Name: Inżynieria chromosomów bakteryjnych specyficznych dla miejsca: ΦC31 Wymiana kasetowa za pośrednictwem integrazy (IMCE) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Poznaj metodę integracji DNA do chromosomu bakteryjnego przy użyciu integrazy ΦC31 i sprzężenia. Technika IMCE umożliwia szybką i efektywną modyfikację genetyczną szczepów bakteryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Podziękowania dla Margaret C.M. Smith za uprzejme udostępnienie klonu integrazu 
 Wsparcie finansowe zapewnione przez: 
 Genome Canada/Genome Prairie 
 Granty NSERC Discovery oraz Strategic Project

1. Przygotowanie hodowli
<ol>
 <li>Przygotować sterylne pożywki płynne: TY10 (5 g/l tryptonu, 3 g/l ekstraktu drożdżowego, 0,44 g/l chlorku wapnia dehydratu) oraz LB11 (10 g/l tryptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego, 5 g/l chlorku sodu, pH 7).</li>
 <li>Zaszczepić z pojedynczej kolonii: SmUW227 (S. meliloti szczep LP: konstrukcja zostanie opisana w innym opracowaniu, szczegóły konstrukcji szczepu dostępne na żądanie) () do 5 ml pożywki TY z dodatkiem 50 μg/ml spectynomycyny. Zaszczepić następujące szczepy do 5 ml płynnej pożywki LB z dodatkiem odpowiedniego antybiotyku: E. coli DH5α12 zawierający pJC2, plazmid ekspresyjny integrazu, z 10 μg/ml tetracykliny; E. coli MT61613, mobilizator, z 10 μg/ml chloramfenikolu; oraz E. coli DH5α zawierający pJH110, plazmid kasety donora, z 5 μg/ml gentamycyny.</li>
 <li>Inkubować szczepy E. coli przez noc w temperaturze 37 °C przy stałym wstrząsaniu. Inkubować szczep S. meliloti w temperaturze 30 °C przez dwa dni z wstrząsaniem. Możliwe jest uzyskanie kultury S. meliloti przez noc przy zastosowaniu większego inokulum (podpłytowanie 1:500 z kultury nasyconej).</li>
</ol>
2. Przygotowanie i mieszanie hodowli
<ol>
 <li>Przemyć 1,5 ml kultury dla każdego szczepu, zbierając osad komórkowy poprzez wirowanie przy 17,000 x g przez 30 sekund i resuspensując w 1 ml sterylnego 0,85% NaCl; powtórzyć raz.</li>
 <li>Resuspender osad w 100 μl sterylnego 0,85% NaCl.</li>
 <li>Nanieść punktowo 10 μl przemytej kultury każdego szczepu na zwykłą płytkę z agarem TY. Plamki te stanowią kontrolę.</li>
 <li>Przenieść do sterylnej probówki po 40 μl każdego szczepu z wyłączeniem E. coli DH5α12 zawierającego pJC2, wymieszać i nanieść punktowo 120 μl tej mieszaniny na zwykłą płytkę z agarem TY. Plamka ta stanowi ujemną kontrolę braku integrazji.</li>
 <li>Przenieść do sterylnej probówki po 40 μl każdego szczepu, wymieszać i nanieść punktowo 160 μl tej mieszaniny na zwykłą płytkę z agarem TY. Plamka ta stanowi miejsce kojenia IMCE.</li>
 <li>Pozostawić plamki do wyschnięcia w komorze z laminarnym przepływem powietrza.</li>
 <li>Zapieczętować płytki i inkubować w temperaturze 30 °C przez noc.</li>
</ol>
3. Izolacja trans-integrantów
<ol>
 <li>
 Wymaż plamki kontrolne oraz plamkę IMCE na płytkach z agarem TY uzupełnionym o 200 μg/ml streptomycyny (SmUW227 opiera się na szczepie Rm1021, który posiada mutację zapewniającą wysoką odporność na streptomycynę14) i 30 μg/ml gentamycyny.</li>
 <li>W celu obliczenia wydajności IMCE, resuspenduj około ¼ plamki po kojeniu IMCE w 500 μl sterylnego 0,85% NaCl. Wykonaj dziesięciokrotne rozcieńczenia szeregowe do 10-7. Wysiej rozcieńczenia od 10-2 do 10-5 na płytkach z agarem TY uzupełnionym o 200 μg/ml streptomycyny i 30 μg/ml gentamycyny, aby wyselekcjonować trans-integranty. Wysiej rozcieńczenia od 10-3 do 10-7 na płytkach z agarem TY uzupełnionym o 200 μg/ml streptomycyny, aby wyselekcjonować zarówno trans-integranty, jak i potencjalnych biorców, tj. całkowitą liczbę biorców.</li>
 <li>W celu izolacji trans-integrantów bez markerów resuspenduj około jednej czwartej plamki po kojeniu IMCE w 500 μl sterylnego 0,85% NaCl. Wykonaj dziesięciokrotne rozcieńczenia szeregowe do 10-6. Wysiej rozcieńczenia od 10-4 do 10-6 na czterech płytkach z agarem TY uzupełnionym o 200 μg/ml streptomycyny i 200 μg/ml X-gluc.</li>
 <li>Inkubuj płytki w temperaturze 30 °C przez 3 dni.</li>
