Inżynieria chromosomów bakteryjnych specyficznych dla miejsca: ΦC31 Wymiana kasetowa za pośrednictwem integrazy (IMCE)

Opisana jest szybka i skuteczna metoda integracji obcego DNA z gotowymi szczepami akceptorowymi, zwanymi szczepami lądowiska. Metoda ta pozwala na specyficzną dla miejsca integrację kasety DNA z zaprojektowanym locus lądowiska danego szczepu, poprzez koniugację i ekspresję integrazy ΦC31.

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zintegrowanie pożądanego konstruktu DNA z chromosomem bakteryjnym w określonym wcześniej locus. Osiąga się to dzięki protokołowi krycia obejmującemu cztery zmodyfikowane szczepy bakterii. Szczep biorcy ma sekwencję lądowiska składającą się z genu oporności na mycynę i genu beta glukuronidazy E coli otoczonego miejscami ATP zintegrowanymi z jego chromosomem.

Szczep dawcy P JH 10 jest nosicielem plazmidu zawierającego w miejscach B gen białka czerwonej fluorescencji oraz gen oporności na antybiotyki. Szczep dwóch dawców PJC przenosi plazmid zawierający specyficzną dla miejsca integrazę z faga C 31 Streptomyces pod kontrolą promotora LAC. Czwarty szczep MT 616 zapewnia geny transferowe wymagane do koniugacji, transferu plazmidów z komórki do komórki, co powoduje tworzenie trans przez szczepy biorcy.

Akwizycja dwóch plazmidów wymaganych do wymiany kasetowej za pośrednictwem integrazy. Wymiana kasety dawcy z plazmidu PJ H one 10 na markery kasety lądowiska na chromosomie powoduje utratę znaczników lądowiska, SPR i UIDA oraz utrzymanie kasety dawcy RFP i GMR u powstałego transimigranta. Główną przewagą tej techniki nad innymi metodami, takimi jak rekombinacja homologiczna, jest łatwość i skuteczność protokołu.

Można go również przenosić na różne bakterie. Szczep akceptorowy użyty w tym filmie to szczep S milli latte na dwa dni przed procedurą krycia w celu wytworzenia integryn trans inokulowanych z pojedynczej kolonii do pięciu mililitrów pożywki TY z mycyną spect inkubować szczep S milli w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwa dni z wytrząsaniem w dniu poprzedzającym procedurę krycia, zaszczepić każdy z następujących szczepów E coli w pięciu mililitrach płynnego podłoża LB uzupełnionego z odpowiednim antybiotykiem DH pięć alfa zawierającym plazmid ekspresji integrazy do pożywki z tetracykliną MT 616, pośredni mobilizator z chloramfenikolem i DH pięć alfa zawierający plazmid kasety dawcy w pożywce z gentamycyną, inkubować trzy szczepy E Coli przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z ciągłym wytrząsaniem w celu przygotowania komórek do procedury krycia. Przenieś 1,5 mililitra każdej z czterech kultur do probówki i odwiruj w temperaturze 17 000 razy G przez 30 sekund, aby zebrać osad komórek, wyrzuć pożywkę i ponownie zawieś każdą osadkę komórkową w jednym mililitrze sterylnego 0,85% chlorku sodu ponownie odwiruj probówki po odrzuceniu supernatantu Resus zawiesić każdą osadkę w 100 mikrolitrach sterylnego 0,85% chlorku sodu za pomocą pipety indywidualnie narysować 10 mikrolitrów umytej kultury na każdy Odcedzić na zwykłej płytce agarowej TY.

Te miejsca są punktami kontrolnymi. Następnie dodać 40 mikrolitrów każdego szczepu, z wyłączeniem E coli DH pięć alfa zawierających Pjc dwa w sterylnej probówce i wymieszać przez pipetowanie w górę iw dół 120 mikrolitrów tej mieszaniny na zwykłej płytce agarowej TY. To miejsce to kontrola negatywna bez integrazy.

