Name: Testy kojarzenia koniugacyjnego do specyficznej dla sekwencji analizy białek transferowych biorących udział w koniugacji bakteryjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Poznaj metodę testów kojarzeniowych do analizy białek transferowych w koniugacji bakteryjnej. Technika ta umożliwia identyfikację regionów interakcji białkowych w systemie sekrecji typu IV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Grant Odkrywczy od Kanadyjskiej Rady Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC).

<ol><li>Dobrindt, U., Hochhut, B., Hentschel, U., Hacker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+islands+in+pathogenic+and+environmental+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genomic islands in pathogenic and environmental microorganisms.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (5), 414-424 (2004).</li>
<li>Furuya, E. Y., Lowy, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial-resistant+bacteria+in+the+community+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial-resistant bacteria in the community setting.</a> Nat Rev Microbiol. 4 (1), 36-45 (2006).</li>
<li>Griffiths, A., Miller, J., Suzuki, D., Lewontin, R., Gelbart, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGriffiths%2C+A+%22An+Introduction+to+Genetic+Analysis%2C+7th+Edition%22">An Introduction to Genetic Analysis, 7th Edition</a>. , W.H. Freeman. San Fransisco. (2000).</li>
<li>Cooper, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+Speeds+Adaptation+by+Reducing+Competition+between+Beneficial+Mutations+in+Populations+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Recombination Speeds Adaptation by Reducing Competition between Beneficial Mutations in Populations of Escherichia coli.</a> PLoS Biol. Barton, N. H. 5 (9), 225(2007).</li>
<li>Lujan, S. A., Guogas, L. M., Ragonese, H., Matson, S. W., Redinbo, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupting+antibiotic+resistance+propagation+by+inhibiting+the+conjugative+DNA+relaxase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Disrupting antibiotic resistance propagation by inhibiting the conjugative DNA relaxase.</a> Proc Natl Acad Sci. 104 (30), 12282-12287 (2007).</li>
<li>Carattoli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmids+and+the+spread+of+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Plasmids and the spread of resistance.</a> Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).</li>
<li>Shala, A., Ferraro, M., Audette, G. F. Bacterial Secretion Systems: Nanomachines for Infection and Genetic Diversity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShala%2C+A+%22Handbook+of+Clinical+Nanomedicine%3A+Nanoparticles%2C+Imaging%2C+Therapy+and+Clinical+Applications%22">Handbook of Clinical Nanomedicine: Nanoparticles, Imaging, Therapy and Clinical Applications</a>. Bawa, R., Audette, G. F., Rubenstein, I. , Pan Sanford Publishing. Singapore. 657-686 (2016).</li>
<li>Tseng, T. T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+secretion+systems+in+bacterial-host+associations%2C+and+their+description+in+the+Gene+Ontology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology.</a> BMC Microbiol. 9 (1), Suppl 1 2(2009).</li>
<li>Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+diversity+of+prokaryotic+type+IV+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).</li>
<li>Lawley, T. D., Klimke, W. A., Gubbins, M. J., Frost, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F+factor+conjugation+is+a+true+type+IV+secretion+system%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">F factor conjugation is a true type IV secretion system.</a> FEMS Microbiol Lett. 224 (1), 1-15 (2003).</li>
<li>Lederberg, J., Tatum, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Recombination+in+Escherichia+Coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gene Recombination in Escherichia Coli.</a> Nature. 158 (4016), 558-558 (1946).</li>
<li>Smillie, C., Garcillan-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P. C., de la Cruz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+of+Plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Mobility of Plasmids.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).</li>
<li>Willetts, N., Skurray, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Conjugation+System+of+F-Like+Plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The Conjugation System of F-Like Plasmids.</a> Annu Rev Genet. 14 (1), 41-76 (1980).</li>
<li>Frost, L. S., Ippen-Ihler, K., Skurray, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+sequence+and+gene+products+of+the+transfer+region+of+the+F+sex+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Analysis of the sequence and gene products of the transfer region of the F sex factor.</a> Microbiol Rev. 58 (2), 162-210 (1994).</li>
