Ekstrakcja DNA prątków za pomocą bicia kulek w niestandardowym buforze, a następnie przepływu pracy NGS

Nasze badania diagnostyczne koncentrują się na poprawie wykrywania lekooporności w gruźlicy w warunkach ograniczonych zasobów, z naciskiem na szybkość i pragmatyzm. W diagnostyce gruźlicy dostępne są bardziej kompleksowe testy genotypowe, a nawet szereg nowych szybkich testów fenotypowych, a także konsekwentne dążenia do przybliżenia tych testów do punktu opieki. Istnieje jednak wiele pragmatycznych barier, które nadal istnieją.

Wyzwania związane z zasobami, od odczynników, przez infrastrukturę, po logistykę, nadal stanowią poważne bariery. Ze względu na to, że wszystko wykracza poza techniczne zaawansowanie testu Cepheid Xpert, standaryzacja protokołów jest trudna w różnych warunkach. Tak więc ekstrakcja DNA MTB, jak opisano w tej pracy, jest tego doskonałym przykładem.

Istnieje pilna potrzeba rozszerzenia diagnostyki gruźlicy opartej na sekwencjonowaniu, ale wielu laboratoriom nadal brakuje niezawodnego sposobu ekstrakcji wysokiej jakości DNA. Naszym celem jest udostępnienie metody, która jest prosta, praktyczna i odpowiednia dla osób pracujących w miejscu opieki nad pacjentem, w których brakuje zasobów. Tutaj przedstawiamy prosty, tani protokół przeznaczony do użytku w warunkach ograniczonych zasobów.

Został zatwierdzony do zastosowań w NGS i jest kompatybilny z automatycznymi systemami obsługi cieczy. Na początek połącz roztwór chlorku sodu Bufor chlorowodorku Tris, Triton X 100 i EDTA, aby uzyskać bufor Triton. Wymieszaj mieszając i dodaj ultraczystą wodę, aby osiągnąć końcową objętość 100 mililitrów.

Filtr wysterylizuj bufor przed użyciem. Następnie przygotuj 100 mililitrów buforu Tris-EDTA o niskiej zawartości EDTA, łącząc jeden mililitr jednomolowego Tris-HCl i 20 mikrolitrów 0,5-molowego EDTA. Wymieszaj i napełnij ultraczystą wodą, aby osiągnąć końcową objętość 100 mililitrów.

Następnie przefiltruj bufor do sterylizacji. Aby przygotować probówki do lizy, użyj ostrza skalpela, aby ostrożnie odciąć spód 1,5-mililitrowej rurki z nakrętką tuż poniżej punktu przegięcia. Odetnij końcówkę końcówki pipety P1000 i wykonaj klin w kształcie litery V pod koniec.

Wciśnij odcięty spód rurki z nakrętką w końcówkę pipety w kształcie litery V, aby uformować miarkę. Napełnij sterylny pojemnik 0,1-milimetrowymi kulkami krzemianu cyrkonu. Za pomocą przygotowanej miarki przenieś około 200 miligramów kulek do 1,5-mililitrowych tubek z nakrętką.

W celu przygotowania hodowli komórek bakteryjnych przenieś pięć mililitrów kultury Mycobacterium tuberculosis do 15-mililitrowej stożkowej probówki wirówkowej. Wirować z maksymalną prędkością przez 10 minut. Teraz użyj 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby ostrożnie usunąć wszystko, z wyjątkiem około 500 mikrolitrów supernatantu, nie naruszając osadu.

Użyj pipety P1000, aby usunąć pozostały supernatant. Ponownie zawiesić osad w 350 mikrolitrach niestandardowego bufora trytonowego, a następnie dobrze wymieszać, pipetując w górę iw dół. Podgrzewać próbkę w suchej łaźni cieplnej przez 30 minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza.

Aby przygotować plwocinę, przenieś od jednego do pięciu mililitrów próbki plwociny do sterylnej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Aby przeprowadzić upłynnianie ditiotreitolu, dodaj cztery objętości 10-milimolowego ditiotreitolu do próbki plwociny, a następnie dokładnie wiruj przez 30 sekund. Odwirować próbkę z maksymalną prędkością przez 10 minut.

