Name: Szybkie składanie konstruktów wielogenowych przy użyciu modułowego klonowania Golden Gate (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Naucz się szybkiego składania konstruktów wielogenowych przy użyciu modułowego klonowania Golden Gate z zestawem Yeast MoClo. Ta metoda umożliwia efektywne generowanie bibliotek części genetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Fundację Badawczą Uniwersytetu Stanowego w Nowym Jorku (Nagroda #: 71272) oraz Nagrodę IMPACT Uniwersytetu w Buffalo (Nagroda #: 000077).

UWAGA: Hierarchiczny protokół klonowania oferowany w tym zestawie narzędzi można podzielić na trzy główne kroki: 1. Klonowanie plazmidów częściowych; 2. Klonowanie jednostek transkrypcyjnych (TU); 3. Klonowanie plazmidów wielogenowych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). Protokół ten rozpoczyna się od projektu startera, a kończy na zastosowaniu sklonowanego plazmidu wielogenowego.
1. Projekt podkładu do klonowania plazmidu części (pYTK001):
<ol>
	<li>Zaprojektuj startery do przodu i do tyłu zawierające boczące nukleotydy TTT na końcu 5', miejsce rozpoznawania BsmBI z dodatkowym nukleotydem (CGTCTCN), zwis 4-nukleotydowy (nt) (TCGG) komplementarny do zwisu wektora wejściowego, miejsce rozpoznawania BsaI z dodatkowym nukleotydem (GGTCTCN) i zwis specyficzny dla części 4-nt, oprócz sekwencji specyficznej dla szablonu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A). GoldenBraid 4.037 i GoldenMutagenesis38 to tylko niektóre z programów online, które mogą być używane do projektowania podkładów specyficznych dla Golden Gate.</li>
	<li>Jeśli miejsca rozpoznawania BsaI lub BsmBI są obecne w jakiejkolwiek części, użyj kroku udomowienia, aby zmutować te miejsca przed Golden Gate assembly39. W przypadku plazmidów integracyjnych (patrz krok 4) udomowić dowolne miejsce rozpoznawania NotI. Aby udomowić część z jednym niepożądanym miejscem rozpoznawania, podziel część na dwie podczęści w pobliżu niepożądanego miejsca (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A):
	<ol>
		<li>Zaprojektuj przednią starter pierwszej podczęści w taki sam sposób, jak w kroku 1.1, ale zaprojektuj odwrotny starter z miejscem BsmBI i tylko 4-ntowym zwisem specyficznym dla genu.</li>
		<li>Zaprojektuj drugą podczęść startera do przodu z miejscem BsmBI i tylko zwisem specyficznym dla genu 4-nt, który nakłada się na odwrotny starter pierwszej podczęści. Zaprojektuj odwrócony podkład drugiej części podrzędnej w taki sam sposób, jak w kroku 1.1.</li>
		<li>Wprowadzić pożądaną mutację (mutacje) w starterze odwrotnym (dla kroku 1.2.1) lub przednim (krok 1.2.2) w regionie specyficznym dla genu startera. 
		UWAGA: Alternatywnie, część wolna od BsmBI i BsaI oraz zoptymalizowana pod kątem kodonów może być zsyntetyzowana komercyjnie. W przypadku sekwencji kodujących (CDS) mutacja synonimiczna może być łatwo włączona do trzeciego nukleotydu kodonu aminokwasowego. Jednak w przypadku promotorów i terminatorów zaleca się sprawdzenie aktywności zmutowanego promotora lub terminatora za pomocą testu reporterowego39. Jeśli pod koniec sekwencji znajduje się niepożądane miejsce restrykcyjne, można je zmutować za pomocą dłuższego startera odwrotnego. Jeśli występuje wiele niepożądanych miejsc, można przeprowadzić mutagenezę skierowaną na miejsce, która pozwala na mutację wielu miejsc40.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Czasami pożądane jest połączenie dwóch białek jako pojedynczej części z łącznikiem pomiędzy nimi (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Łącznik pomaga zapewnić integralność strukturalną dwóch pojedynczych białek41.
	<ol>
		<li>Starter do przodu dla pierwszego genu jest taki sam jak w kroku 1.1. W odwrotnym starterze uwzględnij miejsce BsmBI, zwis specyficzny dla genu 4-nt i sekwencję łącznikową. Zwis 4-nt może być łącznikiem lub kilkoma pierwszymi nukleotydami drugiego genu.</li>
		<li>W przypadku drugiego genu zaprojektuj starter do przodu tak, aby miał miejsce rozpoznawania BsmBI i zwis 4-nt komplementarny do startera odwrotnego pierwszego genu. Zaprojektuj odwrotny starter drugiego genu, jak w kroku 1.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby amplifikować części za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)42, użyj polimerazy DNA o wysokiej wierności, aby amplifikować części z genomowego DNA, cDNA lub plazmidu. Sprawdź produkt PCR na 1% żelu agarozowym, a następnie oczyścić żel. Zdecydowanie zaleca się stosowanie oczyszczonego DNA, jeśli oczyszczanie żelu jest pracochłonne, należy użyć co najmniej kolumny wirowej do oczyszczenia produktu PCR.</li>
</ol>
2. Klonowanie części do wektora wejściowego (pYTK001) w celu utworzenia plazmidów części (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B)
<ol>
	<li>Aby ustawić mieszaninę reakcyjną Golden Gate, dodaj 20 fmol każdego produktu PCR i wektor wejściowy (pYTK001), 1 μl buforu ligazy 10X T4, 0,5 μl Esp3I (wysoce wydajny izoschizomer BsmBI) i 0,5 μl ligazy T4. Dodać ddH2O, aby uzyskać całkowitą objętość do 10 μl.</li>
	<li>Aby ustawić reakcję klonowania, uruchom następujący program w termocyklerze: 25-35 cykli w temperaturze 37 °C przez 5 minut (trawienie) i 16 °C przez 5 minut (podwiązanie), a następnie końcowe trawienie w temperaturze 50 °C przez 10 minut i inaktywacja enzymów w temperaturze 80 °C przez 10 minut 
	UWAGA: W przypadku jednoczesnego klonowania wielu fragmentów DNA do wektora wejściowego zaleca się 35 cykli trawienia/ligacji, na przykład podczas klonowania genów fuzyjnych lub udomowienia genu.</li>
	<li>Przekształć całą mieszaninę reakcyjną w szczep DH5α lub równoważne komórki kompetentne chemicznie Escherichia coli poprzez szok cieplny. Zaleca się przekształcenie całego 10 μl sklonowanego produktu w 35 μl chemicznie kompetentnych komórek E. coli (2 X 105 jtk/ml, jtk oblicza się na podstawie przekształcenia 5 ng pYTK001 w 100 μl kompetentnych komórek). Rozprowadzić na talerzu bulionu lizogenicznego (LB) z 35 μg/ml chloramfenikolu (Cm). Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Po 16-18 godzinach wyjąć płytkę z inkubatora i utrzymywać ją w temperaturze 4 °C przez około 5 godzin, aby umożliwić rozwinięcie się białka super zielonego białka fluorescencyjnego (sfGFP) w celu uzyskania bardziej intensywnego zielonego koloru.</li>
	<li>Aby ułatwić przesiewanie, umieść płytkę na transiluminatorze światła ultrafioletowego (UV) lub niebieskiego. Kolonie zawierające sfGFP będą fluoryzować w świetle UV.</li>