Na koniec dodaj 40 mikrolitrów każdego z czterech szczepów do sterylnej mieszanki probówek i umieść 160 mikrolitrów tej mieszaniny na tej samej płytce agarowej TDY. To miejsce jest miejscem łączenia wymiany kasetowej za pośrednictwem integrazy.

Umieść płytkę w okapie z przepływem laminarnym i pozostaw plamy do wyschnięcia na około 20 minut. Zamknij płytkę i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc następnego dnia po serii protokołu krycia. Dwa punkty kontrolne i punkt krycia IMCE na płytkach agarowych TY uzupełnione streptomycyną i gentamycyną.

Szczep akceptora S milli przenosi mutację nadającą wysoki poziom odporności na streptomycynę w celu obliczenia skuteczności IMCE Resus zawiesić około jednej czwartej miejsca krycia IMCE w 500 mikrolitrach sterylnego 0,85% Chlorek sodu wykonać dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia do 10 do ujemnej siódmej płytki Rozcieńczenia mają tendencję do ujemnych dwóch przez 10 do ujemnych pięciu na płytkach agarowych TY uzupełnionych streptomycyną, gentamycyna i XGL do wyboru dla imigrantów transpłciowych. Rozcieńczenia płytek mają tendencję do ujemnych trzech przez 10 do ujemnych siedmiu na płytkach agarowych TY, uzupełnionych streptomycyną i xgl w celu selekcji zarówno dla trans imigrantów, jak i potencjalnych biorców. IE łączna liczba biorców inkubuje płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez trzy dni.

Zobacz RFP trans w zielonym świetle i przez czerwony filtr oblicz procentową skuteczność IMCE jako CFU trans imigrantów w porównaniu z CFU wszystkich biorców, około połowa trans zostanie poddana prawdziwej wymianie, co czyni ich białymi i niewrażliwymi po trzech dniach inkubacji na Ty uzupełnionym streptomycyną i gentamicyną, nie powinno być wzrostu w następujących szczepach kontrolnych, brak kontroli integrazy s milli latte UW 2 27 kontrola e coli MT 616 kontrola e coli DH pięć alfa zawierających P JH jedna 10 kontrola i e coli DH pięć alfa zawierających PJC dwie kontrole. Natomiast smuga IMCE z miejsca krycia powinna mieć zlewający się wzrost na linii głowy i wiele rodzin na drugiej smugi. Te następne dwa obrazy pokazują zawiesiny resus od 10 do ujemnych dwóch rozcieńczeń miejsca godowego na agarze TY streptomycyna xgl i na agarze TY streptomycyna Gentamycyna xgl na agarze TY streptomycyna Gentamycyna xgl

Niebieskie kolonie są pojedynczymi rekombinantami. Podczas gdy białe kolonie są integrynami trans, które przeszły prawdziwą wymianę kasetową, gdy są oglądane w zielonym świetle i przez czerwony filtr, tendencja do ujemnego dwukrotnego rozcieńczenia zawiesiny resus miejsca kojarzenia na agarze TY strept cin xgl nie ma fluorescencji. Natomiast rozcieńczenie 10 do minus dwa zawiesiny resus miejsca godowego na agarze Ty streptomycyna Gentamycyna Xgl wykazuje dwa poziomy fluorescencji.

Jaśniejsze kolonie odpowiadają niebieskim koloniom i mają wyższą ekspresję RFP, prawdopodobnie ze względu na promowanie odczytu z promotora LAC w wektorze. Mniej jasne kolonie odpowiadają białym koloniom, które zostały poddane prawdziwej wymianie kasetowej i zawierają RFP tylko z jego bezpośrednim promotorem i bez odczytu z promotora LAC. Te tendencje imigrantów powinny być również wrażliwe na plamki mycyny.

Skuteczność integracji trans wyrażona jako odsetek transpłciowych imigrantów w stosunku do ogółu odbiorców powinna mieścić się w przedziale 0,5%Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać koniugacji bakteryjnej przy użyciu naszych zmodyfikowanych szczepów do wprowadzania konstruktów DNA do chromosomu bakteryjnego.