Name: Stworzenie gęstej biblioteki insercji transpozonów za pomocą koniugacji bakteryjnej w szczepach enterobakteryjnych, takich jak Escherichia coli czy Shigella flexneri (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Poznaj metodę tworzenia gęstej biblioteki insercji transpozonów w Escherichia coli i Shigella flexneri za pomocą koniugacji bakteryjnej. Protokół umożliwia generowanie setek tysięcy unikalnych mutantów z losowymi insercjami Tn10.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękuję George Church Lab za miły dar plazmidu pJA1. Dziękuję Fabienne Hamburger i Alexowi Boehmowi z Urs Jenal Lab w Biozentrum w Bazylei za pomoc w koniugacji bakterii i za dostarczenie BW20767 szczepu. Dziękuję również Olinowi Silanderowi za pomocne edycje. Fundusze na te badania zostały zapewnione ze środków z Uniwersytetu Massey w Nowej Zelandii oraz Szwajcarskiej Inicjatywy w Biologii Systemów (Projekt "Battle X" przyznany Dirkowi Bumannowi) na Uniwersytecie w Bazylei w Szwajcarii.

UWAGA: Jeśli używasz S. flexneri jako szczepu biorcy, proszę pamiętać, że S. flexneri jest ludzkim patogenem, który może powodować choroby żołądkowo-jelitowe. Eksperymenty z udziałem S. flexneri muszą być przeprowadzane z zachowaniem odpowiednich środków bezpieczeństwa biologicznego (oznaczone jako BSL-2 w Europie i USA lub PC2 w Nowej Zelandii). Wszystkie eksperymenty przeprowadzone w filmie związanym z tym protokołem zostały przeprowadzone przy użyciu dobrze scharakteryzowanego szczepu biorcy niepatogennej E. coli MG1655 w warunkach PC1. Praca z Shigella flexneri była wcześniej wykonywana w laboratorium BSL-2 w Biozentrum w Bazylei, zgodnie z opisem w6.
Uwaga: Poniższy eksperyment jest skutecznie przeprowadzany dwukrotnie. Pierwsza część (Krok 1.1 - Krok 4.5) jest wykonywana w celu znalezienia najlepszego rozcieńczenia do posiewu z biblioteki, gdzie celem jest znalezienie rozcieńczenia koniugacji, które daje wiele pojedynczych kolonii na płytkę, ale nie tak wiele, aby utworzył się trawnik. Ma to na celu ograniczenie konkurencji między mutantami o znacznie obniżonej sprawności a tymi o silniejszej sprawności. Druga część (Kroki 5.1-7.4) to stworzenie końcowej biblioteki, w której rozkłada się wiele płyt o odpowiednim rozcieńczeniu biblioteki.
1. Przygotować się dzień przed eksperymentem
<ol>
	<li>Zaszczepić, z zamrożonego bulionu, szczep dawcy w 2 ml bulionu LB, pożywka według przepisu Millersa (NaCl w stężeniu 10 g/l) zawierająca ampicylinę w stężeniu 100 μg/ml. Użyty tutaj szczep dawcy to szczep E. coli BW2076715 zawierający plazmid pJA111. Stosowanie ampicyliny utrzymuje selekcję plazmidu pJA1</li>.
	<li>Zaszczepić, z pojedynczej kolonii lub zamrożonego bulionu, szczep biorcy w 2 ml pożywki LB ze znacznikiem oporności innym niż ampicylina lub kanamycyna. Użytym tutaj szczepem biorcy jest szczep E. coli "typu dzikiego" MG165517,18 z spontanicznym mutantem oporności na kwas nalidyksowy. Uprawia się go w 30 μg/ml kwasu nalidyksowego.</li>
	<li>Przygotuj 20 bulionów Luria zawierających 1,5% płytek agarowych (na 90 mM szalkach Petriego, około 12,5 ml). Płytki agarowe pozbawione antybiotyku mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy, aż do użycia.</li>
	<li>Przygotuj 20 bulionów Luria zawierających 1,5% płytek agarowych (na 90 mM szalkach Petriego, około 12,5 ml) zawierających zarówno kwas nalidyksowy w stężeniu 30 μg/ml, jak i kanamycynę w stężeniu 50 μg/ml (LBA Nal30 Kan50). Płytki agarowe zawierające antybiotyki można przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy, aż do użycia.</li>
	<li>Przygotuj 200 ml sterylnego podłoża LB. Pożywki LB można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Przygotuj 1 ml 100 mM sterylnego wywaru IPTG, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
2. Kojarzenie lub koniugacja bakterii
<ol>
	<li>Odwirować 1 ml nocnej hodowli szczepu dawcy przez 1 minutę w temperaturze 14 000 x g w temperaturze pokojowej. Wyrzuć pożywkę wzrostową. Ten krok ma na celu usunięcie wszystkich pożywek wzrostowych zawierających antybiotyki.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 110 μl LB (niezawierającym antybiotyków), zagęszczając w ten sposób kulturę.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy umieść sterylny filtr nitrocelulozowy (alternatywnie można użyć sterylnego kawałka bibuły, patrz Lista materiałów) na środku płytki LBA (nie zawierającej antybiotyków). Oznacz tabliczkę "Kontrola ujemna: Dawca".</li>
	<li>Za pomocą pipety wrzuć 50 μl skoncentrowanej kultury dawcy na filtr.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.1-4 dla szczepu biorcy, oznaczając tabliczkę "Kontrola ujemna: Biorca".</li>
	<li>W przypadku biblioteki upuść 50 μl dawcy (z kroku 2.2) I 50 μl szczepu biorcy (z kroku 2.5) na pojedynczy sterylny filtr na płytce LBA (płytki te nie powinny zawierać antybiotyków). Oznacz tę tabliczkę jako "Biblioteka". Krycie następuje, ponieważ dawca i biorca są w bliskim kontakcie fizycznym na filtrze.</li>
	<li>Umieścić płytki agarowe zawierające filtry w temperaturze 37 °C na 6 godzin.</li>
</ol>
3. Aktywacja transpozonu pJA1 przez indukcję transpozazy IPTG
<ol>
	<li>Przygotować trzy stożkowe fiolki o pojemności 15 ml zawierające 2 ml LB z IPTG w końcowym stężeniu 1 mM (tj. 20 μl ze 100 mM zapasu IPTG). Oznacz każdą etykietę: Formant darczyńcy, Formant adresata i Biblioteka.</li>
