8), 2186-2210 (2025).</li>
<li>Gibson, M. C., Schubiger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripodial+cells+regulate+proliferation+and+patterning+of+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Peripodial cells regulate proliferation and patterning of Drosophila imaginal discs.</a> Cell. 103 (2), 343-350 (2000).</li>
<li>Gibson, M. C., Lehman, D. A., Schubiger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumenal+transmission+of+decapentaplegic+in+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Lumenal transmission of decapentaplegic in Drosophila imaginal discs.</a> Dev Cell. 3 (3), 451-460 (2002).</li>
<li>Pallavi, S. K., Shashidhara, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egfr%2FRas+pathway+mediates+interactions+between+peripodial+and+disc+proper+cells+in+Drosophila+wing+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Egfr/Ras pathway mediates interactions between peripodial and disc proper cells in Drosophila wing discs.</a> Development. 130 (20), 4931-4941 (2003).</li>
<li>Pallavi, S. K., Shashidhara, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+interactions+between+squamous+and+columnar+epithelia+of+the+Drosophila+wing+disc%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Signaling interactions between squamous and columnar epithelia of the Drosophila wing disc.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 15), 3363-3370 (2005).</li>
<li>Pedelacq, J. D., Cabantous, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+superfolder+and+split+fluorescent+protein+detection+systems+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Development and applications of superfolder and split fluorescent protein detection systems in biology.</a> Int J Mol Sci. 20 (14), 3479(2019).</li>
<li>Panneton, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+catalytic+and+non-catalytic+functions+of+the+Drosophila+Ste20+kinase+Slik+by+activation+segment+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of catalytic and non-catalytic functions of the Drosophila Ste20 kinase Slik by activation segment phosphorylation.</a> J Biol Chem. 290 (34), 20960-20971 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych sprzecznych interesów.

Cytonemy odgrywają ważną rolę w dystrybucji ligandów, kontrolując wzrost i organizację rozwijających się tkanek. Wymiana sygnału odbywa się tam, gdzie końcówki cytonemu nawiązują intymny kontakt błonowy ze swoimi celami. W tym protokole opisujemy prostą metodę analizy kontaktów za pośrednictwem cytonemu między warstwami nabłonka w tarczy skrzydła przy użyciu techniki GRASP.
Przedstawiona tutaj technika wymaga co najmniej czterech komponentów - sterownika GAL4, sterownika LexA i dwóch transgenó...