 <li>Obejrzyj trans-integranty RFP pod światłem zielonym (525 nm) i przez filtr czerwony (&gt;610 nm) 15.</li>
 <li>Oblicz procent wydajności IMCE jako stosunek CFU trans-integrantów do CFU całkowitej liczby biorców. Około połowa trans-integrantów przeszła prawdziwą wymianę kasety, co czyni je białymi i wrażliwymi na spectynomycynę.</li>
 <li>Aby zidentyfikować trans-integranty bez markerów (gdzie wektor donora nie zawiera Gmr, jak w pJH110), wyszukaj białe kolonie (wydłużony okres inkubacji, dodatkowe 1-2 dni w temperaturze pokojowej, wzmocni różnicowanie kolonii za pomocą X-gluc, co jest niezbędne w przypadku S. meliloti SmUW227); potwierdź wrażliwość kolonii na spectynomycynę, przesiewając ją na płytce z agarem TY bez antybiotyków oraz na płytce z agarem TY zawierającej 100 μg/ml spectynomycyny.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Po trzech dniach inkubacji na podłożu TY uzupełnionym o streptomycynę i gentamycynę, smugi kontrolne nie powinny wykazywać wzrostu. Smuga IMCE powinna wykazywać wzrost zlewający się w miejscu pierwszego posiewu i liczne kolonie w drugim posiewie, jak pokazano na Rysunku 2. Efektywność transintegracji, wyrażona jako procent transintegrantów w stosunku do całkowitej liczby biorców, powinna mieścić się w zakresie 0,5%. Około połowa transintegrantów będzie wrażliwa na spektynomycynę i biała, co wskazuje na zajście rzeczywistej wymiany kasety. Transintegranty zawierające testową kasetę donora rfp z pJH110 powinny wykazywać wyraźną fluorescencję RFP podczas obserwacji w świetle zielonym (525 nm) i przez filtr czerwony (&gt;610 nm) 15.
<img src="/files/ftp_upload/3698/3698fig1.jpg" alt="Schemat procesu transferu genetycznego; metoda donacji plazmidu z pJH110 i pJC2; integracja chromosomalna." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Ilustracja mieszaniny koniugacyjnej: Dzięki ekspresji genów transferu z pRK600 wszystkie plazmidy są przenoszone losowo z komórki do komórki. Transfer ten prowadzi do powstania trans-integrantów w mieszaninie poprzez nabycie przez szczep LP dwóch plazmidów wymaganych do IMCE: plazmidu pomocniczego integrazą (int) pJC2 oraz plazmidu donora pJH110. Kaseta donora z niereplikującego się plazmidu donora (pJH110) zostaje wymieniona poprzez aktywność integrazą ΦC31 z markerami kasety LP na chromosomie, co skutkuje utratą markerów LP (Spr i uidA) oraz zachowaniem kasety donora (rfp i Gmr) w powstałym trans-integrancie.
<img src="/files/ftp_upload/3698/3698fig2.jpg" alt="Eksperyment wzrostu bakterii na szalce Petri; segmentacja kolonii, badanie oporności na antybiotyki." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. A: Płytka z punktami krzyżowania na nie wybiórczej pożywce TY, przedstawiająca wysuszone mieszaniny komórek na powierzchni agaru. B: Punkty krzyżowania wymazane na płytce z streptomycyną, gentamycyną i X-gluk, od górnego lewego rogu zgodnie z ruchem wskazówek zegara: kontrola bez integrazą, IMCE w S. meliloti, kontrola E. coli DH5α zawierająca pJC2, kontrola E. coli DH5a zawierająca pJH110, kontrola E. coli MT616 oraz kontrola S. meliloti UW227. C: Rozcieńczenie 10-2 resuspensji punktu krzyżowania na agarze TY ze streptomycyną i X-gluk. D: Rozcieńczenie 10-2 resuspensji punktu krzyżowania na agarze TY ze streptomycyną, gentamycyną i X-gluk (niebieskie kolonie to pojedyncze rekombinanty, białe kolonie przeszły prawidłową wymianę kasety). E: Rozcieńczenie 10-2 resuspensji punktu krzyżowania na agarze TY ze streptomycyną i X-gluk, wykazujące brak fluorescencji. F: Rozcieńczenie 10-2 resuspensji punktu krzyżowania na agarze TY ze streptomycyną, gentamycyną i X-gluk, wykazujące dwa poziomy fluorescencji (jaśniejsze kolonie odpowiadają koloniom niebieskim i mają wyższą ekspresję rfp, prawdopodobnie z powodu odczytu promotora z sekwencji wektora; kolonie, które przeszły prawidłową wymianę kasety, zawierają RFP z samym bezpośrednim promotorem, bez odczytu z promotora lac w wektorze, który jest nieobecny).