	<li>Zielone kolonie są ujemne, ponieważ zawierają nieoszlifowany pYTK001. Białe kolonie są prawdopodobnie pozytywne. Klonowanie zwykle kończy się sukcesem, jeśli istnieje ~ 30-100% białych kolonii. Przeprowadzić dalsze badania przesiewowe kilku białych kolonii za pomocą PCR kolonii lub trawienia restrykcyjnego (sugerowany enzym: BsaI-HFv2).</li>
	<li>Oczyść plazmidy z kilku potencjalnie prawidłowych kolonii i potwierdź sekwencje za pomocą sekwencjonowania Sangera.</li>
</ol>
3. Składanie plazmidów części w plazmidy "kasetowe"
UWAGA: Plazmid kasetowy zawiera zdefiniowaną przez użytkownika jednostkę transkrypcyjną (TU) składającą się z promotora, CDS i terminatora. Plazmid kasetowy umożliwia ekspresję pojedynczego genu. Jeśli plazmidy kasetowe zostaną złożone w plazmid wielogenowy, pierwszym krokiem jest określenie liczby i kolejności TU w plazmidzie wielogenowym. Określą one, które łączniki należy użyć w plazmidach kasetowych, ponieważ łączniki łączą TU w plazmidzie wielogenowym. Lewe złącze pierwszej jednostki technicznej powinno mieć wartość ConLS, a prawe złącze ostatniej jednostki technicznej powinno mieć wartość ConRE. Będą one pokrywać się z ConLS i ConRE plazmidów wielogenowych. Pozostałe łączniki powinny być w rosnącej kolejności numerycznej. Na przykład, jeśli plazmid wielogenowy zawiera cztery TU, kombinacje łączników to ConLS-TU1-ConR1, ConL1-TU2-ConR2, ConL2-TU3-ConR3 i ConL3-TU4-ConRE (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).
<ol>
	<li>Przed złożeniem jednostek transkrypcyjnych zaleca się złożenie wektora pośredniego z następującymi sześcioma częściami: lewym łącznikiem, zanikiem sfGFP (pYTK047), prawym łącznikiem, markerem selekcji drożdży, pochodzeniem replikacji drożdży i częścią plazmidu z mRFP1, pochodzeniem E. coli i genem opornym na ampicylinę (pYTK083) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3).
	<ol>
		<li>Oczyść powyższe sześć plazmidów. Zapisać ich stężenia za pomocą spektrofotometru UV-Vis lub testu fluorescencyjnego i rozcieńczyć każdy plazmid ddH2O, tak aby 1 μl miał 20 fmol DNA. Oblicz stężenie molowe DNA za pomocą kalkulatora online. 
		UWAGA: Bardzo ważne jest dokładne zmierzenie stężeń DNA i precyzyjne pipetowanie, aby zespół działał, szczególnie w przypadku zestawów z pięcioma do siedmioczęściowymi plazmidami. Niewielkie błędy w stężeniu DNA każdego plazmidu mogą spowodować znaczny spadek wydajności klonowania.</li>
		<li>Dodaj 1 μl każdego plazmidu, 1 μl buforu ligazy 10X T4, 0,5 μl BsaI-HFv2 (wysoce wydajna wersja BsaI) i 0,5 μl ligazy T4. Uzupełnić objętość do 10 μl, dodając ddH2O.</li>
		<li>Aby ustawić reakcję klonowania, uruchom następujący program w termocyklerze: 25-35 cykli po 37 °C przez 5 min (trawienie) i 16 °C przez 5 min (podwiązanie). Pomiń końcowe etapy trawienia i inaktywacji ciepła, ponieważ miejsca BsaI muszą zostać zachowane w wektorze pośrednim (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3).</li>
		<li>Przekształć całą mieszaninę reakcyjną w szczep DH5α lub inne kompetentne komórki E. coli. Rozprowadzić na płytce LB z 50 μg/ml karbenicyliny (Cb) lub ampicyliny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. 
		UWAGA: Karbenicylina jest stabilnym analogiem ampicyliny.</li>
		<li>Po 16-18 godzinach wyjmij płytkę z inkubatora. Płytka będzie zawierała zarówno bladoczerwone, jak i bladozielone kolonie (ryc. 6C i 6D). Przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C przez około 5 godzin, aby mRFP1 i sfGFP mogły dojrzeć. Użyj transiluminatora UV lub niebieskiego światła, aby zidentyfikować zielone kolonie, które zawierają potencjalnie prawidłowy wektor pośredni</li>.
		<li>Rozmieść zielone kolonie na płytce LB + Cb i inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc. Następnego dnia ponownie rozsmarować smugi na płytce LB + Cm i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Kolonie rosnące na płytkach LB + Cm zawierają źle zmontowane plazmidy, ponieważ wektory części odporne na Cm są zachowywane.</li>
		<li>Wybierz kolonie, które nie rosną na płytce LB + Cm i wykonaj trawienie restrykcyjne (sugerowane enzymy: BsaI-HFv2, Esp3I), aby potwierdzić prawidłowo złożony plazmid. Alternatywnie użyj colony PCR do badań przesiewowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po pomyślnym złożeniu wektora pośredniego następnym krokiem jest złożenie jednostek transkrypcyjnych. Jest to 4-częściowy zespół składający się z następujących części: wektora pośredniego, promotora, CDS i terminatora.
	<ol>
		<li>Oczyść czteroczęściowe plazmidy. Zapisz ich stężenia i rozcieńcz każdy z plazmidów tak, aby 1 μl miał 20 fmol DNA.</li>
		<li>Aby skonfigurować mieszaninę reakcyjną, wykonaj krok 3.1.2.</li>
		<li>Aby skonfigurować reakcję klonowania, wykonaj krok 2.2.</li>
		<li>Przekształć całą mieszaninę reakcji klonowania w komórki DH5α lub równoważne komórki E. coli i rozłożyć na LB + Cb. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
		<li>Po 16-18 godzinach wyjmij płytkę z inkubatora. Pojawią się białe i bladozielone kolonie (ryc. 6E i 6F). Utrzymuj płytkę w temperaturze 4 °C przez około 5 godzin, aby sfGFP dojrzał. Użyj transiluminatora UV lub niebieskiego światła, aby zidentyfikować niefluorescencyjne białe kolonie. Zawierają one potencjalnie poprawne jednostki transkrypcyjne.</li>
		<li>Wypuść i wyhoduj 8-10 białych kolonii i wykonaj PCR kolonii. Oczyść plazmidy z kolonii, które dają pozytywny wynik testu PCR na kolonie. Przeprowadzić trawienie restrykcyjne (sugerowany enzym: Esp3I), aby dodatkowo potwierdzić złożenie. 
		UWAGA: Sekwencjonowanie jednostek transkrypcyjnych zazwyczaj nie jest konieczne, ponieważ klonowanie obejmuje tylko trawienie restrykcyjne i ligację. Wszystkie interesujące sekwencje zostały potwierdzone na poziomie plazmidu części.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Składanie plazmidów kasetowych w plazmidy "wielogenowe":
UWAGA: Plazmidy wielogenowe pozwalają na ekspresję więcej niż jednego genu. W zależności od dalszego zastosowania, plazmidy wielogenowe mogą być replikacyjne lub integracyjne. Plazmidy replikacyjne mają drożdżowe pochodzenie replikacji; Dlatego można go stabilnie utrzymać, gdy komórka drożdży się dzieli. Plazmidy integracyjne nie mają drożdżowego pochodzenia replikacji. Zamiast tego mają ramiona homologiczne 5' i 3', co pozwala na integrację wielu genów w określone loci genomu poprzez rekombinację homologiczną.
<ol>
	<li>W przypadku plazmidów wielogenowych najpierw złóż wektor pośredni.
	<ol>