Rozwój tkanek embrionalnych jest kontrolowany przez komórki znajdujące się w "centrach organizacyjnych", które sygnalizują odległym komórkom w tkance, kontrolując ich decyzje o proliferacji (tj. wzroście i podziale) lub przyjmowaniu określonychlosów1. W tej nieautonomicznej sygnalizacji komórkowej pośredniczą ligandy wytwarzane przez organizujące się komórki centralne, które tworzą gradienty stężeń w tkankach i wywołują reakcje zależne od stężenia. W wielu przypadkach ligandy te są dostarczane lub odbierane przez długie filopodia sygnalizacyjne oparte na aktynie, zwane cytonemami, które łączą komórki wysyłające i odbierające sygnały w tkankach 2,3. Po raz pierwszy odkryte w dysku imaginalnym skrzydła Drosophila4, cytonemy zostały również zidentyfikowane u ssaków i innych kręgowców 5,6,7,8,9. Lepsze zrozumienie roli cytonemów w sygnalizacji nieautonomicznej komórki, na wczesnym etapie, ma kluczowe znaczenie dla rozszyfrowania, w jaki sposób komórki komunikują się, aby zorganizować się w tkanki i jak te linie komunikacyjne są modyfikowane w różnych stanach patologicznych, w tym w wadach rozwojowych i raku.
Cytonemy mogą rozciągać się od komórek źródłowych, aby dostarczyć ligandy do komórek docelowych lub od komórek docelowych, aby otrzymać ligandy w pobliżu ich źródeł 2,3. Cytonemy nawiązują bliskie kontakty ze swoimi celami, gdzie, jak się uważa, tworzą struktury podobne do synaps, w których może zachodzić transfer ligandów 3,10,11. Ten kontakt może wystąpić między końcówkami cytonemów źródłowych i docelowych lub między cytonemami a ciałami komórkowymi3. Chociaż nie zostało to dokładnie scharakteryzowane, adhezja komórek poprzez cząsteczki adhezyjne lub poprzez interakcje receptor-ligand jest w niektórych przypadkach potrzebna do prawidłowej aktywacji dalszych zdarzeń sygnalizacyjnych 12,13,14, co czyni ją ważnym aspektem biologii cytonemu.
W kilku badaniach zastosowano technikę "rekonstytucji GFP u partnerów synaptycznych" (GRASP) do analizy kontaktów z cytonemami. Metoda ta została opracowana w celu identyfikacji i mapowania partnerów synaptycznych w złożonych układach nerwowych15. Opiera się na ekspresji dwóch komplementarnych fragmentów rozszczepionego GFP (spGFP1-10 i spGFP11), z których każdy jest połączony z regionem zewnątrzkomórkowym domeny transbłonowej (np. CD4), w różnych populacjach komórek. Jeśli błony plazmatyczne komórek w tych dwóch populacjach wejdą w bezpośredni kontakt, spowoduje to zbliżenie się komplementarnych domen spGFP, co prowadzi do odtworzenia fluorescencji GFP. Podejście to zastosowano u Drosophila w celu zidentyfikowania istnienia kontaktów cytonemu między komórkami w krążku skrzydła oraz między dyskiem skrzydła a innymi ściśle przylegającymi tkankami 12,16,17,18,19,20,21.
W pracy opisano zastosowanie GRASP do charakterystyki kontaktów między dwiema morfologicznie odrębnymi warstwami nabłonkowymi dysku imaginalnego skrzydła Drosophila, dyskiem właściwym (DP) i błoną okołopodniową (PerM). Te warstwy nabłonkowe tworzą worek otaczający centralne światło, z pseudowarstwowymi kolumnowymi komórkami DP znajdującymi się po jednej stronie i płaskonabłonkowymi komórkami PerM po drugiej, obie z błonami wierzchołkowymi skierowanymi do wewnątrz w kierunku światła (ryc. 1A). Istnieją pewne dowody na sygnalizację przezlumenalną między dwiema warstwami 22,23,24,25, a ostatnio udokumentowaliśmy sygnalizację z DP w celu kontrolowania proliferacji komórek PerM, w której pośredniczą cytonemy wierzchołkowe w DP21. Protokół ten polega na wykorzystaniu systemów ekspresji transgenów GAL4 / UAS i LexA / LexAop do ekspresji komplementarnych fragmentów spGFP połączonych z CD4 na błonach komórek DP i PerM. Wykorzystuje odtworzoną fluorescencję GFP do odczytu kontaktu błonowego między dwiema populacjami komórek.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop sekcyjny Discovery V12</td><td>Zeiss</td><td></td><td>mikroskop preparacyjny</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #55, Wskazówki biologiczne</td><td>Narzędzia naukowe</td><td>11255-20</td><td>kleszcze preparacyjne</td></tr><tr><td>EP-Slik (slik20358)</td><td>BDSC (Biblioteka BDSC)</td><td>Panneton i wsp. 2015&nbsp;</td><td>szczep muchy do odciągania Slik</td></tr><tr><td>FIDŻI</td><td></td><td>Schindelin J. i in. (2012)&nbsp;</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp;</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>H3570&nbsp;</td><td>Obrazowanie na żywo barwienia jądrowego&nbsp;</td></tr><tr><td>LexAop-CD4-spGFP11&nbsp; </td><td>BDSC (Biblioteka BDSC)</td><td>93018</td><td>Szczep muchy</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny LSM 700&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td>mikroskop konfokalny</td></tr><tr><td>nub-GAL4</td><td>Centrum Hodowli Drosophila w Bloomington (BDSC)</td><td>86108</td><td>Szczep muchy</td></tr><tr><td>PerM-LexA</td><td></td><td>Rambaud, Joseph i wsp., 2025</td><td>Szczep muchy</td></tr><tr><td>PYREX 9-wgłębieniowa szklana płyta punktowaSprzedaj</td><td>Nauki przyrodnicze Corning</td><td>7220-85</td><td>do zbierania i mycia larw</td></tr><tr><td>Schneider's Drosophila Medium</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>21720024</td><td>Nośnik do obrazowania na żywo</td></tr><tr><td>Dystanse obrazowe SecureSeal, 8-dołkowe, grubość 0,12 mm&nbsp;</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>654008</td><td>Dystansowy</td></tr><tr><td>Zestaw elastomerów silikonowych SYLGARD 184</td><td>Sylgard powiedział:</td><td>3097358-1004</td><td>do wykonywania płyt sekcyjnych</td></tr><tr><td>UAS-CD4-spGFP1-10&nbsp; </td><td>BDSC (Biblioteka BDSC)</td><td>93017</td><td>Szczep muchy</td></tr><tr><td>Zen</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Oprogramowanie do akwizycji</td></tr></tbody></table>