<ol><li>Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+two+genomes+in+one+cell%3A+Stable+cloning+of+the+Synechocystis+PCC6803+genome+in+the+Bacillus+subtilis+168+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).</li>
<li>Kushtoss, S., Rao, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Integration+Function+of+the+Streptomycete+Bacteriophage+FC31%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Integration Function of the Streptomycete Bacteriophage FC31.</a> J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991).</li>
<li>Brown, W. R., Lee, N. C., Xu, Z., Smith, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serine+recombinases+as+tools+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Serine recombinases as tools for genome engineering.</a> Methods. 53, 372-379 (2011).</li>
<li>Groth, A. C., Olivares, E. C., Thyagarajan, B., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phage+integrase+directs+efficient+site-specific+integration+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5995-6000 (2000).</li>
<li>Rowley, P. A., Smith, M. C., Younger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+motif+in+the+C-terminal+domain+of+FC31+integrase+controls+the+directionality+of+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Acid.+Res%22%5BJournal%5D)">A motif in the C-terminal domain of FC31 integrase controls the directionality of recombination.</a> Nuc. Acid. Res. 36, 3879-3891 (2008).</li>
<li>Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monomeric+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A monomeric red fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 7877-7882 (2002).</li>
<li>Schafer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+mobilizable+multi-purpose+cloning+vectors+derived+from+the+Escherichia+coli+plasmids+pK18+and+pK19%3A+selection+of+defined+deletions+in+the+chromosome+of+Corynebacterium+glutumicum%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum.</a> Gene. 145, 69-73 (1994).</li>
<li>Thorpe, H. M., Smith, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+site-specific+integration+of+bacteriophage+DNA+catalyzed+by+a+recombinase+of+the+resolvase%2Finvertase+family%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 5505-5510 (1998).</li>
<li>Jones, J. D., Gutterson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+mobilizable+cosmid+vector%2C+pRK7813%2C+and+its+use+in+a+rapid+method+for+marker+exchange+in+Pseudomonas+fluorescens+strain+HV37a%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An efficient mobilizable cosmid vector, pRK7813, and its use in a rapid method for marker exchange in Pseudomonas fluorescens strain HV37a.</a> Gene. 61, 299-306 (1987).</li>
<li>Beringer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R+Factor+transfer+in+Rhizobium+leguminosarum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">R Factor transfer in Rhizobium leguminosarum.</a> J. Gen. Microbiol. 84, 188-198 (1974).</li>
<li>Lennox, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+linked+genetic+characters+of+the+host+by+bacteriophage+P1%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1.</a> Virology. 1, 190-206 (1955).</li>
<li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983).</li>
<li>Charles, T. C., Finan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+map+of+Rhizobium+meliloti+megaplasmid+pRmeSU47b%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genetic map of Rhizobium meliloti megaplasmid pRmeSU47b.</a> J. Bacteriol. 172, 2469-2476 (1990).</li>
<li>Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exopolysaccharide-deficient+mutants+of+Rhizobium+meliloti+that+form+ineffective+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6231-6235 (1985).</li>
<li>Heil, J. R., Nordeste, R. F., Charles, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescence+theatre%3A+a+cost-effective+device+using+theatre+gels+for+fluorescent+protein+and+dye+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The fluorescence theatre: a cost-effective device using theatre gels for fluorescent protein and dye screening.</a> Can. J. Microbiol. 57, 339-342 (2011).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li>
<li>Lesic, B., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+lambda+Red+recombinase+system+to+rapidly+generate+mutants+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol.%22%5BJournal%5D)">Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa.</a> BMC Mol. Biol.. 9, 20-20 (2008).</li>
<li>Choi, K. -H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites%3A+example+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Protocols. 1, 153-161 (2006).</li>
<li>Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+insertion+and+replacement+in+Schizosaccharomyces+pombe+mediated+by+the+Streptomyces+bacteriophage+FC31+site-specific+recombination+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system.</a> Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).</li>
<li>Katzen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway+recombinational+cloning%3A+a+biological+operating+system%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Gateway recombinational cloning: a biological operating system.</a> Expert Opin. Drug Discovery. , 571-586 (2007).</li>
<li>Charles, T. C., Doty, S. L., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Agrobacterium+strains+by+electroporation+of+genomic+DNA+and+its+utility+in+analysis+of+chromosomal+virulence+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction of Agrobacterium strains by electroporation of genomic DNA and its utility in analysis of chromosomal virulence mutations.</a> Appl. Environ. Microbiol. 60, 4192-4194 (1994).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Technika IMCE umożliwia efektywną integrację pojedynczej kasety DNA flankowanej sekwencjami attB w locus LP wcześniej zmodyfikowanego szczepu. Po sklonowaniu pożądanego konstruktu w miejsce rfp w celu stworzenia kasety donora, technika ta nie wymaga późniejszego oczyszczania DNA i transformacji, co czyni ją bardzo niezawodną. Kluczowe jest uwzględnienie odpowiednich kontroli wzrostu, aby upewnić się, że oporność na antybiotyk wynika z powstania trans-integrantów, a nie z innych czynników.
<p class="...