		<li>Aby złożyć replikacyjne wektory pośrednie (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4A), złóż następujące sześć części: lewe złącze (ConLS'-pYTK008), zanik sfGFP (pYTK047), prawe złącze (ConRE'-pYTK072), marker wyboru drożdży, drożdżowe pochodzenie replikacji i część plazmidu z mRFP1, pochodzenie replikacji E. coli i gen oporności na kanamycynę (pYTK084).
		<ol>
			<li>W przypadku montażu wykonaj kroki od 3.1.1 do 3.1.3.</li>
			<li>Przekształć całą mieszaninę reakcji klonowania w komórki kompetentne DH5α lub równoważne E. coli i umieść na płytce LB plus 50 μg/ml kanamycyny (Km). Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
			<li>W przypadku rastrowania opartego na kolorach czerwonym/zielonym wykonaj krok 3.1.5.</li>
			<li>Do przesiewania nieudanych montaży, smugi i hodowanie zielonych kolonii na płycie LB + Km. Następnie wykonaj krok 3.1.6.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W przypadku integracyjnych wektorów wielogenowych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4B) najpierw określ interesujące nas miejsce genomu, a następnie zaprojektuj około 500 par zasad ramion homologii 5' i 3' do integracji z tym locus.
		<ol>
			<li>Sklonuj ramiona homologii 5' i 3' z genomowego DNA drożdży do wektora wejściowego-pYTK001. Wykonaj kroki 1 i 2.</li>
			<li>Zbierz następujące siedem plazmidów: lewe złącze (ConLS'-pYTK008), odpadnięcie sfGFP (pYTK047), prawe złącze (ConRE'-pYTK072), marker selekcji drożdży, ramię homologii 3', część plazmidu z mRFP1, pochodzenie replikacji E. coli i gen oporny na kanamycynę (pYTK090) oraz ramię homologii 5'.</li>
			<li>W przypadku montażu i kontroli przesiewowej należy postępować zgodnie z krokiem 4.1.1.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż plazmidu wielogenowego
	<ol>
		<li>Oczyść plazmidy wektora pośredniego uzyskanego w kroku 4.1 i plazmidy kasetowe z kroku 3. Zapisać ich stężenia za pomocą spektrofotometru UV-VIS lub testu opartego na fluorescencji. Rozcieńczyć każdy w ddH2O tak, aby 1 μl miał 20 fmol DNA.</li>
		<li>Dodaj 1 μl wektora pośredniego, 1 μl każdej jednostki transkrypcyjnej, 1 μl 10x buforu ligazy T4, 0,5 μl Esp3I i 0,5 μl ligazy T4. Doprowadzić objętość do 10 μl za pomocą ddH2O.</li>
		<li>Aby skonfigurować reakcję klonowania, wykonaj krok 2.2.</li>
		<li>Przekształć całą mieszaninę reakcji klonowania w komórki kompetentne DH5α lub równoważne E. coli i umieścić na płytce LB + Km. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
		<li>Wykonaj badanie przesiewowe na zielono/biało, jak w kroku 3.2.5.</li>
		<li>Oczyść plazmidy z kilku białych kolonii i przeprowadź trawienie restrykcyjne. Stosowanie enzymu NotI-HF jest zalecane, ponieważ istnieją dwa miejsca NotI odpowiednio w części znacznika pochodzenia E. coli i znacznika selekcyjnego Km (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4B). Jeśli zmontowany plazmid jest bardzo duży, można wybrać inne miejsce restrykcji w celu dalszego potwierdzenia. Alternatywnie, przesiewaj za pomocą PCR kolonii przed przystąpieniem do trawienia restrykcyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Zastosowanie plazmidów wielogenowych do ekspresji genów chromosomalnych lub plazmidowych
<ol>
	<li>Integracja plazmidu wielogenowego z genomem drożdży w celu ekspresji genów chromosomalnych (<silna klasa="xfig">Rysunek 5)
	<ol>
		<li>Zaprojektuj przewodnik RNA (gRNA) dla żądanego locus. Zaleca się korzystanie z wielu zasobów online, takich jak Benchling, CRISPRdirect43 i CHOPCHOP44, w celu określenia maksymalnej swoistości dla celu.</li>
		<li>Sklonuj zsyntetyzowane 20-nt gRNA do plazmidu pCAS class45 przez klonowanie Gibsona. Linearyzuj plazmid pCAS metodą PCR przy użyciu odwróconej pary starterów wiążącej odpowiednio z 3' rybozymu HDV i 5' tracrRNA (<silna klasa = "xfig">Figura 5). Alternatywnie, sklonuj gRNA do plazmidu dropout sgRNA (pYTK050) i złóż plazmid dropout w plazmid kasetowy z łącznikami. Następnie zmontuj Cas9 TU z plazmidem części Cas9 (pYTK036). Na koniec złóż Cas9 TU i sgRNA TU w replikacyjny plazmid wielogenowy.</li>
		<li>Linearyzować 5-15 μg integracyjnego plazmidu wielogenowego z 1 μl enzymu NotI-HF przez noc. Przekształć 1 μg pCAS-gRNA i zlinearyzowany integracyjny plazmid wielogenowy w S. cerevisiae. Przygotuj kompetentne komórki, korzystając z dostępnego na rynku zestawu do transformacji drożdży lub zgodnie z protokołem Geitza i Schiestl, 200746. 
		UWAGA: Nie ma potrzeby oczyszczania zlinearyzowanego plazmidu wielogenowego po trawieniu NotI.</li>
		<li>Po odzyskaniu otoczkować ogniwa, wyrzucić supernatant, przemyć równą objętością wody. Płytki komórek drożdży na kompletnej pożywce syntetycznej (CSM) lub płytce z pożywką z dekstrozy peptonowej (YPD) z ekstraktem drożdżowym z antybiotykami, w zależności od markera selektywnego drożdży. Inkubować w temperaturze 37 °C przez dwa dni, aby powstały kolonie. W przypadku braku kolonii należy inkubować przez dodatkowy jeden do dwóch dni w temperaturze 30°C.</li>
		<li>Przesiewanie kolonii drożdży pod kątem integracji przez kolonię PCR47.</li>
		<li>Aby wyleczyć pCAS, należy usunąć kolonię z prawidłową integracją na nieselektywnej płytce YPD. Rośnie w temperaturze 30 °C przez noc. Przenieś jedną kolonię z płytki YPD na świeżą płytkę YPD. Ponownie rośnie w temperaturze 30 °C przez noc. Prążkować kolonię od drugiej płytki YPD do YPD plus 100 μg/ml nourseotrycyny, markera selekcyjnego pCAS. Udane utwardzenie następuje, gdy komórki drożdży nie rosną na selektywnej płytce. 
		UWAGA: Jeśli plazmid pCAS nie zostanie utwardzony w dwóch rundach nieselektywnego YPD, ponownie nałóż smugę na świeży YPD przez kolejne 1-2 rundy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transformacja replikacyjnego plazmidu wielogenowego w celu ekspresji genów opartej na plazmidzie
	<ol>
		<li>Przekształć 100 ng-1 μg czystego plazmidu wielogenowego w kompetentne komórki S. cerevisiae.</li>
		<li>Umieść komórki drożdży na płytce natychmiast po przemianie na płytce CSM lub płytce YPD plus antybiotyk, w zależności od użytego markera selekcji drożdży. Inkubować w temperaturze 30°C przez 2-3 dni, aby powstały kolonie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zestaw do klonowania oparty na MoClo opracowany przez Lee i in. stanowi doskonałe źródło do szybkiego składania od jednej do pięciu jednostek transkrypcyjnych w plazmid wielogenowy w celu replikacji lub integracji z genomem drożdży. Zastosowanie tego zestawu eliminuje czasochłonne wąskie gardło klonowania, które często występuje w przypadku ekspresji wielu genów u drożdży.
Przetestowaliśmy pięć różnych warunków dla cykli trawienia/ligacji klonowania Golden Gate za pomocą ligazy DNA T4. Stwierd...