system podwójnej ekspresji oparty na komplementacji gfp do oceny kontaktu komórka-komórka, w którym pośredniczą cytonemy w żywych krążkach imaginalnych skrzydeł drosophila

A GFP Complementation-based Dual-expression System for Assessing Cell-Cell Contact Mediated by Cytonemes in Live Drosophila Wing Imaginal Discs

Wzrost i wzorzec tkanki embrionalnej są w dużej mierze kontrolowane przez sygnały wymieniane lokalnie między populacjami komórek w samych tkankach. Cytonemy to rodzaj filopodiów sygnałowych zidentyfikowanych po raz pierwszy u Drosophila, które łączą się i pośredniczą w wymianie między komórkami wytwarzającymi i odbierającymi sygnał. W rozwijającym się krążku imaginalnym skrzydła Drosophila cytonemy biorą udział w wymianie sygnałów między różnymi populacjami komórek w nabłonku dysku właściwego (DP), który utworzy dorosłe skrzydło, a także między komórkami DP a komórkami w sąsiednich tkankach związanych z dyskiem. Cytonemy łączą synapsy z komórkami docelowymi, tworząc intymne kontakty błonowe.
W tym miejscu przedstawiamy protokół ilościowego określania kontaktu za pośrednictwem cytonemu między komórkami DP a komórkami sąsiedniego nabłonka błony okołopodalnej (PerM), który jest oddzielony od komórek DP światłem dysku, przy użyciu podejścia do rekonstytucji GFP w żywych dyskach skrzydeł. Korzystając z systemów GAL4-UAS i LexA-LexAop, komplementarne fragmenty rozszczepionego GFP (spGFP1-10, spGFP11), z których każdy jest połączony z domeną transbłonową CD4, ulegają ekspresji po obu stronach światła dysku. Obrazowanie odtworzonej fluorescencji GFP w preparatach żywych skrzydeł za pomocą mikroskopii konfokalnej jest następnie wykorzystywane do generowania stosów obrazów, z których można zlokalizować i określić ilościowo odtworzoną fluorescencję GFP. Za pomocą tego systemu możliwa jest jednoczesna ekspresja transgenów kodujących białka lub interferencje RNA w komórkach wytwarzających cytonemy lub docelowych, aby ocenić ich wpływ na kontakty komórkowe DP-PerM. System ten, łatwo adaptujący się do innych tkanek, umożliwia w ten sposób identyfikację czynników ważnych dla tworzenia lub funkcjonowania cytonemu.

Aby przetestować przydatność procedury GRASP do pomiaru kontaktów między komórkami DP i PerM, zbadaliśmy krążki skrzydeł o czterech różnych genotypach: krążki kontroli negatywnej typu dzikiego (genotyp: w1118), które będą wyświetlać tylko poziomy autofluorescencji tła w kanale GFP; krążki wykazujące ekspresję CD4-spGFP1-10 w warstwie DP, ale pozbawione transgenu CD4-spGFP11, które będą pokazywać poziom fluorescencji wytwarzanej przez sam GFP1-10 (który spodziewaliśmy się, że będzie nieistotny, poniewa...

Opisujemy protokół pomiaru kontaktów między komórkami w sąsiednich warstwach nabłonka w żywych dyskach imaginalnych skrzydeł Drosophila przy użyciu podejścia opartego na rekonstytucji GFP.