	<li>Wyjąć płytki z inkubatora po 6 godzinach wzrostu w temperaturze 37 °C (od kroku 2.4). Na filtrze powinien być widoczny pewien wzrost bakterii.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy usuń bibułę filtracyjną z grupy kontrolnej dawcy i umieść ją w stożkowej fiolce o pojemności 15 ml oznaczonej jako Kontrola dawcy (od kroku 3.1). Zrób to samo dla formantu adresata i biblioteki.</li>
	<li>Postukaj w probówki, aby bibuła filtracyjna znalazła się na dnie stożkowej fiolki o pojemności 15 ml i upewnij się, że jest całkowicie zanurzona w LB.</li>
	<li>Wiruj rurki przez co najmniej pełną minutę na wysokich obrotach, aby oddzielić bakterie od filtra nitrocelulozowego. LB powinien stać się mętny z komórkami bakteryjnymi (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2).</li>
	<li>Używając sterylnych szklanych kulek lub sterylnego rozsiewacza, nanieś 200 μl wirowej zawiesiny bakterii z kontroli dawcy na płytki LBA Nal30 Kan50 oznaczone "Kontrola dawcy, 200 μL".</li>
	<li>Powtórzyć powyższy krok (3.6) dla kontrolki odbiorcy, oznaczając tabliczki "Kontrola odbiorcy, 200 μL".</li>
	<li>Powtórzyć powyższy krok (3.7) dla biblioteki, oznaczając tabliczki "Biblioteka, 200 μL".</li>
	<li>Wykonać dodatkowe rozcieńczenia (tj. rozcieńczenia 1:5, 1:10 i 1:100, używając LB niezawierającego antybiotyków jako rozcieńczalnika) biblioteki. Płytka 200 μl nierozcieńczonej biblioteki i dodatkowe rozcieńczenia na odpowiednio oznakowane płytki LBA Nal30 Kan50.</li>
	<li>Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 18 godzin. Klony z transpozonami wprowadzonymi do genu, który powoduje dużą utratę sprawności, mogą potrzebować więcej czasu, aby urosnąć i pojawić się na płytce. Kolonie powinny być różnej wielkości (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Na płytkach szczepów dawcy i biorcy nie powinno znajdować się żadne kolonie.</li>
</ol>
4. Wybierz odpowiednie rozcieńczenie biblioteki, które ma być użyte dla ostatecznej biblioteki mutantów
<ol>
	<li>Określ rozcieńczenie biblioteki z kroku 3.9, które daje wiele kolonii o różnych rozmiarach, które są odpowiednio rozmieszczone. Celem jest zebranie jak największej liczby kolonii na jednej płycie, ale nie na tyle, aby kolonie łączyły się ze sobą i rywalizowały o zasoby. Liczba ta powinna wynosić około 500-2,000 kolonii na płytkę. Przykład odpowiedniego zagęszczenia kolonii na płytce pokazano na Rysunek 3.</li>
	<li>Zapisz liczbę kolonii na płytkach.</li>
	<li>Oblicz częstotliwość koniugacji (liczba koniugantów na komórkę biorcy). Powinien to być zakres od 1 x 10-4 do 1 x 10-6 19.</li>
	<li>Określ pożądaną liczbę mutantów w końcowej bibliotece na podstawie aplikacji podrzędnych. Wielu użytkowników po prostu potrzebuje biblioteki z jak największą liczbą mutantów. Aby wygenerować jak najwięcej insercji transpozonów, jak to teoretycznie możliwe (jedna insercja na każdą parę zasad), celuj w przybliżenie w taką samą liczbę kolonii, jak pary zasad w genomie (tj. ~4,5 x 106 dla E. coli), aby w pełni nasycić genom wszystkimi możliwymi insercjami transpozonów. Należy zauważyć, że wiele mutantów zawierających insercje w podstawowych lub funkcjonalnie ważnych genach nie będzie w stanie odzyskać, ponieważ mutacje te będą śmiertelne dla biorcy.</li>
	<li>Oblicz, ile objętości początkowej biblioteki jest potrzebne do utworzenia biblioteki o żądanym rozmiarze. Na przykład żądany rozmiar biblioteki to 5 x 104 mutanty. Rozcieńczenie z najlepszym odstępem między koloniami z kroku 3.9 wynosiło 200 μl rozcieńczenia 1:10. Liczbę kolonii na tej płycie szacuje się na około 2,000 kolonii. Jeśli potrzebne są 5 x 104 mutanty, a każda płytka ma 2,000 kolonii, to przy tym rozcieńczeniu potrzebnych będzie 25 płytek.</li>
</ol>
5. Stworzenie Ostatecznej Biblioteki Mutantów
<ol>
	<li>Powtórz kroki od 1 do 3.8, dostosowując w razie potrzeby liczbę płytek w kroku 1.4 (patrz krok 4.4).</li>
	<li>W kroku 3.9 nanieś rozcieńczenie wybrane w kroku 4.1 na tyle płytek, ile jest potrzebne do utworzenia biblioteki o żądanym rozmiarze (patrz krok 4.4).</li>
</ol>
6. Oszacuj gęstość biblioteki
<ol>
	<li>Policz, ile kolonii znajduje się na jednej płycie, a tym samym uzyskaj przybliżone oszacowanie, jak gęsta jest biblioteka. Na przykład: W sumie 2x105 kolonii jest platerowanych. Genom E. coli MG1655 składa się z około 4,5 x 106 par zasad. Dlatego biblioteka z około 2 x 105 wstawieniami oznacza, że średnio co 22 pary zasad występuje wstawka i że każdy gen powinien być zmutowany około 45 razy, biorąc pod uwagę, że jeden gen to w przybliżeniu 1 x 103 pary zasad. Insercje w niezbędnych genach będą prawdopodobnie bardzo niedostatecznie reprezentowane w tej bibliotece, a zatem zagęszczenie w genach nieistotnych będzie prawdopodobnie większe. Tego rodzaju obliczenia dostarczają szerokiego oszacowania gęstości transpozonów.</li>
</ol>
7. Łączenie biblioteki Transposon i pamięci masowej
<ol>
	<li>Po zliczeniu kolonii dodaj 1 ml LB (lub więcej, w razie potrzeby) do płytki bibliotecznej i użyj sterylnego rozsiewacza, aby zeskrobać bakterie z płytki. Usunąć zawiesinę bakteryjną i umieścić w stożkowej fiolce o pojemności 50 ml lub 15 ml. Powtórz tę czynność dla wszystkich talerzy.</li>
	<li>Wirować zebraną zawiesinę bakterii przez pełną minutę, aby ujednorodnić zawiesinę.</li>
	<li>Dodaj sterylny glicerol do końcowego stężenia 20%.
	<ol>
		<li>Przygotuj 100 x 20 μl porcji w probówkach o pojemności 0,25 ml, aby ułatwić ich ponowny wzrost.</li>
		<li>Przygotować co najmniej dwie lub więcej porcji po 1 ml w kriowialach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przechowywać wszystkie porcje w temperaturze -80°C</li>
</ol>