<li>Audette, G. F., Manchak, J., Beatty, P., Klimke, W. A., Frost, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+exclusion+in+F-like+plasmids+requires+intact+TraG+in+the+donor+that+recognizes+its+cognate+TraS+in+the+recipient%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Entry exclusion in F-like plasmids requires intact TraG in the donor that recognizes its cognate TraS in the recipient.</a> Microbiology. 153, Pt 2 442-451 (2007).</li>
<li>Christie, P. J., Atmakuri, K., Krishnamoorthy, V., Jakubowski, S., Cascales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+Architecture%2C+and+Function+of+Bacterial+Type+Iv+Secretion+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, Architecture, and Function of Bacterial Type Iv Secretion Systems.</a> Annu Rev Microbiol. 59 (1), 451-485 (2005).</li>
<li>Christie, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IV+secretion%3A+the+Agrobacterium+VirB%2FD4+and+related+conjugation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+-+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Type IV secretion: the Agrobacterium VirB/D4 and related conjugation systems.</a> Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1694 (1-3), 219-234 (2004).</li>
<li>Bhatty, M., Laverde Gomez, J. a, Christie, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expanding+bacterial+type+IV+secretion+lexicon%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The expanding bacterial type IV secretion lexicon.</a> Res Microbiol. 164 (6), 620-639 (2013).</li>
<li>Christie, P. J., Cascales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+dynamic+properties+of+bacterial+Type+IV+secretion+systems+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and dynamic properties of bacterial Type IV secretion systems (Review).</a> Mol Membr Biol. 22 (1-2), 51-61 (2005).</li>
<li>Christie, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IV+secretion%3A+Intercellular+transfer+of+macromolecules+by+systems+ancestrally+related+to+conjugation+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Type IV secretion: Intercellular transfer of macromolecules by systems ancestrally related to conjugation machines.</a> Mol Microbiol. 40 (2), 294-305 (2001).</li>
<li>Christie, P. J., Whitaker, N., González-Rivera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+structure+of+the+bacterial+type+IV+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mechanism and structure of the bacterial type IV secretion systems.</a> Biochim Biophys Acta. 1843 (8), 1578-1591 (2014).</li>
<li>Cascales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+type+VI+secretion+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The type VI secretion toolkit.</a> EMBO Rep. 9, 735(2008).</li>
<li>Silverman, J. M., Brunet, Y. R., Cascales, E., Mougous, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Regulation+of+the+Type+VI+Secretion+System%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structure and Regulation of the Type VI Secretion System.</a> Annu Rev Microbiol. 66 (1), 453-472 (2012).</li>
<li>Chandran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+outer+membrane+complex+of+a+type+IV+secretion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the outer membrane complex of a type IV secretion system.</a> Nature. 462 (7276), 1011-1015 (2009).</li>
<li>Rivera-Calzada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+bacterial+type+IV+secretion+core+complex+at+subnanometre+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structure of a bacterial type IV secretion core complex at subnanometre resolution.</a> EMBO J. 32 (8), 1195-1204 (2013).</li>
<li>Waksman, G., Fronzes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+bacterial+type+IV+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of bacterial type IV secretion systems.</a> Trends Biochem Sci. 35, 691(2010).</li>
<li>Fronzes, R., Christie, P. J., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+biology+of+type+IV+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The structural biology of type IV secretion systems.</a> Nat Rev Microbiol. 7 (10), 703-714 (2009).</li>
<li>Kaplan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+a+cell-embedded+megadalton+protein+complex+by+DNP-supported+solid-state+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR.</a> Nat Methods. 12 (7), 5-9 (2015).</li>
<li>Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+sex-factor-affinity+site+in+E.+coli+as+gamma+delta%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a sex-factor-affinity site in E. coli as gamma delta.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 45, Pt 1 135-140 (1981).</li>
<li>Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+pilus+in+recipient+cell+recognition+during+bacterial+conjugation+mediated+by+F-like+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids.</a> Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).</li>
<li>Jobling, M. G., Holmes, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+vectors+with+the+pl5a+replicon%2C+kanamycin+resistance%2C+inducible+lacZ%CE%B1+and+pUC18+or+pUC19+multiple+cloning+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Construction of vectors with the pl5a replicon, kanamycin resistance, inducible lacZα and pUC18 or pUC19 multiple cloning sites.</a> Nucleic Acids Res. 18 (17), 5315(1990).</li>