Biologia syntetyczna ma na celu projektowanie systemów biologicznych z nowymi funkcjami przydatnymi dla przemysłu farmaceutycznego, rolniczego i chemicznego. Składanie dużej liczby fragmentów DNA w sposób wysokoprzepustowy jest podstawową technologią w biologii syntetycznej. Tak skomplikowany proces może podzielić się na wiele poziomów ze zmniejszającą się złożonością, koncepcja zapożyczona z podstawowych nauk inżynieryjnych1,2. W biologii syntetycznej fragmenty DNA zwykle łączą się hierarchicznie w oparciu o funkcjonalność: (i) Poziom części: "części" odnoszą się do fragmentów DNA o określonej funkcji, takiej jak promotor, sekwencja kodująca, terminator, początek replikacji; (ii) Poziom jednostek transkrypcyjnych (TU): TU składa się z promotora, sekwencji kodującej i terminatora zdolnego do transkrypcji pojedynczego genu; (iii) Poziom wielogenowy: plazmid wielogenowy zawiera wiele TU, często składających się z całego szlaku metabolicznego. Ten hierarchiczny montaż zapoczątkowany przez społeczność BioBrick jest fundamentalną koncepcją składania dużych zestawów DNA w biologii syntetycznej3.
W ciągu ostatniej dekady4,5,6,7, technika klonowania Golden Gate znacznie ułatwiła hierarchiczne składanie DNA2. Wiele innych wieloczęściowych metod klonowania, takich jak klonowanie Gibsona8, klonowanie niezależne od ligacji (SLIC)9, klonowanie oparte na wycinaniu uracylu (USER)10, reakcja cyklu ligazy (LCR)11 oraz rekombinacja in vivo (asembler DNA)12,13, zostały również opracowane do tej pory. Ale klonowanie Golden Gate jest idealną metodą składania DNA, ponieważ jest niezależne od sekwencji specyficznych dla genów, umożliwiając bezbliznowate, kierunkowe i modułowe składanie w reakcji jednogarnkowej. Klonowanie Golden Gate wykorzystuje enzymy restrykcyjne typu IIS, które rozpoznają sekwencję niepalindromiczną, aby utworzyć naprzemienne zwisy poza miejscem rozpoznawania2. Następnie ligaza łączy się z wyżarzonymi fragmentami DNA, aby uzyskać wieloczęściowy zespół. Zastosowanie tej strategii klonowania do systemu klonowania modułowego (MoClo) umożliwiło złożenie do 10 fragmentów DNA z ponad 90% transformantów przesiewanych, zawierających poprawnie zmontowany construct4.
System MoClo oferuje ogromne korzyści, które przyspieszyły cykl projektowania, budowy i testowania biologii syntetycznej. Po pierwsze, wymienne części umożliwiają klonowanie kombinatoryczne w celu szybkiego testowania dużej przestrzeni parametrów. Na przykład optymalizacja szlaku metabolicznego zwykle wymaga przełączania się przez wiele promotorów dla każdego genu, aby zrównoważyć przepływ szlaku. System MoClo z łatwością poradzi sobie z tak wymagającymi zadaniami klonowania. Po drugie, należy zsekwencjonować część plazmidu, ale zazwyczaj nie TU lub plazmidy wielogenowe. W większości przypadków badanie przesiewowe metodą PCR kolonii lub trawienie restrykcyjne jest wystarczające do weryfikacji na poziomie TU i plazmidu wielogenowego. Dzieje się tak, ponieważ klonowanie części plazmidu jest jedynym krokiem wymagającym PCR, który często wprowadza mutacje. Po trzecie, system MoClo idealnie nadaje się do budowy wielogenowych złożonych szlaków metabolicznych. Wreszcie, ze względu na uniwersalne zwisy, plazmidy częściowe mogą być ponownie wykorzystane i udostępnione całej społeczności bioinżynierów. Obecnie zestawy MoClo są dostępne dla plants14,15,5,16,17, fungi6,18,19,20,21,22, bakterie7,23,24,25,26,27, oraz animals28,29. Niedawno wprowadzono również platformę MoClo dla wielu królestw30.
Dla Saccharomyces cerevisiae, Lee et al.6 opracowali wszechstronny zestaw narzędzi MoClo, doskonały zasób dla społeczności zajmującej się biologią syntetyczną drożdży. Ten zestaw jest dostępny w wygodnym formacie 96-dołkowym i definiuje osiem typów wymiennych części DNA z różnorodną kolekcją dobrze scharakteryzowanych promotorów, białek fluorescencyjnych, terminatorów, znaczników peptydowych, markerów selekcyjnych, pochodzenia replikacji i narzędzi do edycji genomu. Ten zestaw narzędzi umożliwia złożenie do pięciu jednostek transkrypcyjnych w plazmid wielogenowy. Cechy te są cenne dla inżynierii metabolicznej drożdży, w której częściowe lub całe szlaki ulegają nadmiernej ekspresji w celu wytworzenia docelowych substancji chemicznych. Korzystając z tego zestawu, naukowcy zoptymalizowali produkcję geraniolu, linaloolu31, penicyliny32, kwasu mukonowego33, indigo34 i betalain35 w drożdżach.
Tutaj udostępniamy szczegółowy, krok po kroku protokół, który pomaga w korzystaniu z zestawu narzędzi MoClo do generowania wielogenowych ścieżek dla ekspresji episomalnej lub genomowej. Dzięki szerokiemu zastosowaniu tego zestawu odkryliśmy, że dokładny pomiar stężeń DNA jest kluczem do zapewnienia równomolowego rozkładu każdej części w reakcji Golden Gate. Zalecamy również ligazę DNA T4 zamiast ligazy DNA T7, ponieważ ta pierwsza działa lepiej przy większej liczbie zwisów36. Wreszcie, wszelkie wewnętrzne miejsca rozpoznawania BsmBI i BsaI muszą zostać usunięte lub udomowione przed montażem. Alternatywnie można rozważyć syntezę części w celu usunięcia wielu wewnętrznych miejsc i jednoczesnej optymalizacji kodonów. Pokazujemy, jak korzystać z tego zestawu narzędzi, wyrażając pięciogenowy szlak produkcji β-karotenu i likopenu w S. cerevisiae. Dalej pokazujemy, jak znokautować locus ADE2 za pomocą narzędzi do edycji genomu z tego zestawu. Te eksperymenty oparte na kolorach zostały wybrane w celu łatwej wizualizacji. Pokazujemy również, jak generować białka fuzyjne i tworzyć mutacje aminokwasów za pomocą klonowania Golden Gate.