<ol><li>Camacho, L. R., Ensergueix, D., Perez, E., Gicquel, B., Guilhot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+virulence+gene+cluster+of+Mycobacterium+tuberculosis+by+signature-tagged+transposon+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a virulence gene cluster of Mycobacterium tuberculosis by signature-tagged transposon mutagenesis.</a> Mol Microbiol. 34 (2), 257-267 (1999).</li>
<li>Hensel, M., Shea, J. E., Gleeson, C., Jones, M. D., Dalton, E., Holden, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+identification+of+bacterial+virulence+genes+by+negative+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Simultaneous identification of bacterial virulence genes by negative selection.</a> Science. 269 (5222), 400-403 (1995).</li>
<li>Glass, J. I., Assad-Garcia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+genes+of+a+minimal+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Essential genes of a minimal bacterium.</a> PNAS. 103 (2), 425-430 (2006).</li>
<li>Salama, N. R., Shepherd, B., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+transposon+mutagenesis+and+essential+gene+analysis+of+Helicobacter+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Global transposon mutagenesis and essential gene analysis of Helicobacter pylori.</a> J Bacteriol. 186 (23), 7926-7935 (2004).</li>
<li>Akerley, B. J., Rubin, E. J., Camilli, A., Lampe, D. J., Robertson, H. M., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+essential+genes+by+in+vitro+mariner+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of essential genes by in vitro mariner mutagenesis.</a> PNAS. 95 (15), 8927-8932 (1998).</li>
<li>Freed, N. E., Bumann, D., Silander, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+Shigella+Tn-seq+data+with+gold-standard+E.+coli+gene+deletion+data+suggests+rare+transitions+between+essential+and+non-essential+gene+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Combining Shigella Tn-seq data with gold-standard E. coli gene deletion data suggests rare transitions between essential and non-essential gene functionality.</a> BMC Microbiology. 16 (1), 1-14 (2016).</li>
<li>van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn-seq%3A+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nature Methods. 6 (10), 767-772 (2009).</li>
<li>Langridge, G. C., Phan, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+assay+of+every+Salmonella+Typhi+gene+using+one+million+transposon+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants.</a> Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).</li>
<li>Gawronski, J. D., Wong, S. M. S., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+insertion+mutants+within+libraries+by+deep+sequencing+and+a+genome-wide+screen+for+Haemophilus+genes+required+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung.</a> PNAS. 106 (38), 16422-16427 (2009).</li>
<li>Chan, K., Kim, C. C., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+detection+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+transposon+mutants+that+cannot+survive+in+macrophages+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+and+Immun%22%5BJournal%5D)">Microarray-based detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium transposon mutants that cannot survive in macrophages and mice.</a> Infect and Immun. 73 (9), 5438-5449 (2005).</li>
<li>Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+analyses+of+insertional+mutants+using+subgenic-resolution+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnol%22%5BJournal%5D)">Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays.</a> Nature biotechnol. 19 (11), 1060-1065 (2001).</li>
<li>Bender, J., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IS10+transposase+mutations+that+specifically+alter+target+site+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">IS10 transposase mutations that specifically alter target site recognition.</a> The EMBO Journal. 11 (2), 741-750 (1992).</li>
<li>Shafferman, A., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+properties+of+the+beta+origin+of+replication+of+plasmid+R6K%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K.</a> J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).</li>
<li>Langridge, G. C., Phan, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+assay+of+every+Salmonella+Typhi+gene+using+one+million+transposon+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants.</a> Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).</li>
<li>Metcalf, W. W., Jiang, W., Daniels, L. L., Kim, S. K., Haldimann, A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditionally+replicative+and+conjugative+plasmids+carrying+lacZ+alpha+for+cloning%2C+mutagenesis%2C+and+allele+replacement+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Conditionally replicative and conjugative plasmids carrying lacZ alpha for cloning, mutagenesis, and allele replacement in bacteria.</a> Plasmid. 35 (1), 1-13 (1996).</li>
<li>Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+analyses+of+insertional+mutants+using+subgenic-resolution+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnol%22%5BJournal%5D)">Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays.</a> Nature biotechnol. 19 (11), 1060-1065 (2001).</li>
<li>Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6271456">Identification of a Sex-factor-affinity Site in E. coli as γδ.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 45 (0), 135-140 (1981).</li>
<li>Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Complete+Genome+Sequence+of+Escherichia+coli+K-12%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12.</a> Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).</li>
<li>Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-Tn10+transposon+derivatives+for+insertion+mutagenesis+and+gene+delivery+into+the+chromosome+of+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria.</a> Gene. 160 (1), 59-62 (1995).</li>
<li>Kvitko, B. H., Bruckbauer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+construction+of+pir%2B+Enterobacterial+hosts+for+maintenance+of+R6K+replicon+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple method for construction of pir+ Enterobacterial hosts for maintenance of R6K replicon plasmids.</a> BMC Res Notes. 5 (1), 157(2012).</li>
<li>Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+evolution+and+adaptation+in+a+long-term+experiment+with+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli.</a> Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).</li>
<li>Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+transposon+mutant+library+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.</a> PNAS. 100 (24), 14339-14344 (2003).</li>
<li>van Opijnen, T., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+insertion+sequencing%3A+a+new+tool+for+systems-level+analysis+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.</a> Nature Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).</li>
</ol>

