Stworzenie gęstej biblioteki insercji transpozonów za pomocą koniugacji bakteryjnej w szczepach enterobakteryjnych, takich jak Escherichia coli czy Shigella flexneri

Ogólnym celem tej eksperymentalnej procedury jest stworzenie biblioteki insercji transpozonów o wysokiej gęstości w Escherichia coli lub Shigella flexneri przy użyciu koniugacji bakteryjnej. Technika ta pozwala na stworzenie setek tysięcy unikalnych mutantów bakteryjnych poprzez losową insercję genomową transpozonu Tn10. Główną zaletą tej techniki jest to, że transfer plazmy w momencie przechowywania transpozonu odbywa się poprzez koniugację bakteryjną, a nie inne mniej wydajne metody, takie jak elektroporacja.

Dodatkowo, sam transpozon Tn10 wstawia się do genomu z mniejszym odchyleniem niż inne transpozony. Stosując sterylną technikę, dodaj jeden mililitr nocnej hodowli szczepu dawcy do sterylnej probówki eppendorfa. Probówka powinna być oznaczona na przykład literą D, jak dawca.

Zrób to samo dla szczepu biorcy, usuwając jeden mililitr nocnej hodowli szczepu biorcy do sterylnej probówki eppendorfa. Ponownie, na przykład, oznaczone literą R, dla adresata. Odwirować obie probówki przez jedną minutę w temperaturze 14 000 G w temperaturze pokojowej.

Można to zrobić za pomocą wirówki stołowej. Podczas pracy wirówki przygotuj filtry do koniugacji. Użyj sterylnych kleszczyków, aby umieścić filtr nitrocelulozowy na oznakowanej płytce agarowej LB niezawierającej antybiotyków.

Alternatywnie zamiast filtra nitrocelulozowego można użyć sterylnej bibuły. Umieść każdy filtr na osobnej płytce agarowej LB, aby zminimalizować zanieczyszczenie. Upewnij się, że każdy filtr jest umieszczony na płytce agarowej LB, która jest odpowiednio oznakowana.

Zrób trzy płytki, z których każda zawiera filtr. Jeden dla szczepu dawcy, jeden dla szczepu biorcy i jeden dla biblioteki. Po zakończeniu wirówki usuń kultury z nocy.

Usunąć wszystkie pożywki wzrostowe zawierające antybiotyki z probówki eppendorfa i wyrzucić. Uważaj, aby nie zakłócić ani nie naruszyć palety komórek bakteryjnych, ale spróbuj usunąć wszystkie pożywki wzrostowe. Upewnij się, że pracujesz w asepcji i wymieniasz końcówki między każdą próbką.

Do każdej probówki eppendorfa dodaj 110 mikrolitrów świeżej pożywki LB bez antybiotyków i pipetuj w górę iw dół, aby ponownie zawiesić kulturę. Upewnij się, że pracujesz aseptycznie. Kilkakrotnie pipetując w górę i w dół, aby upewnić się, że nie pozostały żadne grudki komórek.

Ten krok ma na celu zagęszczenie kultury bakteryjnej i usunięcie wszelkich antybiotyków pozostałych po nocnej hodowli. Za pomocą pipety umieść 50 mikrolitrów skoncentrowanej kultury dawcy na filtrze oznaczonym jako Donor. Powoli dodawaj 50 mikrolitrów do filtra kroplami.

Zrób to samo dla szczepu biorcy, dodając 50 mikrolitrów ponownie zawieszonej kultury, skoncentrowanej ponownie zawieszonej kultury na filtrze biorcy w sposób kroplowy. Aby doszło do koniugacji, zarówno szczep biorcy, jak i szczep dawcy są dodawani do tej samej bibuły filtracyjnej, aby były w bliskim kontakcie fizycznym. W tym celu dodaj 50 mikrolitrów zarówno szczepu dawcy, jak i szczepu biorcy do tego samego filtra na tabliczce oznaczonej biblioteką.

Umieść te płytki agarowe zawierające filtry w temperaturze 37 stopni na sześć godzin. Proces koniugacji zachodzi w ciągu sześciu godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Podczas koniugacji plazmina pJA1 przemieszcza się do szczepu biorcy.