<li>Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+regulation%2C+modulation%2C+and+high-level+expression+by+vectors+containing+the+arabinose+P%28BAD%29+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose P(BAD) promoter.</a> J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+recombination+system+for+chromosome+engineering+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5978-5983 (2009).</li>
<li>Lawley, T. D., Gilmour, M. W., Gunton, J. E., Standeven, L. J., Taylor, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+Mutational+Analysis+of+Conjugative+Transfer+Region+1+%28Tra1%29+from+the+IncHI1+Plasmid+R27%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Functional and Mutational Analysis of Conjugative Transfer Region 1 (Tra1) from the IncHI1 Plasmid R27.</a> J Bacteriol. 184 (8), 2173-2180 (2002).</li>
<li>Elton, T. C., Holland, S. J., Frost, L. S., Hazes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-Like+Type+IV+Secretion+Systems+Encode+Proteins+with+Thioredoxin+Folds+That+Are+Putative+DsbC+Homologues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">F-Like Type IV Secretion Systems Encode Proteins with Thioredoxin Folds That Are Putative DsbC Homologues.</a> J Bacteriol. 187 (24), 8267-8277 (2005).</li>
<li>Hazes, B., Frost, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+systems+biology+approach+to+study+type+II%2FIV+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Towards a systems biology approach to study type II/IV secretion systems.</a> Biochim Biophys Acta. 1778, 1839-1850 (2008).</li>
<li>Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDX-MS+and+deletion+analysis+of+the+type+4+secretion+system+protein+TraF+from+the+Escherichia+coli+F+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid.</a> FEBS Lett. Tsolis, R. 590 (3), 376-386 (2016).</li>
<li>Audette, G. F., Van Schaik, E. J., Hazes, B., Irvin, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-binding+protein+nanotubes%3A+Learning+from+nature%27s+nanotech+examples%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">DNA-binding protein nanotubes: Learning from nature's nanotech examples.</a> Nano Lett. 4, 1897-1902 (2004).</li>
<li>Harris, R. L., Silverman, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tra+proteins+characteristic+of+F-like+type+IV+secretion+systems+constitute+an+interaction+group+by+yeast+two-hybrid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tra proteins characteristic of F-like type IV secretion systems constitute an interaction group by yeast two-hybrid analysis.</a> J Bacteriol. 186 (16), 5480-5485 (2004).</li>
<li>Moore, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+F-Plasmid+Conjugative+Transfer+Gene+traU%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the F-Plasmid Conjugative Transfer Gene traU.</a> J Bacteriol. 172 (8), 4263-4270 (1990).</li>
<li>Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+pilus+in+recipient+cell+recognition+during+bacterial+conjugation+mediated+by+F-like+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids.</a> Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).</li>
<li>Klimke, W. A., Frost, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+the+role+of+the+transfer+gene%2C+traN%2C+of+the+F+and+R100-1+plasmids+in+mating+pair+stabilization+during+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of the role of the transfer gene, traN, of the F and R100-1 plasmids in mating pair stabilization during conjugation.</a> J Bacteriol. 180 (16), 4036-4043 (1998).</li>
<li>Jiang, W., Marraffini, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas%3A+New+Tools+for+Genetic+Manipulations+from+Bacterial+Immunity+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems.</a> Annu Rev Microbiol. 69 (1), 209-228 (2015).</li>
<li>Dahlberg, C., Bergstrom, M., Andreasen, M., Christensen, B. B., Molin, S., Hermansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+bacterial+conjugation+by+plasmids+from+marine+environments+visualized+by+gfp+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Interspecies bacterial conjugation by plasmids from marine environments visualized by gfp expression.</a> Mol Biol Evol. 15 (4), 385-390 (1998).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Proces koniugacji bakterii zapewnia sposób, w jaki bakterie mogą rozprzestrzeniać geny, zapewniając ewolucyjną przewagę w rozwoju w trudnych warunkach, takich jak rozprzestrzenianie się markerów oporności na antybiotyki. Ponieważ wiele plazmidów koniugacyjnych jest tak dużych, badania funkcjonalne białek biorących udział w tworzeniu aparatu transferowego poprzez mutację genów docelowych na samym plazmidzie koniugacyjnym są nieporęczne. Protokoły wyszczególnione w niniejszym dokumencie zapewniają środki, za pom...

