Szybkie składanie konstruktów wielogenowych przy użyciu modułowego klonowania Golden Gate

Jest to szczegółowy protokół składania plazmidów wielogenowych przy użyciu zestawu Yeast MoClo . Ta metoda umożliwia wygodne klonowanie różnych wielogenowych kolegów z klasy. Idealnie nadaje się do generowania dużej biblioteki powiązanych części.

Zacznij od skonfigurowania mieszanki reakcyjnej Golden Gate. Dodaj 20 femtomoli każdego produktu PCR i wektor wejściowy, jeden mikrolitr buforu ligazy 10X T4, 0,5 mikrolitra Esp3I i 0,5 mikrolitra ligazy T4. Dodaj podwójnie destylowaną wodę, aby uzyskać całkowitą objętość do 10 mikrolitrów.

Następnie uruchom reakcję klonowania. Przekształć całą mieszaninę reakcyjną w szczep DH5 alfa lub równoważne komórki Escherichia coli kompetentne chemicznie przez szok cieplny. Rozłóż komórki na płytce lb z 35 mikrogramami na mililitr chloramfenikolu.

Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Po 16 do 18 godzinach wyjmij płytkę z inkubatora i pozostaw ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza na około pięć godzin, aby superfolder zielonego białka fluorescencyjnego lub sfGFP rozwinął się w celu uzyskania bardziej intensywnego zielonego koloru. Aby przesiać płytkę, umieść ją na transiluminatorze światła ultrafioletowego lub niebieskiego.

Kolonie zawierające sfGFP będą fluoryzować w świetle UV. Zielone kolonie są ujemne, ponieważ zawierają nieodciętą część plazmidu. Białe kolonie są prawdopodobnie pozytywne.

Klonowanie kończy się sukcesem, jeśli istnieje od 30 do 100% białych kolonii. Złóż wektor pośredni z lewym łącznikiem, zanikiem sfGFP, prawym łącznikiem, markerem selekcji drożdży, pochodzeniem replikacji drożdży i plazmidem częściowym z mRFP1, pochodzeniem E. coli i genem opornym na ampicylinę. Przeprowadź reakcję klonowania zgodnie z opisem w rękopisie tekstu.

Przekształć całą mieszaninę reakcyjną w szczep DH5 alfa, a następnie rozprowadź komórki na płytce lb z 50 mikrogramami na mililitr karbenicyliny lub ampicyliny. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Po upływie 16 do 18 godzin wyjąć płytkę z inkubatora.

Talerz będzie zawierał zarówno bladoczerwone, jak i bladozielone kolonie. Utrzymuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez około pięć godzin, aby mRFP1 i sfGFP dojrzały. Użyj transiluminatora UV lub światła niebieskiego, aby zidentyfikować zielone kolonie, które zawierają potencjalnie prawidłowy wektor pośredni

Rozłóż zielone kolonie na płytce z karbenicyliną i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia rozłóż je ponownie na talerzu z chloramfenikolem i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Kolonie rosnące na płytkach chloramfenikolu zawierają źle złożone plazmidy.

Po pomyślnym złożeniu wektora pośredniego przystąp do składania jednostek transkrypcyjnych. Ten czteroczęściowy zespół zawiera wektor pośredni, promotor, CDS i determinator. Oczyść plazmidy, zapisz ich stężenia i rozcieńcz każdy plazmid do 20 femtomoli DNA na mikrolitr.

Po przeprowadzeniu reakcji klonowania przekształć całą mieszaninę reakcji klonowania w kompetentne komórki DH5 alfa lub równoważne E.coli i pokryj je karbenicyliną LBN. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Po 16 do 18 godzinach wyjmij płytkę z inkubatora i trzymaj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez około pięć godzin, aby sfGFP dojrzał.

Użyj transiluminatora UV lub światła niebieskiego, aby zidentyfikować niefluorescencyjne białe kolonie, które zawierają potencjalnie prawidłowe jednostki transkrypcyjne. Złóż wektor pośredni dla plazmidów wielogenowych, jak opisano w manuskrypcie tekstowym. Następnie przekształć całą mieszaninę reakcji klonowania w komórki alfa DH5 i pokryj je na funtach z 50 mikrogramami na mililitr kanamycyny.

Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Wykonaj badania przesiewowe oparte na czerwonym i zielonym kolorze, a następnie rozprowadź i wyhoduj zielone kolonie na płytce kanamycyny funtowej, aby przesiać pod kątem błędnych montaży, jak pokazano wcześniej. Następnie złóż plazmid wielogenowy, ustawiając reakcję klonowania zgodnie z opisem w rękopisie tekstu.

Przekształć całą mieszaninę reakcji klonowania w komórki alfa DH5 i umieść je na lb kanamycyny. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnie wykonaj zielony i biały ekran zgodnie z wcześniejszym opisem.

Protokół ten został wykorzystany do skonstruowania jednego integracyjnego plazmidu wielogenowego do zakłócania locus ADE2. Zmontowano cztery replikacyjne i jeden integracyjny plazmidy wielogenowe. Stosunek potencjalnie prawidłowych kolonii do klonowania wektora pośredniego wynosił 1,83%Po sklonowaniu plazmidu pośredniego wskaźnik powodzenia składania plazmidów wielogenowych z półproduktu wynosił 93,77%Znikoma liczba dodatnich białych kolonii wykazuje nieoptymalny montaż plazmidów wielogenowych.

Po przekształceniu się w drożdże, kolonie produkujące beta-karoten i likopen rosły trzeciego dnia. Cztery kolonie z każdej płytki zostały wyprowadzone na świeże talerze i rosły przez kolejne dwa dni. Karotenoidy wyekstrahowano i oznaczono ilościowo za pomocą spektrofotometrii UV-Vis.

BTS1 / ERG20 prowadzi do 35-krotnie wyższej produkcji beta-karotenu w porównaniu ze szczepem z samym ERG20. Podobnie, produkcja likopenu jest około 16,5 razy wyższa w szczepie z BTS1/ERG20 w porównaniu z samym ERG20. Wielogenowy plazmid integracyjny został wykorzystany do rozerwania locus ADE2, albo za pomocą gRNA i bez DNA pomocniczego, albo z gRNA i wielogenowym plazmidem integracyjnym jako DNA pomocniczym.

Po trzech do czterech dniach zaobserwowano czerwone kolonie na płytce YPD z Nourseothricin, co wskazuje, że ADE2 został skutecznie zakłócony. Próbując tej metody, najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest dokładny pomiar stężenia DNA i dokładne pipetowanie podczas ustawiania tej mieszanki reakcyjnej. Technika ta pozwala naukowcom zajmującym się inżynierią metaboliczną drożdży na badanie dużej liczby genów i promotorów w celu maksymalizacji wydajności produktu.