<table><tbody><tr><td>Streptomycyna</td><td>BioShop Canada</td><td>STP101</td><td></td></tr><tr><td>Spektynomycyna</td><td>BioShop Canada</td><td>&lt;a href=&quot;https://ssl34.alentus.com/bioshopcanada/detail.asp?Pin=SPE201">SPE201&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>BioShop Canada</td><td>GTA202</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenikol</td><td>BioShop Canada</td><td>CLR201</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyklina</td><td>BioShop Canada</td><td>TET701</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>BioShop Canada</td><td>KAN201</td><td></td></tr><tr><td>Agar klasy bakteriologicznej</td><td>BioShop Canada</td><td>AGR001</td><td></td></tr><tr><td>Tryptona</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP402</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>BioShop Canada</td><td>YEX401</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>BioShop Canada</td><td>SOD001</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>BioShop Canada</td><td>CCL444</td><td></td></tr><tr><td>X-gluc</td><td>Gold Biotechnology</td><td>G1281C1</td><td></td></tr><tr><td>Szczep &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; MT616</td><td>Dostępny na zapytanie</td><td></td><td>Używany również poza naszym laboratorium</td></tr><tr><td>Szczep &lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;pJC2</td><td>Wewnętrzny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szczep &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; pJH110</td><td>Wewnętrzny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szczep SmUW227</td><td>Wewnętrzny</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

inżynieria bakteryjnego chromosomu w konkretnych miejscach: wymiana kasety zapośredniczona przez integrazę $\phi$c31 (imce)