Transfer genów i białek na poziomie mikroorganizmów odgrywa kluczową rolę w przetrwaniu i ewolucji bakterii, jak również w procesach infekcji. Wymiana DNA między bakteriami lub między bakterią a komórką może być osiągnięta poprzez transformację, koniugację lub transdukcję wektorową. 1,2 Koniugacja jest wyjątkowa w porównaniu z transformacją i transdukcją, ponieważ podczas koniugacji między bakteriami Gram-ujemnymi, takimi jak Escherichia coli, transfer DNA zachodzi w sposób kontrolowany przez dawcę, w którym złożony system makromolekularny łączy komórki dawcy i biorcy. Koniugacja jest również najbardziej bezpośrednim sposobem, w jaki komórki bakteryjne oddziałują z komórkami gospodarza w celu wstrzyknięcia genów, białek lub substancji chemicznych do systemów gospodarza. 3 Dość często przenoszenie takich czynników ma niezwykły wpływ na gospodarza, począwszy od patogenezy i kancerogenezy, a skończywszy na ewolucji i adaptacji gospodarza. Wykazano, że rekombinacja koniugacyjna zwiększa 3-krotnie szybkość adaptacji u bakterii o wysokim wskaźniku mutacji w warunkach stresu środowiskowego. 4 Co więcej, koniugacja jest zdecydowanie najczęstszą drogą, za pomocą której rozprzestrzeniają się geny oporności na antybiotyki w szczepach bakteryjnych. 5,6 TGL
Mikroorganizmy wyewoluowały wyspecjalizowane systemy wydzielania, aby wspierać przenoszenie makrocząsteczek przez błony komórkowe; obecnie istnieje 9 typów systemów wydzielania (TSS) u bakterii Gram-ujemnych, które zostały opisane: T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS, a także szlaki Sec (wydzielanie) i Tat (translokacja dwu-argininowa). 7,8 Każdy typ systemu wydzielania jest dalej podzielony na różne podtypy, co jest konieczne ze względu na różnorodność białek i odrębność zaangażowanych szlaków w różnych szczepach bakteryjnych. Na przykład w systemie wydzielania typu IV (T4SS) systemy Ti i Cag ułatwiają transport efektorowy, podczas gdy F-plazmid, R27 i pKM101 T4SS ułatwiają transfer plazmidu sprzężonego. 7,9,10 Szczegółowe zrozumienie mechanizmów, za pomocą których organizmy składają swoje odpowiednie systemy wydzielania z białek składowych i dzielą zawartość komórkową z biorcą lub otaczającym go środowiskiem, jest ważnym czynnikiem w rozwoju ukierunkowanych strategii zwalczania drobnoustrojów chorobotwórczych i procesów infekcji komórkowych.
Po wstępnej identyfikacji koniugacji bakteryjnej w E. coli przez Lederberga i Tatuma,11 zidentyfikowano i scharakteryzowano dużą liczbę plazmidów ruchomych i koniugacyjnych. 12 Takie ruchome plazmidy wykazują znaczny zakres wielkości (od 1 do ponad 200 kilozasad (kb)), jednak wszystkie ruchome plazmidy zawierają relaksazę, która rozpoznaje początek transferu (oriT), umożliwiając w ten sposób transmisję plazmidu. Plazmidy koniugacyjne dodatkowo kodują geny do składania funkcjonalnego T4SS, a także białka sprzęgającego typu IV. 12 Na przykład plazmid F E. coli o wielkości 100 kb koduje wszystkie geny koniugacyjne w regionie transferu (tra) o długości 33,3 kB. 13 Geny w regionie tra plazmidu F kodują wszystkie białka, które ułatwiają tworzenie pilusa, tworzenie par godowych (Mpf), transfer DNA i funkcje wykluczania podczas sprzężonego transferu plazmidu. 10,14,15 Znaczna część wiedzy na temat koniugacyjnych T4SS jest dostępna, jednak szczegółowe badania strukturalne białek i kompleksów koniugacyjnych stają się dostępne dopiero niedawno. 16-28 Rozdział 16-28