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Opisany tutaj protokół pozwala na budowę gęstej biblioteki wstawiania. Metoda ta pozwala na stworzenie biblioteki transpozonów zawierającej ponad 2 x 105 unikalnych mutantów transpozonów przy użyciu poniżej 5 ml objętości kultury6. Jest stosunkowo łatwy do wykonania, wykorzystuje odczynniki dostępne w większości podstawowych laboratoriów mikrobiologicznych, jest skalowalny i wymaga niewielkiego sprzętu lub materiałów eksploatacyjnych, takich jak kuwety do elektroporacji.
Istotną zaletą tej metody jest to, że teoretycznie użytkownik ma dużą swobodę w wyborze szczepów enterobakteryjnych biorców. W tym artykule, jak również w innych11, użyto E. coli jako szczepu biorcy, jednak plazmid pJA1 był z powodzeniem stosowany z innymi gatunkami enterobakterii biorców, takimi jak Shigella flexneri6 i Salmonella enterica serowar Typhimurium szczep SL134410. Teoretycznie γ początek replikacji (oriR6Kγ) w pJA1 pozwala na utrzymanie tego plazmidu w szerokim zakresie gospodarza19, co pozwala na to, że szczepem biorcy jest pir+. Ostatnio opisano nowe metody, które pozwalają na konstruowanie pir+ w różnych szczepach enterobakteryjnych20, co daje dodatkową elastyczność. Dodatkowo, regionmob o długości 300 par zasad z plazmidu RP4 w pJA1 umożliwia sprzężony transfer tego plazmidu do szerokiego zakresu szczepów bakterii Gram-ujemnych19. Mówiąc najprościej, metoda ta może być teoretycznie stosowana z różnymi szczepami biorców, o ile spełnionych jest kilka warunków: szczep jest pir+ i charakteryzuje się opornością na antybiotyki inną niż kanamycyna i inną niż szczep dawcy.
Krytycznym krokiem w protokole jest oszacowanie właściwej liczby komórek do wydzielenia w kroku 4.1. Jeśli kolonie są rozmieszczone zbyt blisko, konkurują o składniki odżywcze na talerzu, a mniej sprawne mutanty są konkurencjonowane. Może to prowadzić do zmniejszenia całkowitej liczby mutantów. Alternatywnie, jeśli kolonie są oddalone od siebie zbyt daleko, na płytce będzie zbyt mało kolonii, a całkowita liczba płytek agarowych potrzebnych do uzyskania dużej biblioteki stanie się uciążliwa. Dlatego ważne jest osiągnięcie właściwej równowagi pod względem liczby kolonii na płytce.
Ważne jest, aby wykonać kontrole wymienione w protokole, aby upewnić się, że kroki działają zgodnie z opisem. Warto zauważyć, że w przypadku stosowania kwasu nalidyksowego jako przeciwselekcji przeciwko szczepowi dawcy, ważne jest, aby upewnić się, że płytki kontrolne z ujemnym dawcą są wolne od kolonii. Dzieje się tak, ponieważ może występować niski odsetek (około 1 x 10-10)21 spontanicznej oporności na kwas nalidyksowy, co daje wyniki fałszywie dodatnie. Zazwyczaj szybkość koniugacji i transpozycji wynosi około 2 x 10-4 19. W związku z tym szybkość koniugacji i transpozycji jest o kilka rzędów wielkości większa niż szybkość spontanicznej oporności na kwas nalidyksowy. W związku z tym odsetek wyników fałszywie dodatnich w porównaniu ze zdarzeniami prawdziwej transpozycji jest bardzo niski i uważany za nieistotny, gdy protokół działa. Jeśli jednak tempo koniugacji lub transpozycji zostanie znacznie zmniejszone (z powodu niskiej wydajności kojarzenia i/lub braku indukcji genu transpozazy z IPTG), a protokół zostanie przeskalowany w górę, aby to zrekompensować, wówczas liczba wyników fałszywie dodatnich (klonów, które nie mają wstawionego transpozonu) może również wzrosnąć.
Pewne modyfikacje można wprowadzić w czasie inkubacji w krokach 3.2 i 3.10. Krok 3.2 mówi, że koniugacja powinna następować przez 6 godzin, ale z naszego doświadczenia wynika, że ten krok czasowy może być zmieniany (tj. 4-7 godzin) bez znaczącej zmiany wyników. Dodatkowo, w kroku 3.10, można również dostosować czas inkubacji kolonii na płytkach agarowych. Może się to zmieniać w zależności od średniego czasu podwojenia lub tempa wzrostu szczepu biorcy. Dodatkowo, z naszego doświadczenia, 18 godzin dało różne rozmiary kolonii, co wskazuje na bibliotekę o różnym przystosowaniu. Jednak kolonie o znacznie obniżonej sprawności mogą rosnąć dłużej, a zatem mogą nie być widoczne po 18 godzinach. Jeśli ta metoda jest stosowana do znajdowania klonów o skrajnie zmniejszonej sprawności, można zastosować dłuższy czas inkubacji i mniej kolonii na płytce w celu zmniejszenia stłoczenia (tj. 48 godzin, 50-300 kolonii).
Dodatkowe pułapki tej metody obejmują to, że nie jest możliwe użycie szczepu biorcy, który jest już odporny na kanamycynę. W celu pokonania tej przeszkody możliwe jest zastąpienie markera oporności na kanamycynę w plazmidzie pJA1 na alternatywny marker do wyboru, taki jak oporność na chloramfenikol. Warto również zauważyć, że teoretycznie możliwe jest użycie szczepu biorcy, który jest odporny na ampicylinę, ponieważ plazmid pJA1 zawierający marker oporności na ampicylinę jest tracony wkrótce po transpozycji.
Stworzenie gęstej biblioteki transpozonów w wybranym przez siebie tle genetycznym jest potencjalnie korzystne dla wielu dalszych zastosowań. Na przykład gęsta biblioteka transpozonów może być wykorzystana do identyfikacji mutantów auksotroficznych za pomocą posiewu replik22 lub do identyfikacji mutantów, które są wadliwe w tworzeniu infekcji 1,2. Niedawno, gdy koszty sekwencjonowania DNA spadły, a nowe technologie, takie jak sekwencjonowanie nowej generacji, stały się powszechne, biblioteki transpozonów zostały wykorzystane do głębokiego sekwencjonowania DNA w celu uzyskania wglądu w niezbędność genów, funkcję genów i interakcje genetyczne. Niektóre z tych metod zostały omówione w 23 i obejmują takie metody, jak sekwencjonowanie miejsca insercji kierowane transpozonami (TraDIS), sekwencjonowanie transpozonów (Tn-seq), wysokoprzepustowe śledzenie insercji za pomocą głębokiego sekwencjonowania (HITS) i sekwencjonowanie insercji (INSeq). Wszystkie te dalsze metody opierają się na budowie gęstych bibliotek wstawiania transpozonów. Podczas gdy w przypadku określonych metod dalszych może być konieczne zastosowanie innych wektorów, opisany tutaj protokół zawiera przegląd istotnych punktów proceduralnych, które należy śledzić.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56216/creation-dense-transposon-insertion-library-using-bacterial">Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri</a>. The Discussion and References sections have been corrected.
The second paragraph in the Discussion section was updated from:
A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use&#160;E. coli&#160;as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as&#160;Shigella flexneri6&#160;and&#160;Salmonella enterica&#160;serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the &#947; origin of replication (oriR6K&#947;) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is&#160;pir+.&#160;Recently, new methods have been described that allow for construction of the&#160;pir+&#160;in a range of enterobacterial strains20, giving additional flexibility. Additionally, the300 base pair mob&#160;region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is&#160;pir+, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.
to:
A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use&#160;E. coli&#160;as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as&#160;Shigella flexneri6&#160;and&#160;Salmonella enterica&#160;serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the &#947; origin of replication (oriR6K&#947;) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is&#160;pir-.&#160;The&#160;300 base pair mob&#160;region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is&#160;pir-, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.
The References&#160;section was updated from:
<ol start="18">
	<li>Blattner, F. R., Plunkett, G.,&#160;et al.&#160;The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12.&#160;Science.&#160;277&#160;(5331), 1453-1462 (1997).</li>
	<li>Alexeyev, M. F., &#38; Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria.&#160;Gene.&#160;160&#160;(1), 59-62 (1995).</li>
	<li>Kvitko, B. H., Bruckbauer, S.,&#160;et al.&#160;A simple method for construction of pir+ Enterobacterial hosts for maintenance of R6K replicon plasmids.&#160;BMC Res Notes.&#160;5&#160;(1), 157 (2012).</li>
	<li>Barrick, J. E., Yu, D. S.,&#160;et al.&#160;Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli.&#160;Nature.&#160;461&#160;(7268), 1243-1247 (2009).</li>
	<li>Jacobs, M. A., Alwood, A.,&#160;et al.&#160;Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.&#160;PNAS.&#160;100&#160;(24), 14339-14344 (2003).</li>
	<li>van Opijnen, T., &#38; Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.&#160;Nature Rev Microbiol.&#160;11&#160;(7), 435-442 (2013).</li>
</ol>
to:
<ol start="18">
	<li>Blattner, F. R., Plunkett, G.,&#160;et al.&#160;The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12.&#160;Science.&#160;277&#160;(5331), 1453-1462 (1997).</li>
	<li>Alexeyev, M. F., &#38; Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria.&#160;Gene.&#160;160&#160;(1), 59-62 (1995).</li>
	<li>Barrick, J. E., Yu, D. S.,&#160;et al.&#160;Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli.&#160;Nature.&#160;461&#160;(7268), 1243-1247 (2009).</li>
	<li>Jacobs, M. A., Alwood, A.,&#160;et al.&#160;Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.&#160;PNAS.&#160;100&#160;(24), 14339-14344 (2003).</li>
	<li>van Opijnen, T., &#38; Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.&#160;Nature Rev Microbiol.&#160;11&#160;(7), 435-442 (2013).</li>
</ol>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56216/creation-dense-transposon-insertion-library-using-bacterial">Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri</a>.&#160;The Discussion and References sections have been corrected.