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Chromosom bakteryjny może być wykorzystany do stabilnego utrzymywania obcego DNA w zakresie mega-baz1. Integracja z chromosomem pozwala uniknąć problemów takich jak replikacja plazmidów, stabilność plazmidów, niekompatybilność plazmidów oraz zmienność liczby kopii plazmidów. Metoda ta wykorzystuje integrazę specyficzną dla miejsca pochodzącą z faga (Φ) C312,3 bakterii Streptomyces. Integraza ΦC31 katalizuje bezpośrednią rekombinację pomiędzy dwoma specyficznymi miejscami w DNA: attB i attP (odpowiednio 34 i 39 bp)4. Rekombinacja ta jest stabilna i nieodwracalna5. Sekwencja „platformy lądowania” (LP), składająca się z genu oporności na spektynomycynę, aadA (SpR), oraz genu ß-glukuronidazy E. coli (uidA) flankowanego przez miejsca attP , została zintegrowana z chromosomami Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi oraz Agrobacterium tumefaciens odpowiednio w regionie międzygenowym, locus ampC oraz locus tetA . W niniejszym protokole wykorzystano S. meliloti . Skonstruowano również mobilizowane wektory donorowe zawierające miejsca attB flankujące gen wypełniający kodujący czerwone białko fluorescencyjne (rfp) oraz gen oporności na antybiotyk. W tym przykładzie zastosowano plazmid pJH110 oporny na gentamycynę. Gen rfp6 można zastąpić pożądaną konstrukcją przy użyciu enzymów SphI i PstI. Alternatywnie, syntetyczną konstrukcję flankowaną przez miejsca attB można subklonować do wektora mobilizowanego, takiego jak pK19mob7. Ekspresja genu integrazą ΦC31 (sklonowanego z pHS628) jest sterowana przez promotor lac na mobilizowanym plazmidzie o szerokim zakresie gospodarzy pRK78139.
Protokół kojenia tetraparentalnego jest wykorzystywany do przeniesienia kasety donora do szczepu LP, co pozwala na zastąpienie markerów w sekwencji LP kasetą donora. Powstałe komórki są trans-integrantami. Trans-integranty tworzą się z typową wydajnością na poziomie 0,5%. Trans-integranty są zazwyczaj znajdowane wśród pierwszych 500–1 000 kolonii przesiewanych pod kątem wrażliwości na antybiotyki lub w badaniu niebiesko-białym z użyciem kwasu 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-beta-D-glukuronowego (X-gluc). Niniejszy protokół zawiera procedury kojenia i selekcji służące do tworzenia oraz izolowania trans-integrantów.

Opisano szybką i wydajną metodę wprowadzania obcego DNA o określonym znaczeniu do wcześniej przygotowanych szczepów akceptorowych, nazywanych szczepami z platformą lądowania (landing pad strains). Metoda ta umożliwia specyficzną dla miejsca integrację kasety DNA w zaprojektowanym locus platformy lądowania danego szczepu, poprzez koniugację i ekspresję integrazu ΦC31.

Inżynieria bakteryjnego chromosomu w konkretnych miejscach: wymiana kasety zapośredniczona przez integrazę $\Phi$C31 (IMCE)