Aby stworzyć całościowy obraz procesu koniugacyjnego, wymagane jest połączenie szczegółowych badań strukturalnych z analizami mutacji sprzęganych białek transferowych. Można to osiągnąć za pomocą testów kojarzenia koniugacyjnego. W przypadku plazmidu F każde białko kodowane w regionie tra odgrywa rolę w koniugacji za pośrednictwem F; w związku z tym nokaut / delecja genu transferowego zniesie zdolność koniugacyjną komórki (ryc. 1). Podczas gdy mniejsze ruchome plazmidy bardziej sprzyjają standardowym procedurom delecji, w przypadku większych plazmidów sprzężonych, takich jak F, nokauty genów są łatwiejsze do osiągnięcia poprzez rekombinację homologiczną, w której gen docelowy jest zastępowany genem przenoszącym odrębny gen oporności na antybiotyki. W obecnym protokole stosujemy rekombinację homologiczną w celu zastąpienia interesującego genu transferu acetylotransferazą chloramfenikolu (CAT) w pochodnej plazmidu F o pojemności 55 kb pOX38-Tc; 29,30 powstały plazmid nokautujący, pOX38-Tc Δgene::Cm, zwiększa odporność na obecność chloramfenikolu (Cm) w pożywce wzrostowej. Komórki dawcy zawierające pOX38-Tc Δgen::Cm nie są w stanie wpływać na sprzęgany transfer/kojarzenie DNA, co zaobserwowano za pomocą testu kojarzenia; skuteczność krycia komórki dawcy pOX38-Tc Δgene::Cm i normalnego biorcy zmniejszy się lub, częściej, zostanie zniesiona. Sprzężony transfer plazmidu Δgen pOX38-Tc::Cm może zostać przywrócony za pomocą małego plazmidu regeneracyjnego, w którym znajduje się gen docelowego transferu. Ten plazmid regeneracyjny może być taki, który zapewnia konstytutywną ekspresję, taki jak plazmid pK184 (gen pK184) lub taki, który zapewnia indukowaną ekspresję, o ile plazmid prawidłowo kieruje gen do właściwego miejsca w komórce (cytoplazma lub peryplazma). W związku z tym, w testach kojarzenia między tym nowym dawcą (zawierającym plazmidy genu pOX38-Tc Δgene::Cm + pK184-gen) a komórką biorcy, oczekuje się, że skuteczność krycia powróci do prawie takiej samej jak w normalnym teście kojarzenia dawca-biorca. System ten umożliwia badanie funkcji znokautowanego genu poprzez generowanie serii konstruktów genu pK184 (delecje lub mutacje punktowe) i testowanie zdolności każdego konstruktu do przywrócenia zdolności kojarzenia pOX38-Tc Δgen::Cm zawierającego komórki dawcy.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do mini-przygotowania plazmidu GeneJet</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu GeneJet</td> Zestaw do oczyszczania GeneJet PCR <td>Fisher Scientific</td><td>K0692</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce</td> Fisher Scientific K0702 <td></td><td></td> Q5 New England Biolabs E0554S Drabina <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> DNA o szerokim zakresie New England Biolabs <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>N0303A Szalki</td><td></td></tr><tr><td>Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>Eppendorf</td><td>4309000027</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety do elektroporacji</td><td>Kuwety Fisher Scientific</td><td>FB101</td><td>mają odstęp 1 mm.</td></tr><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AvaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0152S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104L</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA Polimeraza New</td><td>England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td><silny>Antybiotyki</silny></td><td></td><td></td><td><silny>Stężenia końcowe</silny></td></tr><tr><td>Chloramfenikol (cm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td>20 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Kanamycyny (km)</td><td>BioBasic Inc.</td><td>DB0286</td><td>50 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>kwasu nalidyksowego (Nal)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8878-25G</td><td>10 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Ryfampicyna (Rif)</td><td>Calbiochem</td><td>557303</td><td>20 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Tetracyklina (Tc)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td>10 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Streptomycyna (Sm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP910-50</td><td>50 &micro; g/ml</td></tr></tbody></table>

