Stworzenie gęstej biblioteki insercji transpozonów za pomocą koniugacji bakteryjnej w szczepach enterobakteryjnych, takich jak Escherichia coli czy Shigella flexneri

Ogólnym celem niniejszej procedury eksperymentalnej jest utworzenie biblioteki insercji transpozonów o wysokiej gęstości w Escherichia coli lub Shigella flexneri z wykorzystaniem koniugacji bakteryjnej. Technika ta pozwala na stworzenie setek tysięcy unikalnych mutantów bakteryjnych poprzez losową insercję transpozonu Tn10 do genomu. Główną zaletą tej metody jest to, że przeniesienie plazmidu zawierającego transpozon odbywa się za pomocą koniugacji bakteryjnej, a nie innych, mniej wydajnych metod, takich jak elektroporacja.

Dodatkowo, sam transpozon Tn10 wstawia się do genomu z mniejszymi odchyleniami niż inne transpozony. Stosując technikę sterylną, należy przenieść jeden mililitr kultury nocnej szczepu donora do sterylnej probówki eppendorfowskiej. Probówka powinna zostać oznakowana, na przykład literą D, oznaczającą donora.

Postąp analogicznie w przypadku szczepu biorcy, przenosząc jeden mililitr kultury nocnej szczepu biorcy do sterylnej probówki typu Eppendorf. Ponownie, na przykład, oznacz ją literą R, od angielskiego recipient (biorca). Wirowarkuj obie probówki przez jedną minutę przy 14 000 ×g w temperaturze pokojowej.

Można to wykonać w wirówce laboratoryjnej. Podczas wirowania należy przygotować filtry do konjugacji. Używając sterylnej pęsety, należy umieścić filtr nitrocelulozowy na oznakowanej płytce z agarem LB niezawierającym antybiotyków.

Alternatywnie, zamiast filtra z nitrocelulozy można zastosować sterylną papierową błonę do transferu. Należy umieścić każdy filtr na oddzielnej płytce z agarem LB, aby zminimalizować ryzyko kontaminacji. Należy upewnić się, że każdy filtr został umieszczony na odpowiednio oznakowanej płytce z agarem LB.

Przygotuj trzy płytki, z których każda zawiera filtr. Jedną dla szczepu donora, jedną dla szczepu biorcy oraz jedną dla biblioteki. Po zakończeniu wirowania wyjmij kultury inkubowane przez noc.

Usunąć całą pożywkę z antybiotykami z probówki Eppendorf i ją usunąć. Należy uważać, aby nie rozbić i nie poruszyć osadu komórek bakteryjnych, starając się jednocześnie usunąć całą pożywkę. Należy pamiętać o pracy w warunkach aseptycznych i wymianie końcówek między każdą próbką.

Do każdej probówki typu Eppendorf dodać 110 µL świeżej pożywki LB bez antybiotyków i pipetować w górę i w dół, aby resuspendować kulturę. Należy zachować zasady aseptyki. Powtórzyć pipetowanie w górę i w dół kilka razy, aby upewnić się, że nie pozostały skupiska komórek.

Krok ten wykonuje się w celu zagęszczenia hodowli bakteryjnej oraz usunięcia antybiotyków pozostałych po nocnej inkubacji. Za pomocą pipety nanieś 50 µL zagęszczonej kultury donora na filtr z napisem Donor. Dodawaj 50 µL do filtra powoli, kropla po kropli.

Postąp analogicznie w przypadku szczepu biorcy, dodając kroplami 50 µl resuspensowanej kultury skoncentrowanej na filtr z biorcą. Aby doszło do koniugacji, zarówno szczep biorca, jak i szczep dawca muszą zostać naniesione na ten sam papier filtracyjny, co zapewni ich bliski kontakt fizyczny. W tym celu nanieś 50 µl szczepu dawcy oraz 50 µL szczepu biorcy na ten sam filtr na płytce oznaczonej jako library.

Umieść te płytki agarowe z filtrami w temperaturze 37°C na sześć godzin. Proces konjugacji zachodzi przez sześć godzin w temperaturze 37°C. Podczas konjugacji plazmid pJA1 przenosi się do szczepu biorcy.

Po konjugacji bakterie są oddzielane od filtra poprzez mieszanie w wirówce (vortexing) i indukowane 1 mM IPTG. IPTG indukuje transpozazę, a transpozon zawierający gen oporności na kanamycynę zostaje losowo wstawiony do genomu szczepu biorcy. Bakterie wysiewa się na płytki z agarem LB zawierającym kanamycynę oraz inny antybiotyk, aby wyselekcjonować szczep biorcy zawierający transpozon.