<table><tbody><tr><td>Koraliki szklane 0,5 mm</td><td>Produkty badawcze RPI</td><td>9831</td><td>Do lizy komórek drożdży</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD & Firma</td><td>214010</td><td>Składnik drożdży kompletnej pożywki syntetycznej (CSM)</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD& Firma</td><td>211677</td><td>Składnik pożywki z dekstrozy peptonowej (YPD)</td></tr> <tr><td>BsaI-HFv2</td><td>New England Biolabs</td><td>R3733S</td><td>wysoce wydajna wersja enzymu restrykcyjnego BsaI</td></tr><tr><td>Karbenicylina</td><td>Fisher Bioodczynniki</td><td>4800-94-6</td><td>Antybiotyk do badań przesiewowych na poziomie jednostki transkrypcyjnej</td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Fisher Bioreodczynniki</td><td>56-75-7</td><td>Antybiotyk do badań przesiewowych w poziom wektora wejściowego</td></tr><tr><td>CSM-His</td><td>Sunrise Sciences</td><td>1006-010</td><td>Suplement aminokwasowy drożdży kompletne podłoże syntetyczne (CSM)</td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16-500</td><td>Źródło węgla drożdży kompletne podłoże syntetyczne (CSM)</td></tr><tr><td>Difco Drożdże Azot Baza bez aminokwasów</td><td>BD i Firma</td><td>291940</td><td>Źródło azotu drożdży kompletna pożywka syntetyczna (CSM)</td></tr> <tr><td>dNTP mix</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td>dNTP do PCR</td></tr><tr><td>Esp3I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0734S</td><td>wysoce wydajny izoschizomer BsmBI</td></tr><tr><td>Mrożone-EZ Zestaw do trasformacji drożdży II</td><td>Zymo Research</td><td>T2001</td><td>Do przemiany drożdży</td></tr><tr><td>Heksany</td><td>Fisher Chemical</td><td>H302-1</td><td>Do ekstrakcji karotenoidów z komórek drożdży</td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>Odczynniki Fishera</td><td>25389-94-0</td><td>Antybiotyk do badań przesiewowych na poziomie plazmidu wielogenowego</td></tr><tr><td>LB Agar, Miller</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1425-2</td><td>Lizogeniczne podłoże agarowe do hodowli E. coli</td></tr><tr><td>bulionu LB, Miller</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1426-2</td><td>Lizogeniczne płynne podłoże dla E. coli hodowla</td></tr><tr><td>chemikaliów likopenu</td><td>na Kajmanach</td><td>NC1142173</td><td>Do oznaczania ilościowego likopenu</td></tr><tr><td>MoClo YTK</td><td>Addgene</td><td>1000000061</td><td>Laboratorium deponujące: John Deuber</td></tr><tr><td>Monarch Plasmid Miniprep Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>T1010L</td><td>Do oczyszczania plazmidu z E.coli</td></tr><tr><td>Nanodrop Spektrofotometr</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND2000c</td><td>Do pomiaru dokładnych stężeń DNA</td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3189S</td><td>Enzym restrykcyjny do integratywnej wielogenowej linearyzacji plazmidu</td></tr><tr><td>Siarczan nourseotrycyny</td><td>Goldbio</td><td>N-500-100</td><td>Marker wyboru antybiotyku dla plazmidu pCAS użytego w tym badaniu</td></tr><tr><td>Bufor reakcyjny Phusion HF (5X)</td><td>New England Biolabs</td><td>B0518S</td><td>Bufor do PCR przy użyciu polimerazy Phusion</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA o wysokiej wierności Phusion</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td>Polimeraza o wysokiej wierności dla wszystkich reakcji PCR</td></tr><tr><td>pLM494</td><td>Addgene</td><td>100539</td><td>Plazmid używany do amplifikacji crtI, crtYB i crtE użytych w tym badaniu</td></tr><tr><td>Kuweta kwarcowa</td><td>Thermo Electron</td><td>10050801</td><td>Do ilościowego oznaczania karotenoidów</td></tr><tr><td>Ligazy T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td>Ligaza dla złotego Termocykler do klonowania bramek</td></tr><tr><td></td><td>BIO-RAD</td><td>1851148</td><td>Do wykonywania wszystkich reakcji PCR i klonowania</td></tr><tr><td>Homogenizator tkankowy</td><td>Bullet Blender</td><td>Model: BBX24</td><td>Do homogenizacji komórek drożdży</td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-Vis</td><td>Thermo Scientific</td><td>Genesys 150</td><td>Do ilościowego oznaczania karotenoidów Ekstrakt drożdżowy</td></tr><tr><td></td><td>Odczynniki Fisher</td><td>BP1422-500</td><td>Składnik pożywki z dekstrozy peptonowej (YPD)</td></tr> <tr><td>i beta;-karotenu</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAH6010603</td><td>Do oznaczania ilościowego &beta;-karotenu</td></tr></tbody></table>

