Testy kojarzenia koniugacyjnego do specyficznej dla sekwencji analizy białek transferowych biorących udział w koniugacji bakteryjnej

Ogólnym celem tego testu kojarzenia jest ocena wpływu mutacji w genie transferu sprzęgającego na jego zdolność do wpływania na transfer plazmidu w kontekście funkcjonalnego kompleksu sekrecji typu czwartego. Metoda ta pozwala na zadawanie pytań specyficznych dla białek, takich jak identyfikacja regionów interakcji białko-białko, które zachodzą między białkami przenoszącymi, gdy tworzą one funkcjonalny system wydzielania typu czwartego w koniugacji bakteryjnej. W tej technice geny na dużych plazmidach koniugacyjnych są eliminowane przez rekombinację homologiczną.

Funkcję genu ocenia się poprzez dostarczenie genu docelowego do nokautów na mniejszym plazmidzie. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ organizacja i konfiguracja są kluczem do pomyślnego przeprowadzenia tej procedury. Odpowiednie przygotowanie eksperymentalne jest konieczne, aby uzyskać możliwe do zinterpretowania wyniki.

Rozpocznij ten protokół od przygotowania strawionego plazmidu pBAD33 zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Uruchom każdy digest na żelu agarozowym. Używając szafki UV i sterylnej maszynki do golenia, wytnij z żelu 2,8-kilogramową opaskę podstawową, która odpowiada sekwencji cewnikowania.

Pracuj szybko, aby zminimalizować ekspozycję DNA na promieniowanie UV. Wyekstrahuj DNA z wyciętego plastra żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołem producenta. Aby wzmocnić wyekstrahowaną kasetę kota za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy lub PCR.

Przygotować mieszaninę reakcyjną w sterylnej probówce do PCR. Do rekombinacji homologicznej należy używać starterów zawierających zwisy, które są homologiczne do docelowej sekwencji genu. Ustanowić kontrolę ujemną, która zawiera te same składniki, z wyjątkiem zastąpienia matrycowego DNA wodą podwójnie destylowaną.

Ustaw również kontrolę pozytywną za pomocą matrycy DNA i starterów, które okazały się działać w reakcji PCR. Delikatnie wymieszać całą zawartość reakcji, pipetując. Następnie amplifikuj wyekstrahowaną kasetę kota przy użyciu parametrów PCR wymienionych w protokole tekstowym.

Użyj tylko pięciu mikrolitrów każdej reakcji, aby potwierdzić prawidłową wielkość amplifikacji za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Oczyść amplikon PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR z protokołem producenta. Dodaj 300 nanogramów amplifikowanej kasety kota do 50 mikrolitrów elektrokompetentnych ogniw DY330R, zawierających plazmid pOX38-Tc na lodzie.

Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby wymieszać. Powtórz ten krok, używając niezmodyfikowanego plazmidu pBAD33 jako kontroli pozytywnej. Następnie przenieś ogniwa do wstępnie schłodzonej kuwety do elektroporacji o średnicy jednego milimetra.

Elektroporuj ogniwa napięciem 1,8 kilowolta ze stałą czasową 5,5 milisekundy za pomocą elektroporatora. Natychmiast, po zastosowaniu impulsu, rozcieńczyć komórki jednym mililitrem pożywki SOC i przenieść do świeżej probówki do mikrofuge. Inkubuj komórki w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Następnie podatkować 100 mikrolitrów każdej próbki na płytki agarowe zawierające 10 mikrogramów na mililitr tetracykliny i 20 mikrogramów na mililitr chloramfenikolu. Rozprowadzić porcję na płytce za pomocą sterylnego rozsiewacza. Inkubuj płytkę do góry nogami w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia wybierz udane rekombinanty. Kaseta kota wprowadzona do komórki zostanie poddana rekombinacji homologicznej z genem będącym przedmiotem zainteresowania i stworzy klon nokautujący chloramfenikol pOX38-Tc. Oddziel elektroporację 300 nanogramów genu pK184 lub zmutowanego plazmidu genu pK184 na 50 mikrolitrów elektrokompotentnych komórek DY330R zawierających plazmid nokautujący chloramfenikolu pOX38-Tc, jak poprzednio.

Aby wygenerować komórki dawcy XK1200, wykonaj kojarzenie koniugacyjne, a następnie elektroporację w celu wygenerowania komórek XK1200, harporując zarówno nokaut chloramfenikolu, jak i plazmid PK184, jak opisano w protokole tekstowym. Przygotowanie nocnej hodowli tych komórek dawcy XK1200 w 20 mililitrach sterylnego LB z chloramfenikolem i kanamycyną. Przygotuj również komórki biorców MC4100 w 50 mililitrach LB z 50 mikrogramami na mililitr streptomycyny, używając komórek z zapasu glicerolu lub z pojedynczej kolonii na płytce agarowej.