System podwójnej ekspresji oparty na komplementacji GFP do oceny kontaktu komórka-komórka, w którym pośredniczą cytonemy w żywych krążkach imaginalnych skrzydeł Drosophila

Embryonic tissue growth and patterning are largely controlled by signals exchanged locally between cell populations within the tissues themselves. ...

Dlatego nasze badania koncentrują się na zrozumieniu, w jaki sposób komórki w tkankach oddalone od siebie komunikują się ze sobą. Używamy dysku imaginalnego skrzydła Drosophila jako systemu modelowego, aby spróbować zrozumieć, jak powstaje cytydyna, jak funkcjonuje i jaką rolę odgrywa w lokalnym kontrolowaniu wzrostu tkanek. Badania sugerują, że czynniki wzrostu często przemieszczają się przez wyspecjalizowane projekcje komórkowe, takie jak filopodia sygnalizacyjne oparte na aktynie, zwane cytonemami, aby zostać dostarczone do komórek docelowych.Cytonemy to bardzo cienkie i delikatne struktury, które łatwo ulegają zakłóceniu za pomocą protokołu fiksacji. Aby je zaobserwować, należy użyć dedykowanych metod obrazowania na żywo z ekspresyjnym białkiem znakowanym fluorescencyjnie. To znacznie ogranicza narzędzia i podejścia, których możemy użyć do ich zbadania.Zidentyfikowaliśmy kinazę białkową o nazwie Slik, która bierze udział w biogenezie cytonemu. Ekspresja Slik w jednej warstwie zewnątrzoponowej w krążku imaginalnym skrzydła wyzwala tworzenie cytonemu, który przenika przez światło dysku i stymuluje proliferację komórek w sąsiedniej warstwie nabłonkowej. W przyszłości chcielibyśmy zidentyfikować białko działające za Slik w celu promowania tworzenia cytonemu, zidentyfikować ligand, który jest dostarczany przez ten cytonem w celu promowania perforacji oraz lepiej zrozumieć fizjologiczne znaczenie tego mechanizmu w kontrolowaniu wzrostu tkanki.Na początek wytnij nożyczkami poszczególne dołki z ośmiodołkowego paska, a następnie przetnij każdą studzienkę na pół. Usuń podkład ochronny z jednej strony każdej połówki i przyklej przekładki do szkiełka mikroskopu, lekko je od siebie rozsuwając, aby stworzyć osłoniętą centralną przestrzeń do umieszczenia dysku. Pobrać wędrujące larwy trzeciego stadium rozwojowego z probówki hodowlanej po krzyżowaniu genetycznym i inkubacji w temperaturze 25 stopni Celsjusza.Pod mikroskopem preparacyjnym przenieś larwy do kropli żywego podłoża obrazowego na pokrytej silikonem szalce Petriego. Używając dwóch kleszczy preparacyjnych, rozpocznij sekcję od uszczypnięcia larw w odległości około 1/3 długości ciała od przodu za pomocą jednej pary kleszczy, aby utrzymać je stabilnie. W przypadku drugiej pary ściśnij ciało tuż za pierwszym punktem i pociągnij, aby oddzielić tylną połowę, izolując przednią część.Odwróć przednią połowę, chwytając pęsetą po obu stronach odciętego końca i przepychając głowę za pomocą drugiej pary, obracając ją na lewą stronę. Odsłania to struktury wewnętrzne, takie jak dyski wyobrażeniowe, tchawica, gruczoły ślinowe, ciało tłuszczowe i jelita. Usuń gruczoły ślinowe, ciało tłuszczowe i jelita za pomocą kleszczy, uważając, aby nie naruszyć bocznych pni tchawicy pokrywających krążki skrzydeł.Za pomocą kleszczy przenieś oczyszczone przednie połówki z dołączonymi krążkami skrzydełkowymi do kropli