Erratum: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Tworzenie bibliotek mutagenezy transpozonów u bakterii jest przydatne dla szerokiej gamy zastosowań, począwszy od odkryć genów wirulencji w patogenach bakteryjnych1,2, do badań nad niezbędnymi genami3,4,5,6, do identyfikacji sieci interakcji genetycznych7,8,9. Kluczowe znaczenie dla tych badań ma możliwość stworzenia dużej biblioteki mutantów. Użycie transpozonów (krótkich fragmentów DNA, które losowo wstawiają się do genomu) jest prostym sposobem zakłócenia funkcji genu, ponieważ wprowadzenie transpozonu w otwartej ramce odczytu lub regionie regulatorowym genu często zakłóca funkcję lub ekspresję genu.
Opisana tutaj jest metoda tworzenia biblioteki transpozonów u E. coli lub S. flexneri poprzez koniugację bakteryjną przy użyciu plazmidu pJA110. Istnieją dwie główne zalety stosowania tego plazmidu. Pierwszą zaletą jest to, że wariant transpozazy Tn10 wyrażony z plazmidu pJA1 jest indukowalny i ma niską stronniczość insercji11,12, co oznacza, że transpozon losowo zintegruje się z genomem, gdy do pożywki zostanie dodany izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG). Transpozon zawiera marker oporności na kanamycynę, co pozwala na selekcję mutantów z wstawkami transpozonu do chromosomu szczepu biorcy. Drugą zaletą plazmidu pJA1 jest to, że zawiera on zmutowane pochodzenie replikacji R6K. Zmutowane pochodzenie replikacji R6K wymaga genu lambda pir w celu utrzymania plazmidu13. Ponieważ plazmid nie może replikować się w szczepach pir-, zostanie utracony w szczepie biorcy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Gwarantuje to, że transpozaza Tn10 zostanie usunięta z komórki i nie będzie już aktywna, co zmniejszy dalsze mutacje po początkowym zdarzeniu transpozycji.
Użycie koniugacji bakteryjnej do przeniesienia plazmidu pJA1 ze szczepu dawcy do szczepu biorcy jest korzystne z kilku powodów. Koniugacja jest prosta i niedroga do wykonania i nie wymaga specjalnego sprzętu, takiego jak elektroporator. Dodatkowo, wysoka wydajność koniugacji bakteryjnej pozwala na uzyskanie bardzo dużej biblioteki (>2 x 105 unikalnych insercji) przy użyciu zaledwie kilku mililitrów (ml) nocnej hodowli bakteryjnej6. Proces ten trwa około dwóch godzin czasu praktycznego wraz z czasem na inkubację i wzrost bakterii. Langridge i wsp.14 zgłosił wykonanie 130 elektroporacji w celu stworzenia biblioteki mutagenezy transpozonów o rozmiarze podobnym do opisanej tutaj8, co osiąga się za pomocą pojedynczej koniugacji. Zastosowanie 130 elektroporacji wymaga pracochłonnego i czasochłonnego przygotowania elektrokompetentnych ogniw oraz użycia wielu drogich materiałów (np. kuwet do elektroporacji), co wiąże się z kosztem ponad 1000 USD w samych materiałach eksploatacyjnych. Inne badania10 używały podobnych metod, ale z różnymi szczepami bakterii i osiągnęły znacznie mniejsze rozmiary bibliotek (5 x 104 jednostki tworzące kolonie) niż opisane tutaj.
Uwagi na temat szczepu dawcy: Użyty tutaj szczep dawcy to szczep E. coli BW2076715 zawierający plazmid transpozonu pJA116. Szczep BW20767 może koniugować się z innymi szczepami, dzięki czemu transfer plazmidu pJA1 jest bardzo wydajny. Co ważne, BW20767 jest lambda pir+. Jak wspomniano wcześniej, plazmid pJA1 może być utrzymany tylko w szczepach zawierających gen lambda pir. Szczep ten jest odporny na kanamycynę i ampicylinę. Plazmid pJA1 zawiera marker oporności na ampicylinę, a marker oporności na kanamycynę jest zawarty w transpozonie. Szczep ten jest uprawiany z selekcją na plazmidzie przy użyciu ampicyliny w stężeniu 100 μg/ml. Warto również zauważyć, że inne szczepy zawierające geny transpozazy o konstytutywnej ekspresji są znane jako niestabilne i chociaż zastosowana tutaj transpozaza jest pod kontrolą indukowalną, ryzyko nieszczelnej ekspresji pozostaje niskie. Z tego powodu sugeruje się, że przejście tego szczepu powinno być zminimalizowane, a świeża smuga powinna być pobierana z zamrożonej kultury dla każdego nowego preparatu bibliotecznego. Użyty tutaj szczep dawcy jest dostępny w naszym laboratorium na życzenie.
Uwagi na temat szczepu odbiorcy: Szczep biorcy może być szczepem z wyboru, takim jak laboratoryjne szczepy E. coli pochodzące z K12 lub szczepy S. flexneri (zobacz również: Dyskusja). Szczep biorcy musi mieć dodatkowy marker oporności na antybiotyki, który nie jest opornością na kanamycynę, aby można było dokonać selekcji szczepu dawcy. Dla szczepu biorcy stosuje się tutaj szczep E. coli MG1655 z wprowadzoną spontaniczną mutacją kwasu nalidyksowego. Spontaniczny mutant kwasu nalidyksowego wybrano poprzez wysianie 2 ml nocnej hodowli w 200 μl podwielokrotności na płytkach zawierających kwas nalidyksowy w stężeniu 30 μg/ml. Wybrano pojedynczy klon MG1655, który był odporny na kwas nalidyksowy, aby stać się szczepem biorcy. Dodatkowo, szczep biorca musi być lambda pir ujemny, jak opisano powyżej.
Przegląd: Gdy koniugacja bakteryjna już nastąpi i plazmid pJA1 przeniesie się ze szczepu dawcy do szczepu biorcy, dodanie IPTG do pożywki wywoła ekspresję genu tnp, który jest pod kontrolą indukowanego przez IPTG promotora lacIq/Ptac (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Gen tnp na pJA1 jest zmutowaną transpozazą, która ma niższą częstotliwość insercji w gorących punktach6,10,11. Po dodaniu i indukcji za pomocą IPTG, transpozon jest aktywowany i losowo wstawiany do genomu. Plazmid nie może być utrzymany w szczepie biorcy lambda pir- i jest tracony.