Hoduj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 200 obr./min. Dodać glukozę do końcowego stężenia 100 milimolów do wszystkich komórek dawcy. Następnego dnia wykonaj 1 na 70 rozcieńczeń z każdej nocnej kultury osobno w dwóch mililitrach sterylnego LB z tymi samymi antybiotykami.

Wyhoduj komórki do połowy fazy logarytmicznej w temperaturze 37 stopni Celsjusza z potrząsaniem przy 200 obr./min. Odwirować kulturę komórkową w celu osadzenia komórek i odrzucenia supernatantu. Następnie umyj osad komórkowy raz zimnym sterylnym LB, aby usunąć antybiotyki.

Po odwirowaniu po raz drugi, jak poprzednio, zawieszamy komórki w dwóch mililitrach zimnego sterylnego LB.In duplikatu, podajemy 100 mikrolitrów komórek dawcy i 100 mikrolitrów komórek biorczych na 800 mikrolitrów sterylnej pożywki LB na jeden mililitr całkowitej objętości. Pozwól komórkom połączyć się w pary w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę bez wstrząsania. Po godzinie wiruj komórki przez 30 sekund, aby rozbić par godowych.

Następnie umieść komórki na lodzie na 10 minut, aby zapobiec dalszemu kryciu. Korzystając z kultur mid log i świeżego sterylnego LB, przygotuj sześć seryjnych rozcieńczeń komórek dawcy i biorcy od 1 i 100 do 1 i 10 milionów. Na każdej z dwóch połówek płytki agarowej zawierającej kwas naladiksowy, chloramfenikol i kanamycynę umieść 10 mikrolitrów porcji każdego rozcieńczenia komórek dawcy XK1200.

Powtórzyć plamienie dla rozcieńczeń biorczych komórek MC4100 na płytkach agarowych zawierających streptomycynę. Następnie inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie, używając mieszaniny wirowej i świeżego sterylnego LB, przygotuj sześć rozcieńczeń transkoniugantów.

Wybierz dla transkoniugantów komórek MC4100, które zawierają nokaut chloramfenikolu pOX38-Tc, ale wykrywając dziesięć mikrolitrowych porcji każdego rozcieńczenia na każdej połowie płytek agarowych zawierających streptomycynę i chloramfenikol. Powtórz dla obu zduplikowanych mieszanin. Następnie inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Obliczyć skuteczność krycia, zliczając liczbę kolonii z tego samego plamienia rozcieńczenia dla każdej komórki dawcy, biorcy i transkoniugantów na ich odpowiednich płytkach. Należy również policzyć kolonie biorców, aby przetestować wszelkie odchylenia wynikające z większej liczby transkoniugantów niż biorców przy danym rozcieńczeniu. Obliczyć skuteczność krycia jako liczbę kolonii transkoniugantów podzieloną przez liczbę kolonii dawcy, pomnożoną przez 100, aby uzyskać wartość wydajności na 100 komórek dawcy.

Kiedy gen układu wydzielania typu czwartego-tra-F zostaje znokautowany z plazmidu pOX38-Tc, powoduje to utratę sprzężonego transferu plazmidu pOX38-Tc traF chloramfenikolu z komórek dawcy do biorcy. Jednakże, gdy gen traF jest dostarczany w trans przez plazmid PK184 traF i komórki dawcy, obserwuje się odzyskanie sprzężonego transferu plazmidu nokautującego chloramfenikolu pOX38-Tc traF. Po zaopatrzeniu w mutanty rozcieńczenia traF i plazmidu PK184 w komórkach dawcy można zaobserwować utratę sprzężonego transferu plazmidu nokautującego pOX38-Tc traF chloramfenikolu.

Utrata transferu koniugacyjnego wskazuje na region białka ważny dla interakcji białko-białko w systemie wydzielania koniugacyjnego typu czwartego. Region ten może być następnie badany bardziej szczegółowo za pomocą mutacji punktowych, które wpływają na wydajność transferu. Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu jednego dnia roboczego z oczekiwanym czasem wzrostu.

Protokół ten można wykonać na komórkach innych niż te pokazane tutaj. Krytycznym aspektem w tym momencie jest to, że komórki dawcy i biorcy nie zawierają plazmidu, który jest przedmiotem zainteresowania. Tak więc po dodaniu plazmidu nokautującego nie otrzymasz sprzecznych wyników.

Podczas próby tej procedury ważne jest, aby być bardzo zorganizowanym, ponieważ istnieją różne warunki wzrostu i antybiotyki dla komórek dawcy, biorcy i transkoniugatu. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak krystalografia, NMR lub spektrometria mas, w celu uzyskania szczegółowego obrazu strukturalnego i funkcjonalnego białka będącego przedmiotem zainteresowania.