testy kojarzenia koniugacyjnego do specyficznej dla sekwencji analizy białek transferowych biorących udział w koniugacji bakteryjnej

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Transfer materiału genetycznego przez koniugację bakteryjną to proces, który odbywa się za pośrednictwem kompleksów utworzonych przez specyficzne białka transferowe. W Escherichia coli te białka transferowe tworzą maszynerię transferu DNA znaną jako tworzenie par godowych lub kompleks transferu DNA, który ułatwia sprzężony transfer plazmidu. Celem tego artykułu jest przedstawienie metody, którą można wykorzystać do określenia roli specyficznego białka transferowego, które bierze udział w koniugacji przy użyciu serii delecji i/lub mutacji punktowych w połączeniu z testami kojarzenia. Gen docelowy jest wybijany na plazmidzie sprzężonym, a następnie jest dostarczany w trans za pomocą małego plazmidu regeneracyjnego, w którym znajduje się gen docelowy. Mutacje wpływające na gen docelowy na plazmidzie regeneracyjnym mogą ujawnić informacje o funkcjonalnych aspektach białka docelowego, które skutkują zmianą skuteczności kojarzenia komórek dawcy zawierających zmutowany gen. Zmiany w wydajności krycia dostarczają informacji na temat roli i znaczenia konkretnego białka transferowego lub jego regionu w ułatwianiu sprzężonego transferu DNA. Sprzężenie tego testu kojarzenia ze szczegółowymi trójwymiarowymi badaniami strukturalnymi zapewni kompleksowe zrozumienie funkcji sprzężonego białka przenoszenia, a także zapewni środki do identyfikacji i charakteryzowania regionów interakcji białko-białko.