Chromosom bakteryjny może być wykorzystany do stabilnego utrzymania obcego DNA w zakresie mega-baz1. Integracja z chromosomem pozwala uniknąć takich problemów jak...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest integracja pożądanej konstrukcji DNA z chromosomem bakteryjnym w określonym locus. Jest to osiągane za pomocą protokołu kojarzenia z wykorzystaniem czterech zmodyfikowanych szczepów bakteryjnych. Szczep biorcy posiada sekwencję platformy lądowiskowej (landing pad), składającą się z genu oporności na specmycynę oraz genu beta-glukuronidazy e coli, flankowanych przez miejsca ATP zintegrowane z jego chromosomem.Szczep donora P JH one 10 zawiera plazmid posiadający miejsca B flankujące gen wypełniający kodujący czerwone białko fluorescencyjne oraz gen oporności na antybiotyk. Szczep donora PJC two zawiera plazmid posiadający specyficzną dla miejsca integrazę z bakteriofaga C 31 streptomyces pod kontrolą promotora LAC. Czwarty szczep MT 616 dostarcza genów transferu niezbędnych do konjugacji, co umożliwia przenoszenie plazmidów z komórki do komórki i prowadzi do powstania transgenów w szczepach biorcy.Pozyskanie dwóch plazmidów wymaganych do wymiany kasety pośredniczonej przez integrazę. Wymiana kasety donora z plazmidu PJ H one 10 na markery kasety lądowiska (landing pad) na chromosomie skutkuje utratą markerów lądowiska, SPR i UIDA, oraz zachowaniem kasety donora RFP i GMR w powstałym transmigrancie. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak rekombinacja homologiczna, jest prostota i wydajność protokołu.Jest ona również przenaszalna na szeroki zakres bakterii. Szczep akceptujący użyty w tym filmie to szczep S. milli latte. Na dwa dni przed procedurą kojarzenia w celu stworzenia trans-integronów, zaszczep z pojedynczej kolonii do 5 ml pożywki TY z dodatkiem spectmycyny. Inkubuj szczep S. milli w temperaturze 30 °C przez dwa dni przy ciągłym mieszaniu. W dniu poprzedzającym procedurę kojarzenia, zaszczep każdy z następujących szczepów E. coli do 5 ml płynnej pożywki LB uzupełnionej o odpowiedni antybiotyk: DH5α zawierający plazmid ekspresyjny integrazą do pożywki z tetracykliną, MT616 (mobilizator) do pożywki z chloramfenikolem oraz DH5α zawierający plazmid z kasetą donorową do pożywki z gentamycyną. Inkubuj trzy szczepy E. coli przez noc w temperaturze 37 °C przy stałym mieszaniu. Aby przygotować komórki do procedury kojarzenia, przenieś 1,5 ml każdej z czterech kultur do probówki i wiruj przy 17 000 ×g przez 30 s, aby zebrać osad komórkowy. Odlej pożywkę i resuspenduj każdy osad komórkowy w 1 ml sterylnego 0,85% NaCl. Ponownie wiruj probówki, a po odlaniu supernatantu resuspenduj każdy osad w 100 µL sterylnego 0,85% NaCl. Za pomocą pipety nanieś punktowo 10 µL przemytej kultury każdego szczepu na zwykłą płytkę z agarem TY.Te plamki są plamkami kontrolnymi. Następnie do sterylnej probówki należy dodać 40 µL każdego szczepu, z wyłączeniem e coli DH5α zawierającego Pjc2, i wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół; na zwykłą płytkę z agarem TY nanosi się 120 µL tej mieszaniny. Plamka ta stanowi negatywną kontrolę bez integrazą.Na koniec dodaj 40 µL każdego z czterech szczepów do sterylnej probówki, wymieszaj i nanieś 160 µL tej mieszaniny na tę samą płytkę z agarem TDY. Plamka ta