szybkie składanie konstruktów wielogenowych przy użyciu modułowego klonowania golden gate

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

Metoda klonowania Golden Gate umożliwia szybkie składanie wielu genów w dowolnym, zdefiniowanym przez użytkownika układzie. Wykorzystuje enzymy restrykcyjne typu IIS, które wykraczają poza ich miejsca rozpoznawania i tworzą krótki zwis. Ten modułowy system klonowania (MoClo) wykorzystuje hierarchiczny przepływ pracy, w którym różne części DNA, takie jak promotory, sekwencje kodujące (CDS) i terminatory, są najpierw klonowane do wektora wejściowego. Wiele wektorów wejściowych łączy się następnie w jednostki transkrypcyjne. Następnie kilka jednostek transkrypcyjnych łączy się w plazmid wielogenowy. Strategia klonowania Golden Gate ma ogromną zaletę, ponieważ pozwala na bezbliznowaty, kierunkowy i modułowy montaż w reakcji jednogarnkowej. Hierarchiczny przepływ pracy zazwyczaj umożliwia łatwe klonowanie szerokiej gamy konstruktów wielogenowych bez potrzeby sekwencjonowania poza wektorami wejściowymi. Zastosowanie fluorescencyjnych zaników białek umożliwia łatwe wizualne badania przesiewowe. Praca ta dostarcza szczegółowego, krok po kroku protokołu składania plazmidów wielogenowych przy użyciu zestawu do modułowego klonowania drożdży (MoClo). Pokazujemy optymalne i nieoptymalne wyniki składania plazmidów wielogenowych i dostarczamy przewodnik do badań przesiewowych w kierunku kolonii. Ta strategia klonowania ma duże zastosowanie w inżynierii metabolicznej drożdży i innych sytuacjach, w których wymagane jest klonowanie plazmidów wielogenowych.

Poniżej przedstawiono wyniki dla czterech replikacyjnych plazmidów wielogenowych do produkcji β-karotenu (żółty) i likopenu (czerwony). Skonstruowano jeden integracyjny plazmid wielogenowy do przerwania locus ADE2 , którego kolonie są czerwone.
Klonowanie sekwencji kodujących (CDS) do wektora wejściowego (pYTK001) 
Gen ERG20 został namnożony z genomu drożdży, a trzy geny karotenoidów crt...

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowego, krok po kroku przewodnika do tworzenia konstruktów wielogenowych za pomocą modułowego systemu klonowania opartego na klonowaniu Golden Gate. Zawiera również zalecenia dotyczące krytycznych kroków, aby zapewnić optymalny montaż w oparciu o nasze doświadczenia.

