Inżynieria bakteryjnego chromosomu w konkretnych miejscach: wymiana kasety zapośredniczona przez integrazę $\Phi$C31 (IMCE)

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest integracja pożądanej konstrukcji DNA z chromosomem bakteryjnym w określonym locus. Jest to realizowane za pomocą protokołu kojenia z wykorzystaniem czterech zmodyfikowanych szczepów bakterii. Szczep biorcy posiada zintegrowaną z chromosomem sekwencję landing pad, składającą się z genu oporności na specycytynę oraz genu beta-glukuronidazy E. coli, flankowanych przez miejsca ATP.

Szczep donora P JH one 10 posiada plazmid zawierający miejsca attB flankujące gen wypełniający dla czerwonego białka fluorescencyjnego oraz gen oporności na antybiotyk. Szczep donora PJC two posiada plazmid zawierający integrazę swoistą dla miejsca pochodzącą z faga C 31 streptomyces, znajdującą się pod kontrolą promotora LAC. Czwarty szczep MT 616 dostarcza genów transferu niezbędnych do koniugacji – transferu plazmidów z komórki do komórki, co prowadzi do powstania transgenów w szczepach biorczych.

Pozyskanie dwóch plazmidów wymaganych do wymiany kasety za pośrednictwem integrazji. Wymiana kasety donora z plazmidu PJ H one 10 z markerami kasety landing pad na chromosomie prowadzi do utraty markerów landing pad, SPR i UIDA oraz zachowania RFP i GMR z kasety donora w powstałym transimmigrancie. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak rekombinacja homologiczna, jest prostota i wydajność protokołu.

Jest ona również przenaszalna na szeroką gamę bakterii. Szczep akceptora użyty w tym filmie to szczep S. millitate. Na dwa dni przed procedurą kojenia zaszczep pojedynczą kolonię do 5 mL pożywki TY z dodatkiem spectmycyny. Inkubuj szczep S. millitate w temperaturze 30 °C przez dwa dni w warunkach wytrząsania. Dzień przed procedurą kojenia zaszczep każdy z poniższych szczepów E. coli do 5 mL płynnej pożywki LB uzupełnionej o odpowiedni antybiotyk: DH5α zawierający plazmid ekspresyjny integrazą do pożywki z tetracykliną, MT616 (mobilizator) do pożywki z chloramfenikolem oraz DH5α zawierający plazmid z kasetą donora do pożywki z gentamycyną. Inkubuj trzy szczepy E. coli przez noc w temperaturze 37 °C przy stałym wytrząsaniu. Aby przygotować komórki do procedury kojenia, przenieś 1,5 mL każdej z czterech kultur do probówki i wiruj przy 17 000 ×g przez 30 sekund w celu zebrania osadu komórkowego. Odlej pożywkę i resuspenduj każdy osad komórkowy w 1 mL sterylnego 0,85% NaCl. Ponownie odwiruj probówki, a po odlaniu nadsączu resuspenduj każdy osad w 100 µL sterylnego 0,85% NaCl. Za pomocą pipety nanieś punktowo po 10 µL wypłukanej kultury każdego szczepu na zwykłą płytkę z agarem TY.

Plamki te są plamkami kontrolnymi. Następnie do sterylnej probówki należy dodać 40 µL każdego szczepu, z wyjątkiem e coli DH5α zawierającego Pjc2, i wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie nanieść 120 µL tej mieszaniny na zwykłą płytkę z agarem TY. Plamka ta stanowi ujemną kontrolę bez integrazu.

Na koniec, w sterylnej probówce wymieszaj po 40 µL każdego z czterech szczepów i nanieś 160 µL tej mieszaniny na tę samą płytkę z agarem TDY. Plamka ta stanowi miejsce krzyżowania z wymianą kasety pośredniczoną przez integrazę.

Umieść płytkę w komorze z laminarnym przepływem powietrza i pozostaw plamki do wyschnięcia na około 20 minut. Zamknij szczelnie płytkę i inkubuj w temperaturze 30 °C przez noc, dzień po wykonaniu posiewu w protokole kojarzenia. Przenieś dwie plamki kontrolne oraz plamkę kojarzenia IMCE na płytki z agarem TY uzupełnionym o streptomycynę i gentamycynę.

Szczep akceptor S milli posiada mutację zapewniającą wysoki poziom oporności na streptomycynę, co umożliwia obliczenie wydajności IMCE. Zawiesić około jednej czwartej plamki kojarzenia IMCE w 500 µL sterylnego 0,85% NaCl. Przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne aż do 10⁻⁷. Wysiać rozcieńczenia od 10⁻² do 10⁻⁵ na płytki z agarem TY uzupełnionym o streptomycynę, gentamycynę i xgl, aby wyselekcjonować transimigrantów. Wysiać rozcieńczenia od 10⁻³ do 10⁻⁷ na płytki z agarem TY uzupełnionym o streptomycynę i xgl, aby wyselekcjonować zarówno transimigrantów, jak i potencjalnych biorców. IE całkowita liczba biorców. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez trzy dni.

Obserwuj trans RFP w świetle zielonym i przez filtr czerwony; oblicz procentową wydajność IMCE jako stosunek CFU imigrantów trans do CFU wszystkich biorców. Około połowa trans przejdzie prawdziwą wymianę, co sprawi, że po trzech dniach inkubacji na podłożu Ty uzupełnionym o streptomycynę i gentamycynę będą białe i niewrażliwe. W następujących szczepach kontrolnych nie powinno wystąpić wzrostu: kontrola bez integrazji s milli latte UW 2 27, kontrola e coli MT 616, kontrola e coli DH five alpha zawierająca P JH one 10 oraz kontrola e coli DH five alpha zawierająca PJC two. W przeciwieństwie do nich, posiew IMCE z miejsca kojenia powinien wykazać zlewne wzrosty na pierwszym pasie i liczne kolonie na drugim pasie. Dwa kolejne obrazy przedstawiają resuspensje rozcieńczenia 10⁻² miejsca kojenia na agarze TY streptomycyna xgl oraz na agarze TY streptomycyna gentamycyna xgl.

Niebieskie kolonie to pojedyncze rekombinanty. Podczas gdy kolonie białe są trans-integrinami, które przeszły rzeczywistą wymianę kasety, w obserwacji pod światłem zielonym i przez filtr czerwony, rozcieńczenie 10⁻² zawiesiny resuspensyjnej z plamek kojarzenia na agarze TY strept cin xgl nie wykazuje fluorescencji. W przeciwieństwie do tego, rozcieńczenie 10⁻² zawiesiny resuspensyjnej z plamek kojarzenia na agarze Ty streptomycyny i gentamycyny Xgl wykazuje dwa poziomy fluorescencji.

Jaśniejsze kolonie odpowiadają koloniom niebieskim i charakteryzują się wyższą ekspresją RFP, co prawdopodobnie wynika z odczytu przechodniego (read-through) z promotora LAC w wektorze. Mniej jasne kolonie odpowiadają koloniom białym, w których doszło do właściwej wymiany kasety i które zawierają RFP z jedynie jego bezpośrednim promotorem, bez odczytu przechodniego z promotora LAC. Kolonie wykazujące te tendencje powinny być również wrażliwe na specytycynę.

Wydajność integracji trans, wyrażona jako procent imigrantów trans w stosunku do całkowitej liczby biorców, powinna mieścić się w zakresie 0,5%. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak wykorzystać koniugację bakteryjną z użyciem naszych zmodyfikowanych szczepów w celu wprowadzenia konstruktów DNA do chromosomu bakteryjnego.