stanowi miejsce krzyżowania z wykorzystaniem wymiany kasety pośredniczonej przez integrazę.Umieść płytkę w komorze z laminarnym przepływem powietrza i pozostaw plamki do wyschnięcia na około 20 minut. Uszczelnij płytkę i inkubuj w temperaturze 30 °C przez noc, następnego dnia po wykonaniu procedury kreskowania po kojeniu. Przenieś dwie plamki kontrolne oraz plamkę kojenia IMCE na płytki z agarem TY uzupełnionym o streptomycynę i gentamycynę.Szczep akceptor S milli posiada mutację zapewniającą wysoki poziom oporności na streptomycynę, co umożliwia obliczenie wydajności IMCE. Zawiesić około jednej czwartej plamki kojarzenia IMCE w 500 µl sterylnego 0,85% NaCl. Wykonać dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne do stężenia 10⁻⁷. Rozcieńczenia od 10⁻² do 10⁻⁵ wysiać na płytki z agarem TY uzupełnionym o streptomycynę, gentamycynę i xgl w celu selekcji transmigrantów. Rozcieńczenia od 10⁻³ do 10⁻⁷ wysiać na płytki z agarem TY uzupełnionym o streptomycynę i xgl w celu selekcji zarówno transmigrantów, jak i potencjalnych biorców. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez trzy dni.Obserwuj RFP trans pod zielonym światłem i przez czerwony filtr; oblicz procent wydajności IMCE jako stosunek CFU imigrantów trans do CFU wszystkich biorców. Około połowa trans przejdzie prawdziwą wymianę, co sprawi, że po trzech dniach inkubacji na podłożu Ty uzupełnionym o streptomycynę i gentamycynę będą one białe i niepodatne na antybiotyki. W następujących szczepach kontrolnych nie powinien wystąpić wzrost: kontrola bez integrazu s milli latte UW 2 27, kontrola e coli MT 616, kontrola e coli DH five alpha zawierająca P JH one 10 oraz kontrola e coli DH five alpha zawierająca PJC two. W przeciwieństwie do nich, posiew IMCE z miejsca kojenia powinien wykazać zlewający się wzrost na pierwszym pasie i liczne kolonie na drugim pasie. Dwa kolejne obrazy przedstawiają resuspensje rozcieńczenia 10⁻² miejsca kojenia na agarze TY streptomycyna xgl oraz na agarze TY streptomycyna gentamycyna xgl.Niebieskie kolonie to pojedyncze rekombinanty. Podczas gdy kolonie białe są trans-integrinami, które przeszły rzeczywistą wymianę kasety, w obserwacji w zielonym świetle i przez czerwony filtr zawiesina resuspensyjna z plamki kojarzenia w rozcieńczeniu 10⁻² na agarze TY strept cin xgl nie wykazuje fluorescencji. W przeciwieństwie do tego, rozcieńczenie 10⁻² zawiesiny resuspensyjnej z plamki kojarzenia na agarze Ty z streptomycyną, gentamycyną i xgl wykazuje dwa poziomy fluorescencji.Jaśniejsze kolonie odpowiadają koloniom niebieskim i wykazują wyższą ekspresję RFP, co prawdopodobnie wynika z odczytu przechodzącego (read-through) z promotora LAC w wektorze. Mniej jasne kolonie odpowiadają koloniom białym, w których doszło do właściwej wymiany kasety i które zawierają RFP jedynie z jego bezpośrednim promotorem, bez odczytu przechodzącego z promotora LAC. Kolonie te powinny być również wrażliwe na specycyminę.Wydajność integracji trans powinna mieścić się w zakresie 0,5%, wyrażona jako procent transmigrantów w stosunku do całkowitej liczby biorców. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć sposób wykorzystania konjugacji bakteryjnej z użyciem naszych zmodyfikowanych szczepów do wstawiania konstruktów DNA do chromosomu bakteryjnego.