Po koniugacji bakterie są odłączane od filtra przez wirowanie i indukowane jednym milimolowym IPTG. IPTG indukuje transpozę, a transpozon zawierający gen oporności na kanamycynę jest losowo wprowadzany do genomu szczepu biorcy. Bakterie są siane na płytkach agarowych LB zawierających kanamycynę i inny antybiotyk w celu wybrania dla biorcy szczepu zawierającego transpozon.

Szczep biorcy jest Lambda pir ujemny, więc plazmina pJA1 jest tracona. Po sześciu godzinach wzrostu w temperaturze 37 stopni Celsjusza koniugacja jest zakończona. Wyjąć z inkubatora płytki zawierające filtry.

Za pomocą sterylnych kleszczyków usunąć filtr zawierający ujemną kontrolę dawcy z płytki agarowej LB. Postukaj w rurkę, aby bibuła filtracyjna znalazła się na dnie stożkowej fiolki i upewnij się, że filtr jest całkowicie zanurzony w pożywce LB. Ta probówka zawiera dwa mililitry pożywki LB z IPTG i końcowe stężenie jednego milimola.

Obracaj rurkę przez jedną minutę, aby oddzielić bakterie od filtra nitrocelulozowego. Pożywka LB powinna stać się mętna z komórkami bakteryjnymi. Powtórz tę czynność zarówno dla formantu adresata, jak i dla biblioteki.

Po dokładnym zawirowaniu filtrów zawierających komórki bakteryjne w celu oddzielenia bakterii od filtra, komórki bakteryjne są siane na wybranych pożywkach. Na tym etapie bakterie są umieszczane na płytkach agarowych LB zawierających kanamycynę i inny antybiotyk, taki jak kwas nalidyksowy. Kanamycyna służy do selekcji komórek biorców, w których transpozon zawierający marker oporności na kanamycynę został pomyślnie zintegrowany z genomem.

Komórki biorcy, które nie miały markera zintegrowanego z genomem, są selekcjonowane. Inny antybiotyk, taki jak kwas nalidyksowy, jest stosowany do selekcji przeciwko szczepowi dawcy. Zastosowany tutaj szczep dawcy jest wrażliwy na kwas nalidyksowy, podczas gdy szczep biorcy jest odporny na kwas nalidyksowy.

Za pomocą tego drugiego antybiotyku możliwe jest usunięcie szczepu dawcy. Na tym etapie należy posiać kilka rozcieńczeń, aby określić rozcieńczenie biblioteki, które daje wiele kolonii, które są odpowiednio rozmieszczone. Po zliczeniu i zapisaniu liczby kolonii na wszystkich płytkach zawierających bibliotekę transpozonów, niektórzy użytkownicy mogą chcieć zebrać lub połączyć bibliotekę w jedną probówkę.

Można to zrobić za pomocą sterylnego rozsiewacza. Dodać jeden mililitr pożywki LB do płytki agarowej LB zawierającej bibliotekę transpozonów. Po dodaniu podłoża do płytki użyj sterylnego rozsiewacza, aby zeskrobać i oddzielić bakterie od płytki.

Często nie jest możliwe usunięcie wszystkich bakterii z płytki. Usuń zawiesinę bakteryjną i umieść w stożkowym podłożu o grubości 50 mil lub 15 mil. Powtórz to dla wszystkich talerzy.

Po zeskrobaniu wszystkich płytek należy wirować zebraną zawiesinę bakteryjną przez pełną minutę, aby rozbić wszelkie grudki komórek. Jest to teraz biblioteka w puli. Po wzroście w temperaturze 37 stopni przez 18 godzin, na płytkach kontrolnych dawcy lub biorcy nie powinno być żadnego wzrostu.

Tablice zawierające bibliotekę mutantów idealnie zawierają wiele kolonii o różnych rozmiarach. Różne rozmiary kolonii wskazywały na klony o różnej sprawności i są dobrym znakiem, że protokół zadziałał. Stworzenie gęstej biblioteki mutagenezy transpozonów u bakterii jest potencjalnie korzystne dla wielu dalszych zastosowań, począwszy od odkryć genów wirulencji i patogenów bakteryjnych, poprzez badanie niezbędnych genów, aż po identyfikację sieci interakcji genetycznych.

Wszystkie te dalsze aplikacje opierają się na budowie gęstej biblioteki wstawiania transpozonów. Przedstawiona tutaj metoda zapewnia prostą, szybką i niedrogą procedurę tworzenia bardzo gęstej biblioteki transpozonów w szczepach enterobakterii, takich jak E coli lub Shigella flexneri.