Szybkie składanie konstruktów wielogenowych przy użyciu modułowego klonowania Golden Gate

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

Jest to szczegółowy protokół składania plazmidów wielogenowych przy użyciu zestawu Yeast MoClo . Ta metoda umożliwia wygodne klonowanie różnych wielogenowych kolegów z klasy. Idealnie nadaje się do generowania dużej biblioteki powiązanych części.Zacznij od skonfigurowania mieszanki reakcyjnej Golden Gate. Dodaj 20 femtomoli każdego produktu PCR i wektor wejściowy, jeden mikrolitr buforu ligazy 10X T4, 0,5 mikrolitra Esp3I i 0,5 mikrolitra ligazy T4. Dodaj podwójnie destylowaną wodę, aby uzyskać całkowitą objętość do 10 mikrolitrów.Następnie uruchom reakcję klonowania. Przekształć całą mieszaninę reakcyjną w szczep DH5 alfa lub równoważne komórki Escherichia coli kompetentne chemicznie przez szok cieplny. Rozłóż komórki na płytce lb z 35 mikrogramami na mililitr chloramfenikolu.Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Po 16 do 18 godzinach wyjmij płytkę z inkubatora i pozostaw ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza na około pięć godzin, aby superfolder zielonego białka fluorescencyjnego lub sfGFP rozwinął się w celu uzyskania bardziej intensywnego zielonego koloru. Aby przesiać płytkę, umieść ją na transiluminatorze światła ultrafioletowego lub niebieskiego.Kolonie zawierające sfGFP będą fluoryzować w świetle UV. Zielone kolonie są ujemne, ponieważ zawierają nieodciętą część plazmidu. Białe kolonie są prawdopodobnie pozytywne.Klonowanie kończy się sukcesem, jeśli istnieje od 30 do 100% białych kolonii. Złóż wektor pośredni z lewym łącznikiem, zanikiem sfGFP, prawym łącznikiem, markerem selekcji drożdży, pochodzeniem replikacji drożdży i plazmidem częściowym z mRFP1, pochodzeniem E. coli i genem opornym na ampicylinę. Przeprowadź reakcję klonowania zgodnie z opisem w rękopisie tekstu.Przekształć całą mieszaninę reakcyjną w szczep DH5 alfa, a następnie rozprowadź komórki na płytce lb z 50 mikrogramami na mililitr karbenicyliny lub ampicyliny. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Po upływie 16 do 18 godzin wyjąć płytkę z inkubatora.Talerz będzie zawierał zarówno bladoczerwone, jak i bladozielone kolonie. Utrzymuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez około pięć godzin, aby mRFP1 i sfGFP dojrzały. Użyj transiluminatora UV lub światła niebieskiego, aby zidentyfikować zielone kolonie, które zawierają potencjalnie prawidłowy wektor pośredni.Rozłóż zielone kolonie na płytce z karbenicyliną i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia rozłóż je ponownie na talerzu z chloramfenikolem i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Kolonie rosnące na płytkach chloramfenikolu zawierają źle złożone plazmidy.Po pomyślnym złożeniu wektora pośredniego przystąp do składania jednostek transkrypcyjnych. Ten czteroczęściowy zespół zawiera wektor pośredni, promotor, CDS i determinator. Oczyść plazmidy, zapisz ich stężenia i rozcieńcz każdy plazmid do 20 femtomoli DNA na mikrolitr.Po przeprowadzeniu reakcji klonowania przekształć całą mieszaninę reakcji klonowania w kompetentne komórki DH5 alfa lub równoważne E.coli i pokryj je karbenicyliną LBN. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Po 16 do 18 godzinach wyjmij płytkę z inkubatora i trzymaj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez około pięć godzin, aby sfGFP dojrzał.Użyj transiluminatora UV lub światła niebieskiego, aby zidentyfikować niefluorescencyjne białe kolonie, które zawierają potencjalnie prawidłowe jednostki transkrypcyjne. Złóż wektor pośredni dla plazmidów wielogenowych, jak opisano w manuskrypcie tekstowym. Następnie przekształć całą mieszaninę reakcji klonowania w komórki alfa DH5 i pokryj je na funtach z 50 mikrogramami na mililitr kanamycyny.Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Wykonaj badania przesiewowe oparte na czerwonym i zielonym kolorze, a następnie rozprowadź i wyhoduj zielone kolonie na płytce kanamycyny funtowej, aby przesiać pod kątem błędnych montaży, jak pokazano wcześniej. Następnie złóż plazmid wielogenowy, ustawiając reakcję klonowania zgodnie z opisem w rękopisie tekstu.Przekształć całą mieszaninę reakcji klonowania w komórki alfa DH5 i umieść je na lb kanamycyny. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnie wykonaj zielony i biały ekran zgodnie z wcześniejszym opisem.Protokół ten został wykorzystany do skonstruowania jednego integracyjnego plazmidu wielogenowego do zakłócania locus ADE2. Zmontowano cztery replikacyjne i jeden integracyjny plazmidy wielogenowe. Stosunek potencjalnie prawidłowych kolonii do klonowania wektora pośredniego wynosił 1,83%Po sklonowaniu plazmidu pośredniego wskaźnik powodzenia składania plazmidów wielogenowych z półproduktu wynosił 93,77%Znikoma liczba dodatnich białych kolonii wykazuje nieoptymalny montaż plazmidów wielogenowych.Po przekształceniu się w drożdże, kolonie produkujące beta-karoten i likopen rosły trzeciego dnia. Cztery kolonie z każdej płytki zostały wyprowadzone na świeże talerze i rosły przez kolejne dwa dni. Karotenoidy wyekstrahowano i oznaczono ilościowo za pomocą spektrofotometrii UV-Vis.BTS1 / ERG20 prowadzi do 35-krotnie wyższej produkcji beta-karotenu w porównaniu ze szczepem z samym ERG20. Podobnie, produkcja likopenu jest około 16,5 razy wyższa w szczepie z BTS1/ERG20 w porównaniu z samym ERG20. Wielogenowy plazmid integracyjny został wykorzystany do rozerwania locus ADE2, albo za pomocą gRNA i bez DNA pomocniczego, albo z gRNA i wielogenowym plazmidem integracyjnym jako DNA pomocniczym.Po trzech do czterech dniach zaobserwowano czerwone kolonie na płytce YPD z Nourseothricin, co wskazuje, że ADE2 został skutecznie zakłócony. Próbując tej metody, najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest dokładny pomiar stężenia DNA i dokładne pipetowanie podczas ustawiania tej mieszanki reakcyjnej. Technika ta pozwala naukowcom zajmującym się inżynierią metaboliczną drożdży na badanie dużej liczby genów i promotorów w celu maksymalizacji wydajności produktu.