<table><tbody><tr><td>Filtry nitrocelulozowe 0,45 mikrona (sterylne)</td><td>Milipory</td><td>HAWP02500</td><td>Alternatywnie można użyć bibuły (wymienionej poniżej)</td></tr><tr><td>Bibuła pocięta na kółka ~ 1 cala, a następnie autoklaw/sterylizowana w folii. Nie ma różnicy w wydajności między filtrami nitrocelulozowymi a bibułą</td><td>GE life Sciences: produkt Bibuła Chr klasy 3MM, arkusz, 46 i razy; 57 cm</td><td>3030-917</td><td>Alternatywnie można zastosować filtry nitrocelozowe (wymienione powyżej)</td></tr><tr><td>Kleszcze metalowe, sterylne</td><td>VWR/Global Science Nowa Zelandia</td><td>MURRE009/01</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego, sterylne, średnica 90 mm, objętość 68 ml, &nbsp; Objętość robocza 12,5 ml.</td><td>Interlab Nowa Zelandia</td><td>2303-1090</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne rozsiewacze szkła</td><td>VWR/Global Science Nowa Zelandia</td><td>NZNZSPREADER</td><td>Alternatywnie do rozprowadzania kultury na płytkach można użyć sterylnych kulek szklanych (wymienionych poniżej)</td></tr><tr><td>Sterylne kulki szklane</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>HERE1080603</td><td>Alternatywnie można użyć sterylnego rozsiewacza szkła do rozprowadzania kultury na płytkach (wymienionych powyżej)</td></tr><tr><td>Kwas nalidyksowy (opcjonalnie)</td><td>GoldBio.com</td><td>N-015-250</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa ampicyliny BioChemica</td><td>VWR/Global Science Nowa Zelandia</td><td>APLIA0839.0025</td><td>przygotować zgodnie z zaleceniami producenta</td></tr><tr><td>Siarczan kanamycyny BioChemica</td><td>VWR/Global Science Nowa Zelandia</td><td>APLIA1493.0010</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (Izopropyl &beta;-D-1-tiogalaktopiranozyd)&nbsp;</td><td>Thermofisher Nowa Zelandia</td><td>FMTR0393</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar granulowany</td><td>Fort Richard Laboratries/Interlab Nowa Zelandia</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>Baza bulionowa Luria (baza bulionowa Miller's LB)</td><td>Thermofisher</td><td>12795-084</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol bidestylowany 99,5 %</td><td>VWR/Global Science Nowa Zelandia</td><td>VWRC24388.320</td><td></td></tr><tr><td>15 ml sterylne stożkowe fiolki polipropylenowe&nbsp;</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>CORN430791</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek, płaskie, 1,7 ml, ultraprzezroczysty PP, z podziałką, autoklawowalne i zamrażalne</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>AXYGMCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówki wirówkowe, Falcon, PP, stożkowe, z nadrukowaną podziałką, z płaskimi nakrętkami, sterylne</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>BDAA352070</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma<</td><td>strong>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator w 37C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoklaw do sterylizacji pożywek&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

stworzenie gęstej biblioteki insercji transpozonów za pomocą koniugacji bakteryjnej w szczepach enterobakteryjnych, takich jak escherichia coli czy shigella flexneri

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Mutageneza transpozonów to metoda, która pozwala na zakłócenie genu poprzez losowe wstawianie genomu fragmentu DNA zwanego transpozonem. Poniższy protokół przedstawia metodę wysokowydajnego transferu między szczepami bakteryjnymi plazmidu zawierającego transpozon zawierający marker oporności na kanamycynę. Transpozaza przenoszona przez plazmid jest kodowana przez wariant genu tnp, który wprowadza transpozon do genomu szczepu biorcy z bardzo niskim odchyleniem insercyjnym. Metoda ta pozwala zatem na stworzenie dużych zmutowanych bibliotek, w których transpozony zostały wstawione w unikalne pozycje genomowe w biorcy szczepu bakterii Escherichia coli lub Shigella flexneri. Dzięki zastosowaniu koniugacji bakteryjnej, w przeciwieństwie do innych metod, takich jak elektroporacja czy transformacja chemiczna, można tworzyć duże biblioteki z setkami tysięcy unikalnych klonów. W ten sposób uzyskuje się biblioteki insercyjne o dużej gęstości, w których insercje występują tak często, jak co 4-6 par zasad w nieistotnych genach. Ta metoda jest lepsza od innych metod, ponieważ pozwala na niedrogą, łatwą w użyciu i wysokowydajną metodę tworzenia gęstej biblioteki wstawiania transpozonów. Biblioteka transpozonów może być wykorzystywana w dalszych zastosowaniach, takich jak sekwencjonowanie transpozonów (Tn-Seq), do wnioskowania o sieciach interakcji genetycznych lub prościej, w badaniach przesiewowych mutacji (genetyki do przodu).

Po 18 godzinach wzrostu na płytkach powinno znajdować się wiele kolonii o zróżnicowanych rozmiarach (Rysunek 3). Różne rozmiary kolonii wskazują na klony o różnej sprawności (fitness), co jest dobrym sygnałem, że protokół zadziałał. W przypadku kontroli donora i biorcy na płytkach nie powinien wystąpić wzrost. Zastosowanie powyższego protokołu powinno przynieść znacznie więcej niż 2 x 105 jednostek tworzących kolonie (CFU). Skalowanie protokołu do pięciu powtórnych konjugacji jednocześnie powinno przynieść około 1 x 106 CFU. Wcześniejsze prace, analizy z wykorzystaniem sekwencjonowania następnej generacji (NGS), wykazały, że taka skalowana biblioteka powinna przynieść &gt;2 x 105 unikalnych insercji6. Przy bardzo wysokich wartościach CFU (tj. 1 x 106 CFU) oczekuje się osiągnięcia plateau dla liczby unikalnych insercji, ponieważ wszystkie dostępne (nieletalne) insercje zostaną reprezentowane.
<img alt="Schemat koniugacji bakteryjnej: transfer plazmidu pJA1, insercja transpozonu Tn10 za pomocą IPTG, selekcja kanamycyną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1Schemat koniugacji bakteryjnej i insercji transpozonu do chromosomu. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56216/56216fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat wirowania bakterii wortexie, zmiana klarowności pożywki, wyniki eksperymentu mikrobiologicznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2Zdjęcie filtrów zanurzonych w pożywce LB przed i po mieszaniu w wstrząsarce vortex. Przed wirowaniem w vorteksie komórki przylegają do filtra, a medium jest przejrzyste. Po wirowaniu medium staje się mętne, ponieważ komórki oddzieliły się od filtra i znajdują się w medium. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56216/56216fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wzrost kolonii bakteryjnych, metoda płytkowa z agarem, eksperyment w szalce Petriego, wyniki transformacji genetycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: (A) Reprezentatywna płytka biblioteki transpozonowej po 18 h wzrostu. (B) Zbliżenie na wielkości kolonii. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56216/56216fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda tworzenia biblioteki wstawiania transpozonów o dużej gęstości w Escherichia coli lub Shigella flexneri przy użyciu koniugacji bakteryjnej. Protokół ten pozwala na stworzenie kolekcji setek tysięcy unikalnych mutantów w bakteriach poprzez losową insercję genomową transpozonu.