czystego podłoża do obrazowania na żywo za pomocą haczyków umieszczonych między przekładkami szkiełkowymi. Aby odizolować krążki skrzydeł, delikatnie odetnij je od drobnych gałęzi tchawicy za pomocą jednego ostrza kleszczy preparacyjnych lub cienkiego drutu wolframowego zamontowanego na uchwycie igły preparującej. Wyrzuć pozostałą tuszę.Ustaw tarcze skrzydeł za pomocą ostrza kleszczy preparacyjnych lub igły wolframowej tak, aby strona błony okołopobiernej była skierowana do góry. Dostosuj objętość medium tak, aby nieznacznie przepełniało studnię powyżej poziomu przekładki. Usuń górny spód ochronny z przekładki obrazowania i delikatnie opuść szkiełko nakrywkowe na próbkę.Dociśnij szkiełko nakrywkowe w punktach styku przekładki za pomocą zaokrąglonego końca kleszczy, aby zapewnić prawidłowe przyleganie. Aby wyświetlić stosy obrazów w ImageJ, wybierz Obraz, następnie Stosy, a następnie Projekcja Z i wybierz z menu opcję Maksymalna intensywność. Na obrazach projekcji maksymalnej intensywności zidentyfikuj obszar torebki skrzydła na podstawie wzoru składania dysku skrzydła za pomocą kanału haków i narzędzia do zaznaczania wielokątów.Zastosuj to samo zaznaczenie do kanału GFP i wybierz Edytuj, a następnie Wyczyść na zewnątrz, aby wyeliminować szum poza wybranym regionem. Użyj kanału haków na obrazach projekcji o maksymalnej intensywności, aby zidentyfikować artefakty na obrazach GFP. Następnie zaznacz obszar za pomocą narzędzia do zaznaczania wielokątów.Kliknij Edytuj i wybierz Wyczyść. Na oczyszczonych obrazach projekcji o maksymalnej intensywności wybierz opcję Analizuj, a następnie histogram, a następnie wybierz opcję Lista, aby uzyskać wszystkie wartości pikseli. Skopiuj tę listę do tabeli arkusza kalkulacyjnego.Aby ustawić wartość progową, przeanalizuj sygnał tła w próbkach kontroli ujemnej i potwierdź tę wartość za pomocą innych przykładowych obrazów. Obliczyć procentową zawartość powierzchni dodatniej metodą GFP, dzieląc liczbę pikseli powyżej progu przez całkowitą liczbę prawidłowych pikseli i mnożąc wynik przez 100. Na koniec znormalizuj każdą obliczoną wartość po podzieleniu jej przez średnią warunku odniesienia, który jest ustawiony na jeden.W dyskach typu dzikiego pozbawionych obu podzielonych składników GFP, w pobliżu środka torebki skrzydłowej zaobserwowano tylko minimalną ziarnistą autofluorescencję GFP, a ten podstawowy sygnał wykorzystano do określenia progu fluorescencji. Dyski wyrażające tylko CD4 split GFP1-10 w warstwie właściwej dysku wykazywały poziomy fluorescencji nie do odróżnienia od typu dzikiego, potwierdzając niefluorescencyjną naturę samego GFP1-10. Jednoczesna ekspresja CD4 rozszczepionego GFP1-10 we właściwym dysku i CD4spGFP11 w błonie okołopodniowej doprowadziła do zauważalnego wzrostu dyskretnych, jasnych plamek GFP zlokalizowanych w świetle dysku, ze znacznie większym dodatnim obszarem fluorescencji powyżej progu niż w grupie kontrolnej.Ekspresja Slik we właściwym krążku spowodowała silny wzrost gęstości jąder błony okołopodialnej i dramatyczny wzrost intensywności sygnału GFP w całym obszarze torebki skrzydłowej, co sugeruje, że cytonemy indukowane przez Slik nawiązują zwiększony kontakt z komórkami błony okołopodniowej.