rapid-assembly-multi-gene-constructs-using-modular-golden-gate

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Kompleksy białkowe katalizują kluczowe funkcje komórkowe. Szczegółowa charakterystyka funkcjonalna i strukturalna wielu istotnych kompleksów wymaga produkcji rekombinowanej. MultiBac to system komórkowy bakulowirusa/owadów specjalnie przystosowany do ekspresji białek eukariotycznych i ich kompleksów. MultiBac został wdrożony jako platforma o otwartym dostępie, a standardowe procedury operacyjne zostały opracowane w celu maksymalizacji jego użyteczności.

Platforma do produkcji kompleksu białkowego MultiBac w EMBL

Designerskie nukleazy, takie jak nukleazy palców cynkowych (ZFN) i aktywatory transkrypcji podobne do efektorów (TALENs) mogą być używane do modyfikacji genomu mysich zarodków preimplantacyjnych poprzez aktywowanie zarówno szlaku niehomologicznego łączenia końców (NHEJ), jak i homologicznej rekombinacji (HR). Postępy te umożliwiają szybkie generowanie myszy z precyzyjnymi modyfikacjami genetycznymi.

Inżynieria genomu myszy przy użyciu nukleaz projektanta

Synteza niestandardowych plazmidów jest pracochłonna i czasochłonna. Protokół ten opisuje zastosowanie klonowania zespołu Gibsona w celu zmniejszenia pracy i czasu trwania niestandardowej procedury klonowania DNA. Opisany protokół pozwala również na uzyskanie wiarygodnych znakowanych konstruktów białkowych do ekspresji ssaków przy podobnych kosztach jak w przypadku tradycyjnego klonowania DNA metodą "wytnij i wklej".

Generowanie wektorów plazmidowych eksprymujących białka znakowane FLAG pod regulacją promotora ludzkiego czynnika wydłużenia-1α przy użyciu zespołu Gibsona

Korzystając z montażu DNA, wiele wektorów CRISPR może być konstruowanych równolegle w jednej reakcji klonowania, co sprawia, że budowa dużej liczby wektorów CRISPR jest prostym zadaniem. Owłosione korzenie pomidora są doskonałym systemem modelowym do walidacji wektorów CRISPR i generowania zmutowanych materiałów.

Wysokoprzepustowa konstrukcja wektora CRISPR i charakterystyka modyfikacji DNA przez generowanie owłosionych korzeni pomidora

Tutaj prezentowany jest zautomatyzowany przepływ pracy do wykonywania modułowego montażu "urządzenia" DNA przy użyciu modułowej metody klonowania DNA na robotach obsługujących ciecze. Protokół wykorzystuje intuicyjne narzędzie programowe do generowania list wyboru osób zajmujących się cieczami do kombinatorycznego generowania biblioteki urządzeń DNA, które demonstrujemy za pomocą dwóch platform do obsługi cieczy.

Zautomatyzowany zrobotyzowany montaż modułowych urządzeń DNA do obsługi cieczy

Ten protokół opisuje kroki potrzebne do zaprojektowania i przeprowadzenia multipleksowanego celowania wzmacniaczy za pomocą dezaktywującego białka fuzyjnego SID4X-dCas9-KRAB, znanego również jako interferencja wzmacniacza (Enhancer-i). Protokół ten umożliwia identyfikację wzmacniaczy, które regulują ekspresję genów i ułatwia analizę relacji między wzmacniaczami regulującymi wspólny gen docelowy.

Analiza funkcji wzmacniacza za pomocą interferencji wzmacniacza opartego na multipleksie CRISPR w liniach komórkowych

Tutaj przedstawiono prostą, efektywną i opłacalną metodę klonowania sgRNA.

Przewodnik CRISPR Klonowanie RNA dla systemów ssaków

Tutaj prezentujemy klonowanie gRNA (STAgR), metodę łatwego multipleksowania wektorów gRNA dla podejść CRISPR/Cas9. STAgR sprawia, że multipleksowanie gRNA jest proste, wydajne i konfigurowalne.

Konfigurowalny protokół klonowania gRNA ze składaniem ciągów (STAgR)

Tutaj prezentujemy protokół opisujący, jak i) złożyć samoreplikujący się wektor za pomocą modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate, ii) wprowadzić wektor do sinicowego gospodarza przez koniugację, oraz iii) scharakteryzować transgeniczne szczepy sinic za pomocą czytnika płytek lub cytometrii przepływowej.

Modyfikacja genetyczna cyjanobakterii przez koniugację przy użyciu modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate

Prezentujemy protokół do modułowego montażu opartego na CRISPR (CRISPRmass), metody wysokoprzepustowej budowy biblioteki plazmidów UAS-cDNA/ORF u Drosophila przy użyciu publicznie dostępnych zasobów cDNA/ORF. CRISPRmass może być stosowany do edycji różnych bibliotek plazmidów.

Modułowy montaż oparty na CRISPR do wysokoprzepustowej budowy biblioteki plazmidów UAS-cDNA/ORF

Niniejszy artykuł przedstawia krok po kroku protokół demonstrujący, jak klonowanie modułowe (MoClo) można dostosować do klonowania operonów policistronnych.

Standaryzowany modułowy montaż operonów policistronnych z klonowaniem modularnym (MoClo) z wykorzystaniem zestawu narzędzi In-Cloning

Naucz się szybkiego składania konstruktów wielogenowych przy użyciu modułowego klonowania Golden Gate z zestawem Yeast MoClo. Ta metoda umożliwia efektywne generowanie bibliotek części genetycznych.

Szybkie składanie konstruktów wielogenowych przy użyciu modułowego klonowania Golden Gate

Przeglądaj więcej filmów