Stworzenie gęstej biblioteki insercji transpozonów za pomocą koniugacji bakteryjnej w szczepach enterobakteryjnych, takich jak Escherichia coli czy Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Ogólnym celem niniejszej procedury eksperymentalnej jest utworzenie biblioteki insercji transpozonów o wysokiej gęstości w Escherichia coli lub Shigella flexneri z wykorzystaniem koniugacji bakteryjnej. Technika ta pozwala na stworzenie setek tysięcy unikalnych mutantów bakteryjnych poprzez losową insercję transpozonu Tn10 do genomu. Główną zaletą tej metody jest to, że przeniesienie plazmidu zawierającego transpozon odbywa się za pomocą koniugacji bakteryjnej, a nie innych, mniej wydajnych metod, takich jak elektroporacja.Dodatkowo, sam transpozon Tn10 wstawia się do genomu z mniejszymi odchyleniami niż inne transpozony. Stosując technikę sterylną, należy przenieść jeden mililitr kultury nocnej szczepu donora do sterylnej probówki eppendorfowskiej. Probówka powinna zostać oznakowana, na przykład literą D, oznaczającą donora.Postąp analogicznie w przypadku szczepu biorcy, przenosząc jeden mililitr kultury nocnej szczepu biorcy do sterylnej probówki typu Eppendorf. Ponownie, na przykład, oznacz ją literą R, od angielskiego recipient (biorca). Wirowarkuj obie probówki przez jedną minutę przy 14 000 ×g w temperaturze pokojowej.Można to wykonać w wirówce laboratoryjnej. Podczas wirowania należy przygotować filtry do konjugacji. Używając sterylnej pęsety, należy umieścić filtr nitrocelulozowy na oznakowanej płytce z agarem LB niezawierającym antybiotyków.Alternatywnie, zamiast filtra z nitrocelulozy można zastosować sterylną papierową błonę do transferu. Należy umieścić każdy filtr na oddzielnej płytce z agarem LB, aby zminimalizować ryzyko kontaminacji. Należy upewnić się, że każdy filtr został umieszczony na odpowiednio oznakowanej płytce z agarem LB.Przygotuj trzy płytki, z których każda zawiera filtr. Jedną dla szczepu donora, jedną dla szczepu biorcy oraz jedną dla biblioteki. Po zakończeniu wirowania wyjmij kultury inkubowane przez noc.Usunąć całą pożywkę z antybiotykami z probówki Eppendorf i ją usunąć. Należy uważać, aby nie rozbić i nie poruszyć osadu komórek bakteryjnych, starając się jednocześnie usunąć całą pożywkę. Należy pamiętać o pracy w warunkach aseptycznych i wymianie końcówek między każdą próbką.Do każdej probówki typu Eppendorf dodać 110 µL świeżej pożywki LB bez antybiotyków i pipetować w górę i w dół, aby resuspendować kulturę. Należy zachować zasady aseptyki. Powtórzyć pipetowanie w górę i w dół kilka razy, aby upewnić się, że nie pozostały skupiska komórek.Krok ten wykonuje się w celu zagęszczenia hodowli bakteryjnej oraz usunięcia antybiotyków pozostałych po nocnej inkubacji. Za pomocą pipety nanieś 50 µL zagęszczonej kultury donora na filtr z napisem Donor. Dodawaj 50 µL do filtra powoli, kropla po kropli.Postąp analogicznie w przypadku szczepu biorcy, dodając kroplami 50 µl resuspensowanej kultury skoncentrowanej na filtr z biorcą. Aby doszło do koniugacji, zarówno szczep biorca, jak i szczep dawca muszą zostać naniesione na ten sam papier filtracyjny, co zapewni ich bliski kontakt fizyczny. W tym celu nanieś 50 µl szczepu dawcy oraz 50 µL szczepu biorcy na ten sam filtr na płytce oznaczonej jako library.Umieść te płytki agarowe z filtrami w temperaturze 37°C na sześć godzin. Proces konjugacji zachodzi przez sześć godzin w temperaturze 37°C. Podczas konjugacji plazmid pJA1 przenosi się do szczepu biorcy.Po konjugacji bakterie są oddzielane od filtra poprzez mieszanie w wirówce (vortexing) i indukowane 1 mM IPTG. IPTG indukuje transpozazę, a transpozon zawierający gen oporności na kanamycynę zostaje losowo wstawiony do genomu szczepu biorcy. Bakterie wysiewa się na płytki z agarem LB zawierającym kanamycynę oraz inny antybiotyk, aby wyselekcjonować szczep biorcy zawierający transpozon.Szczep biorcy jest Lambda pir ujemny, więc plazmid pJA1 zostaje utracony. Po sześciu godzinach wzrostu w temperaturze 37 °C konjugacja jest zakończona. Wyjmij płytki z filtrami z inkubatora.Za pomocą sterylnej pęsety wyjmij filtr zawierający negatywną kontrolę dawcy z płytki z agarem LB. Opukiwanie probówki, aby papier filtracyjny opadł na dno stożkowatej fiolki i upewnij się, że filtr jest całkowicie zanurzony w pożywce LB. Probówka ta zawiera 2 mL pożywki LB z IPTG o stężeniu końcowym 1 mM.Mieszaj probówkę w wstrząsarku wierzchowej (vortex) przez jedną minutę, aby oddzielić bakterie od filtra nitrocelulozowego. Pożywka LB powinna stać się mętna od komórek bakteryjnych. Powtórz tę czynność również w przypadku kontroli biorcy oraz biblioteki.Po dokładnym wymieszaniu wirówkowym filtrów zawierających komórki bakteryjne w celu odseparowania bakterii od filtra, komórki te wysiewa się na podłoża selekcyjne. Na tym etapie bakterie wysiewa się na płytki z agarem LB zawierającym kanamycynę oraz inny antybiotyk, taki jak kwas nalidiksowy. Kanamycyna jest stosowana do selekcji komórek biorcy, w których transpozon zawierający marker oporności na kanamycynę został pomyślnie wbudowany do genomu.Komórki biorcy, w których genomie nie zintegrowano markera, zostają wyeliminowane w procesie selekcji negatywnej. Do selekcji przeciwko szczepowi donora stosuje się inny antybiotyk, taki jak kwas nalidiksowy. Wykorzystany tutaj szczep donora jest wrażliwy na kwas nalidiksowy, podczas gdy szczep biorcy wykazuje oporność na kwas nalidiksowy.Używając tego drugiego antybiotyku, możliwe jest usunięcie szczepu donora. Na tym etapie należy wysiać kilka rozcieńczeń, aby wyznaczyć takie rozcieńczenie biblioteki, które daje wiele kolonii rozmieszczonych w odpowiednich odstępach. Po policzeniu i zapisaniu liczby kolonii na wszystkich płytkach zawierających bibliotekę transpozonową, niektórzy użytkownicy mogą chcieć połączyć bibliotekę w jednej probówce.Można to zrobić za pomocą sterylnego rozprowadzacza. Do szalki z agarem LB zawierającej bibliotekę transpozonów należy dodać 1 mL pożywki LB. Po dodaniu pożywki na szalkę, za pomocą sterylnego rozprowadzacza należy zeskrobać i rozdzielić bakterie z powierzchni szalki.Często nie jest możliwe usunięcie wszystkich bakterii z płytki. Należy zebrać zawiesinę bakteryjną i przelać ją do probówki stożkowej o pojemności 50 ml lub 15 ml. Czynność tę należy powtórzyć dla wszystkich płytek.Po zebraniu zawartości wszystkich płytek, należy wymieszać połączoną zawiesinę bakteryjną w wortexie przez pełną minutę, aby rozbić wszelkie aglomeraty komórek. Stanowi to teraz połączoną bibliotekę. Po inkubacji w temperaturze 37 stopni przez 18 godzin na płytkach kontrolnych dawcy i biorcy nie powinno być żadnego wzrostu.Płytki zawierające bibliotekę mutantów w idealnym przypadku powinny zawierać wiele kolonii o różnych rozmiarach. Różne wielkości kolonii wskazują na klony o różnym stopniu przystosowania i są dobrym sygnałem, że protokół zadziałał. Utworzenie gęstej biblioteki mutagenezy transpozonowej w bakteriach jest potencjalnie korzystne dla wielu późniejszych zastosowań, od odkrywania genów wirulencji i patogenów bakteryjnych, przez badanie genów niezbędnych do przeżycia, aż po identyfikację sieci oddziaływań genetycznych.Wszystkie te dalsze zastosowania opierają się na konstrukcji gęstej biblioteki insercji transpozonów. Przedstawiona tutaj metoda zapewnia prostą, szybką i niedrogą procedurę tworzenia bardzo gęstej biblioteki transpozonów w szczepach bakterii enterowych, takich jak E coli lub Shigella flexneri.