Następnie użyj 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby wyrzucić wszystkie oprócz 500 mikrolitrów supernatantu. Usunąć resztę supernatantu za pomocą pipety P1000, nie naruszając osadu. Ponownie zawiesić pelety w 350 mikrolitrach niestandardowego bufora trytonowego.

Aby przeprowadzić skraplanie wodorotlenku sodu NALC, należy dodać cztery objętości roztworu wodorotlenku sodu NALC do próbki plwociny. Mieszaj mieszaninę przez 30 sekund. Następnie inkubuj probówkę przez siedem minut w temperaturze pokojowej.

Teraz dodaj PBS do znaku 50 mililitrów. Zwiruj zawartość probówki, aby dobrze się wymieszała, a następnie odwiruj probówkę z maksymalną prędkością przez 10 minut. Po odwirowaniu za pomocą 50-mililitrowej pipety serologicznej wyrzucić supernatant, jak pokazano wcześniej.

Następnie ponownie zawieś granulat w 350 mikrolitrach niestandardowego bufora trytonowego. Najpierw przenieś 350 mikrolitrów inaktywowanej próbki do oznakowanej 1,5-mililitrowej rurki z nakrętką zawierającą 250 mikrolitrów 0,1-milimetrowych kulek krzemianu cyrkonu. Bead pokonywał lizat z prędkością 6,5 metra na sekundę przez 45 sekund z dwiema minutami przerwy między cyklami.

Odwirować próbkę z maksymalną prędkością przez dwie minuty, a następnie przenieść 150 mikrolitrów supernatantu do nowej, oznakowanej probówki. Następnie wyczyść wirowo kulki magnetyczne, które zostały zrównane w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby je ponownie zawiesić. Przenieś 180 mikrolitrów kulek magnetycznych do próbki DNA.

Pipetować w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać. Po dwuminutowej inkubacji w temperaturze pokojowej umieść probówkę na stojaku magnetycznym i odczekaj dwie minuty, aż roztwór się klaruje. Następnie użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby wyrzucić supernatant.

Trzymając rurkę nadal na stojaku magnetycznym, dodaj 500 mikrolitrów świeżo przygotowanego 70% etanolu wzdłuż przeciwległej ściany i odczekaj 30 sekund. Pod koniec ostatniego prania usuń resztki etanolu za pomocą pipety o pojemności 10 mikrolitrów i wysusz na powietrzu przez dwie minuty. Gdy tylko koraliki staną się nieprzezroczyste, wyjmij rurkę ze stojaka magnetycznego.

Zawiesić ponownie w 20 mikrolitrach buforu Tris o niskiej zawartości EDTA. Wymieszać przez pipetowanie lub wirowanie, aby upewnić się, że wszystkie kulki są w roztworze przed pięciominutową inkubacją w temperaturze pokojowej. Następnie umieść probówkę na stojaku magnetycznym na dwie minuty, aż będzie czysta.

Następnie przenieś mniej niż 20 mikrolitrów wymytego DNA do nowej znakowanej probówki, aby uniknąć przeniesienia kulek. Aby określić ilościowo DNA prątków za pomocą ilościowego PCR ukierunkowanego na 99 nukleotydów prątkowego atpE, należy złożyć główną mieszankę QPCR na lodzie. Dostosuj mieszankę wzorcową w zależności od ilości próbek i wzorców, w tym 10% nadwyżki w celu uwzględnienia strat związanych z pipetowaniem.

Uruchom termocykler w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 60 sekund, a następnie wykonaj 35 cykli w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 sekund i 60 stopni Celsjusza przez 30 sekund z szybkością narastania 2,11 stopnia Celsjusza na sekundę. Uruchom wszystkie próbki, wzorce i kontrole w trzech egzemplarzach. W tym przypadku hodowle prątków gruźlicy wykazały najwyższe stężenia DNA spośród wszystkich badanych schorzeń.

Próbki plwociny z kolcami wykazywały stopniowo niższą wydajność DNA i zwiększoną zmienność wraz ze zmniejszaniem się wkładu bakterii, szczególnie w grupie 10 000 bakterii.