a-gfp-complementation-based-dual-expression-system-for-assessing-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszej pracy opisujemy protokół badania migracji komórek glejowych do rozwijającego się oka Drosophila za pomocą analizy mikroskopowej żywych tkanek z wykorzystaniem komórek glejowych znakowanych GFP.

Obrazowanie na żywo migracji komórek glejowych w tarczceImaginal oka Drosophila

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Kinetochor jest miejscem, w którym SAC inicjuje swój sygnał monitorujący segregację mitotyczną siostrzanych chromatyd. Opisano metodę wizualizacji rekrutacji i wymiany jednego z białek kinetochoru oraz jej koordynacji z ruchem chromosomów w embrionach Drosophila przy użyciu laserowego skanującego systemu konfokalnego Leica.

Badanie punktu kontrolnego mitozy poprzez obrazowanie dynamicznego zachowania białek kinetochorowych i ruchu chromosomów w żywych zarodkach syncytialnych Drosophila

Ten film demonstruje barwienie immunofluorescencyjne transgenicznego mózgu Drosophila do obrazowania pojedynczych komórek glejowych. Mózg wykazuje ekspresję białek ukierunkowanych na błonę, połączonych z różnymi kombinacjami epitopów antygenowych pod kontrolą specyficznego dla gleju systemu rekombinazy. Wyizolowane i utrwalone mózgi są barwione pierwszorzędowymi przeciwciałami specyficznymi dla epitopów antygenowych, a następnie przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem.

Barwienie immunofluorescencyjne mózgów Drosophila do obrazowania pojedynczych komórek glejowych

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Dorosłe struktury Drosophila wywodzą się z workowatych struktur zwanych dyskami imaginalnymi. Analiza tych dysków zapewnia wgląd w wiele procesów rozwojowych, w tym określanie tkanek, ustalanie granic przedziałów, proliferację komórek, specyfikację losu komórki i polaryzację komórek płaskich. Protokół ten służy do przygotowania dysków wyobrażeniowych do mikroskopii świetlnej/fluorescencyjnej.

Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne dysków wyobrażonych z Drosophila melanogaster

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Komórki mają różne morfologie i nawiązują różnorodne interakcje ze swoimi sąsiadami. Protokół ten opisuje, w jaki sposób ujawnić morfologię pojedynczych komórek i zbadać interakcję komórka-komórka przy użyciu dobrze znanego systemu ekspresji Gal4 / UAS.

Zastosowanie techniki MultiColor FlpOut do badania wysokorozdzielczych morfologii pojedynczych komórek i interakcji komórkowych gleju u Drosophila

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół do wykonywania na żywo obrazowania asymetrycznego podziału komórek macierzystych linii zarodkowej (GSC) w niszy jajnikowej Drosophila. Używamy linii transgenicznej, która wszechobecnie ulega ekspresji fuzji białka zielonej fluorescencji (GFP) białka spektrosomu Par-1.

Rozszerzone obrazowanie na żywo nisz komórek macierzystych linii zarodkowej Drosophila melanogaster

Iteracyjna hybrydyzacja in situ wspomagana ekspansją (EASI-FISH) to solidna technika, która łączy mikroskopię ekspansywną z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu wykrycia ekspresji wielu genów w grubej tkance. Protokół ten przedstawia ostatnie postępy w metodzie i jej adaptacji do znakowania nienaruszonego ośrodkowego układu nerwowego Drosophila.

Multipleksowe wykrywanie ekspresji genów w nienaruszonym mózgu Drosophila przy użyciu iteracyjnej fluorescencji in situ wspomaganej ekspansją

Artykuł opisuje efektywny protokół rozwarstwiania dysku wyobrażalnego i barwienia przeciwciał, który jest ekonomiczny pod względem odczynników i ułatwia obsługę dysków wyobrażających w małych ilościach.

Małoskalowe rozwarstwienie i barwienie przeciwciał na dyskach wyimaginowanych oczno-czułowych i skrzydłowych Drosophila melanogaster

Poznaj metodę komplementacji GFP do wizualizacji kontaktów komórka-komórka poprzez cytonemy w żywych krążkach imaginalnych skrzydeł Drosophila. Technika ta umożliwia badanie komunikacji między komórkami w tkankach.

System podwójnej ekspresji oparty na komplementacji GFP do oceny kontaktu komórka-komórka, w którym pośredniczą cytonemy w żywych krążkach imaginalnych skrzydeł Drosophila (Wideo) | JoVE Journal

System podwójnej ekspresji oparty na komplementacji GFP do oceny kontaktu komórka-komórka, w którym pośredniczą cytonemy w żywych krążkach imaginalnych skrzydeł Drosophila

Przeglądaj więcej filmów