creation-dense-transposon-insertion-library-using-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano szybką i wydajną metodę wprowadzania obcego DNA o określonym znaczeniu do wcześniej przygotowanych szczepów akceptorowych, nazywanych szczepami z platformą lądowania (landing pad strains). Metoda ta umożliwia specyficzną dla miejsca integrację kasety DNA w zaprojektowanym locus platformy lądowania danego szczepu, poprzez koniugację i ekspresję integrazu ΦC31.

Inżynieria bakteryjnego chromosomu w konkretnych miejscach: wymiana kasety zapośredniczona przez integrazę $\Phi$C31 (IMCE)

Źródło: Kazi, M. I., et al., Generowanie bibliotek insercji transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych do sekwencjonowania wysokoprzepustowego. J . Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje selekcję, kwantyfikację i zachowanie bakterii biorców Gram-ujemnych przenoszących inserpozycje transpozonów w oparciu o oporność na kanamycynę.

Izolacja bakterii Gram-ujemnych z insercją transpozonów genomowych

Źródło: Erdogan, F. i wsp., Testy kojarzenia koniugacyjnego do specyficznej dla sekwencji analizy białek transferowych zaangażowanych w koniugację bakteryjną. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia procedurę przenoszenia plazmidu F od dawcy do biorcy komórek E. coli przy użyciu plazmidu ratunkowego i selekcji transkoniugantów poprzez podwójną oporność na antybiotyki. Proces obejmuje mieszanie kultur bakteryjnych, inkubację bez wstrząsania, przerywanie par kojarzeniowych i posiewanie na...

F Transfer plazmidu i podwójna selekcja antybiotyków w E. coli

Enterobacter sp. YSU rośnie w pożywce z minimalnymi solami glukozy. Auksotrofy są generowane przez przekształcenie go w transposom, który losowo wstawia się do genomu gospodarza. Mutanty są znajdowane przez replikowanie posiewu ze złożonej pożywki do minimalnej pożywki. Przerwane geny są identyfikowane przez ratowanie genów i sekwencjonowanie.

Wytwarzanie auksotrofów Enterobacter sp. YSU z wykorzystaniem mutagenezy transpozonów

Tutaj prezentujemy protokół do wyeliminowania interesującego genu zaangażowanego w koniugację plazmidu, a następnie analizujemy wpływ jego braku za pomocą testów kojarzenia. Funkcja genu jest dalej badana w określonym regionie jego sekwencji za pomocą mutacji delecyjnych lub punktowych.

Testy kojarzenia koniugacyjnego do specyficznej dla sekwencji analizy białek transferowych biorących udział w koniugacji bakteryjnej

Tutaj moc losowej insercji niekodującego elementu DNA za pośrednictwem transpozonu została wykorzystana do określenia jego optymalnej pozycji chromosomalnej.

Określenie optymalnej lokalizacji chromosomalnej dla elementu DNA w Escherichia coli przy użyciu nowatorskiego podejścia opartego na transpozonach

Opisujemy tutaj technikę, która łączy mutagenezę transpozonów z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości w celu identyfikacji i ilościowego określenia transpozonów mutantów leptospiralnych w tkankach po wyzwaniu chomików. Protokół ten może być stosowany do badań przesiewowych mutantów pod kątem przeżycia i rozprzestrzeniania się u zwierząt, a także może być stosowany w badaniach in vitro.

Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie równoległe w celu pomiaru sprawności Leptospira interrogans Mutanty insercji transpozonów podczas infekcji złotego chomika syryjskiego

Korzystanie z wektora binarnego pBIBAC-GW sprawia, że generowanie roślin transgenicznych z nienaruszonymi pojedynczymi kopiami jest łatwym procesem. W tym miejscu przedstawiono szereg protokołów, które prowadzą czytelnika przez proces generowania transgenicznych roślin Arabidopsis oraz testowania roślin pod kątem nienaruszalności i liczby kopii wkładek.

Generowanie roślin transgenicznych z insercją pojedynczej kopii przy użyciu wektora binarnego BIBAC-GW

Opisujemy metodę generowania nasyconych bibliotek mutantów transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych i późniejszego przygotowania bibliotek amplikonów DNA do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Jako przykład skupiamy się na patogenie ESKAPE, Acinetobacter baumannii, ale ten protokół jest podatny na szeroką gamę organizmów Gram-ujemnych.

Generowanie bibliotek insercji transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych w celu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

To jest dostosowana metoda identyfikacji potencjalnych czynników kolonizacji owadów w korzystnym symbiontie Burkholderia. Gospodarz chrząszcza jest zainfekowany losową zmutowaną biblioteką wygenerowaną przez mutagenezę transpozonów, a złożoność biblioteki po kolonizacji jest porównywana z kontrolą wyhodowaną in vitro.

Sekwencjonowanie insercji transpozonów jako narzędzie do wyjaśnienia czynników kolonizacji bakteryjnej u mieczyków Burkholderia gladioli z chrząszczami Lagria villosa

Poznaj metodę tworzenia gęstej biblioteki insercji transpozonów w Escherichia coli i Shigella flexneri za pomocą koniugacji bakteryjnej. Protokół umożliwia generowanie setek tysięcy unikalnych mutantów z losowymi insercjami Tn10.

Stworzenie gęstej biblioteki insercji transpozonów za pomocą koniugacji bakteryjnej w szczepach enterobakteryjnych, takich jak Escherichia coli czy Shigella flexneri (Wideo) | JoVE Journal

Stworzenie gęstej biblioteki insercji transpozonów za pomocą koniugacji bakteryjnej w szczepach enterobakteryjnych, takich jak Escherichia coli czy Shigella flexneri

Przeglądaj więcej filmów