Szczep biorcy jest Lambda pir ujemny, więc plazmid pJA1 zostaje utracony. Po sześciu godzinach wzrostu w temperaturze 37 °C konjugacja jest zakończona. Wyjmij płytki z filtrami z inkubatora.

Za pomocą sterylnej pęsety wyjmij filtr zawierający negatywną kontrolę dawcy z płytki z agarem LB. Opukiwanie probówki, aby papier filtracyjny opadł na dno stożkowatej fiolki i upewnij się, że filtr jest całkowicie zanurzony w pożywce LB. Probówka ta zawiera 2 mL pożywki LB z IPTG o stężeniu końcowym 1 mM.

Mieszaj probówkę w wstrząsarku wierzchowej (vortex) przez jedną minutę, aby oddzielić bakterie od filtra nitrocelulozowego. Pożywka LB powinna stać się mętna od komórek bakteryjnych. Powtórz tę czynność również w przypadku kontroli biorcy oraz biblioteki.

Po dokładnym wymieszaniu wirówkowym filtrów zawierających komórki bakteryjne w celu odseparowania bakterii od filtra, komórki te wysiewa się na podłoża selekcyjne. Na tym etapie bakterie wysiewa się na płytki z agarem LB zawierającym kanamycynę oraz inny antybiotyk, taki jak kwas nalidiksowy. Kanamycyna jest stosowana do selekcji komórek biorcy, w których transpozon zawierający marker oporności na kanamycynę został pomyślnie wbudowany do genomu.

Komórki biorcy, w których genomie nie zintegrowano markera, zostają wyeliminowane w procesie selekcji negatywnej. Do selekcji przeciwko szczepowi donora stosuje się inny antybiotyk, taki jak kwas nalidiksowy. Wykorzystany tutaj szczep donora jest wrażliwy na kwas nalidiksowy, podczas gdy szczep biorcy wykazuje oporność na kwas nalidiksowy.

Używając tego drugiego antybiotyku, możliwe jest usunięcie szczepu donora. Na tym etapie należy wysiać kilka rozcieńczeń, aby wyznaczyć takie rozcieńczenie biblioteki, które daje wiele kolonii rozmieszczonych w odpowiednich odstępach. Po policzeniu i zapisaniu liczby kolonii na wszystkich płytkach zawierających bibliotekę transpozonową, niektórzy użytkownicy mogą chcieć połączyć bibliotekę w jednej probówce.

Można to zrobić za pomocą sterylnego rozprowadzacza. Do szalki z agarem LB zawierającej bibliotekę transpozonów należy dodać 1 mL pożywki LB. Po dodaniu pożywki na szalkę, za pomocą sterylnego rozprowadzacza należy zeskrobać i rozdzielić bakterie z powierzchni szalki.

Często nie jest możliwe usunięcie wszystkich bakterii z płytki. Należy zebrać zawiesinę bakteryjną i przelać ją do probówki stożkowej o pojemności 50 ml lub 15 ml. Czynność tę należy powtórzyć dla wszystkich płytek.

Po zebraniu zawartości wszystkich płytek, należy wymieszać połączoną zawiesinę bakteryjną w wortexie przez pełną minutę, aby rozbić wszelkie aglomeraty komórek. Stanowi to teraz połączoną bibliotekę. Po inkubacji w temperaturze 37 stopni przez 18 godzin na płytkach kontrolnych dawcy i biorcy nie powinno być żadnego wzrostu.

Płytki zawierające bibliotekę mutantów w idealnym przypadku powinny zawierać wiele kolonii o różnych rozmiarach. Różne wielkości kolonii wskazują na klony o różnym stopniu przystosowania i są dobrym sygnałem, że protokół zadziałał. Utworzenie gęstej biblioteki mutagenezy transpozonowej w bakteriach jest potencjalnie korzystne dla wielu późniejszych zastosowań, od odkrywania genów wirulencji i patogenów bakteryjnych, przez badanie genów niezbędnych do przeżycia, aż po identyfikację sieci oddziaływań genetycznych.

Wszystkie te dalsze zastosowania opierają się na konstrukcji gęstej biblioteki insercji transpozonów. Przedstawiona tutaj metoda zapewnia prostą, szybką i niedrogą procedurę tworzenia bardzo gęstej biblioteki transpozonów w szczepach bakterii enterowych, takich jak E coli lub Shigella flexneri.