site-specific-bacterial-chromosome-engineering-c31-integrase-mediated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Inżynieria chromosomu bakteryjnego specyficznego dla miejsca: ΦIntegraza C31 pośredniczona w wymianie kaset (IMCE)

W tym filmie demonstrujemy integrację transgenu w zarodku Anopheles za pośrednictwem phiC31 za pośrednictwem mikroiniekcji. Metoda ta pomaga wprowadzić pożądane geny do systemu gospodarza do zastosowań badawczych i przemysłowych.

phiC31-Integraza-Medi-Site-Directed Transgene Integration: Technika mikroiniekcji do specyficznej dla miejsca integracji transgenu z wektorem Anopheles

Ten protokół opisuje wykrywanie integronów klasy 1 i związanych z nimi kaset genowych w produktach spożywczych.

Badania przesiewowe środków spożywczych na obecność integronów klasy 1 i kaset genowych

Tutaj prezentujemy protokół do wyeliminowania interesującego genu zaangażowanego w koniugację plazmidu, a następnie analizujemy wpływ jego braku za pomocą testów kojarzenia. Funkcja genu jest dalej badana w określonym regionie jego sekwencji za pomocą mutacji delecyjnych lub punktowych.

Testy kojarzenia koniugacyjnego do specyficznej dla sekwencji analizy białek transferowych biorących udział w koniugacji bakteryjnej

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda tworzenia biblioteki wstawiania transpozonów o dużej gęstości w Escherichia coli lub Shigella flexneri przy użyciu koniugacji bakteryjnej. Protokół ten pozwala na stworzenie kolekcji setek tysięcy unikalnych mutantów w bakteriach poprzez losową insercję genomową transpozonu.

Stworzenie gęstej biblioteki insercji transpozonów za pomocą koniugacji bakteryjnej w szczepach enterobakteryjnych, takich jak Escherichia coli czy Shigella flexneri

Tutaj prezentujemy protokół użycia istniejących wcześniej konstruktów delecji kasety oporności na antybiotyki jako podstawy do tworzenia mutantów delecyjnych w innych szczepach E. coli. Takie mutacje delecji mogą być mobilizowane i wprowadzane do odpowiedniego locus szczepu biorcy za pomocą transdukcji bakteriofaga P1.

Wytwarzanie delecji genów w Escherichia coli przez transdukcję P1 z kasetami oporności na antybiotyki podlegającymi akcyzie

Opisana tutaj jest metoda celowanej, bezznacznikowej delecji genu w Chlamydia trachomatis przy użyciu mutagenezy wymiany alleli w kasecie floksowanej, FLAEM.

Bezmarkerowa delecja genu przez mutagenezę wymiany alleli w kasecie floksowanej w Chlamydia trachomatis

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowego, krok po kroku przewodnika do tworzenia konstruktów wielogenowych za pomocą modułowego systemu klonowania opartego na klonowaniu Golden Gate. Zawiera również zalecenia dotyczące krytycznych kroków, aby zapewnić optymalny montaż w oparciu o nasze doświadczenia.

Szybkie składanie konstruktów wielogenowych przy użyciu modułowego klonowania Golden Gate

Protokół opisuje, jak dokonać zmian w genomie komarów malarii Anopheles za pomocą systemu φC31. Opisane modyfikacje obejmują zarówno integrację, jak i wymianę transgenicznych kaset w genomie linii dokujących zawierających attP.

Ukierunkowana na miejsce integracja za pośrednictwem φC31 i wymiana kaset w wektorach Anopheles malarii

Opisujemy łatwą procedurę jednokopijnego uzupełniania chromosomalnego genu pompy wypływu za pomocą systemu ekspresji opartego na mini-Tn7 do zmodyfikowanego szczepu Acinetobacter baumannii, z niedoborem wypływu. To precyzyjne narzędzie genetyczne pozwala na kontrolowaną ekspresję genów, co ma kluczowe znaczenie dla scharakteryzowania pomp wypływowych w patogenach opornych na wiele leków.

Charakterystyka wielolekowych systemów wypływu u Acinetobacter baumannii przy użyciu szczepu bakteryjnego z niedoborem wypływu i systemu ekspresji genów z pojedynczą kopią

Opracowaliśmy zdecelularyzowaną macierz zewnątrzkomórkową płuca oraz nowatorski bioreaktor biomimetyczny, które mogą być wykorzystywane do generowania funkcjonalnej tkanki płucnej. Poprzez zasiewanie komórek do macierzy i ich hodowlę w bioreaktorze, otrzymujemy tkankę wykazującą efektywną wymianę gazową po krótkotrwałym przeszczepieniu in vivo.

Procedura inżynierii płuc

Poznaj metodę integracji DNA do chromosomu bakteryjnego przy użyciu integrazy ΦC31 i sprzężenia. Technika IMCE umożliwia szybką i efektywną modyfikację genetyczną szczepów bakteryjnych.

Inżynieria bakteryjnego chromosomu w konkretnych miejscach: wymiana kasety zapośredniczona przez integrazę $\Phi$C31 (IMCE)

Przeglądaj więcej filmów