Proces koniugacji bakteryjnej napędzanej plazmidem F jest skoordynowanym procesem obejmującym białka transferowe w regionie tra plazmidu F, które montują T4SS w celu ułatwienia syntezy pilusa i transferu koniugacyjnego DNA. Białko TraF (GenBank accession # BAA97961; UniProt ID P14497) jest niezbędne do formowania koniugacyjnego pilusa F.10,14,35-37 Białko to zawiera domenę podobną do tioredoksyny na końcu C, choć nie posiada katalitycznego motywu ...

Tutaj prezentujemy protokół do wyeliminowania interesującego genu zaangażowanego w koniugację plazmidu, a następnie analizujemy wpływ jego braku za pomocą testów kojarzenia. Funkcja genu jest dalej badana w określonym regionie jego sekwencji za pomocą mutacji delecyjnych lub punktowych.

Testy kojarzenia koniugacyjnego do specyficznej dla sekwencji analizy białek transferowych biorących udział w koniugacji bakteryjnej

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Ogólnym celem tego testu kojarzenia jest ocena wpływu mutacji w genie transferu sprzęgającego na jego zdolność do wpływania na transfer plazmidu w kontekście funkcjonalnego kompleksu sekrecji typu czwartego. Metoda ta pozwala na zadawanie pytań specyficznych dla białek, takich jak identyfikacja regionów interakcji białko-białko, które zachodzą między białkami przenoszącymi, gdy tworzą one funkcjonalny system wydzielania typu czwartego w koniugacji bakteryjnej. W tej technice geny na dużych plazmidach koniugacyjnych są eliminowane przez rekombinację homologiczną.Funkcję genu ocenia się poprzez dostarczenie genu docelowego do nokautów na mniejszym plazmidzie. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ organizacja i konfiguracja są kluczem do pomyślnego przeprowadzenia tej procedury. Odpowiednie przygotowanie eksperymentalne jest konieczne, aby uzyskać możliwe do zinterpretowania wyniki.Rozpocznij ten protokół od przygotowania strawionego plazmidu pBAD33 zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Uruchom każdy digest na żelu agarozowym. Używając szafki UV i sterylnej maszynki do golenia, wytnij z żelu 2,8-kilogramową opaskę podstawową, która

conjugative-mating-assays-for-sequence-specific-analysis-transfer

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Opisano szybką i wydajną metodę wprowadzania obcego DNA o określonym znaczeniu do wcześniej przygotowanych szczepów akceptorowych, nazywanych szczepami z platformą lądowania (landing pad strains). Metoda ta umożliwia specyficzną dla miejsca integrację kasety DNA w zaprojektowanym locus platformy lądowania danego szczepu, poprzez koniugację i ekspresję integrazu ΦC31.

Inżynieria bakteryjnego chromosomu w konkretnych miejscach: wymiana kasety zapośredniczona przez integrazę $\Phi$C31 (IMCE)

Źródło: Erdogan, F. i wsp., Testy kojarzenia koniugacyjnego do specyficznej dla sekwencji analizy białek transferowych zaangażowanych w koniugację bakteryjną. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia procedurę przenoszenia plazmidu F od dawcy do biorcy komórek E. coli przy użyciu plazmidu ratunkowego i selekcji transkoniugantów poprzez podwójną oporność na antybiotyki. Proces obejmuje mieszanie kultur bakteryjnych, inkubację bez wstrząsania, przerywanie par kojarzeniowych i posiewanie na...

F Transfer plazmidu i podwójna selekcja antybiotyków w E. coli

Opisujemy tutaj trzy różne protokoły do badania in vitro koniugacji, transdukcji i naturalnej transformacji u Staphylococcus aureus.

Metodologia badania horyzontalnego transferu genów u Staphylococcus aureus

Mając na celu zrozumienie zachowań różnych bakteryjnych elementów koniugującego DNA w różnych warunkach, opisujemy protokół wykrywania różnic w częstotliwości koniugacji, z wysoką rozdzielczością, aby oszacować, jak skutecznie bakteria dawcy inicjuje koniugację.

Porównanie częstości koniugacji bakteryjnej w wysokiej rozdzielczości

Tutaj prezentujemy protokół opisujący, jak i) złożyć samoreplikujący się wektor za pomocą modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate, ii) wprowadzić wektor do sinicowego gospodarza przez koniugację, oraz iii) scharakteryzować transgeniczne szczepy sinic za pomocą czytnika płytek lub cytometrii przepływowej.

Modyfikacja genetyczna cyjanobakterii przez koniugację przy użyciu modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate

Opisujemy metodę generowania nasyconych bibliotek mutantów transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych i późniejszego przygotowania bibliotek amplikonów DNA do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Jako przykład skupiamy się na patogenie ESKAPE, Acinetobacter baumannii, ale ten protokół jest podatny na szeroką gamę organizmów Gram-ujemnych.

Generowanie bibliotek insercji transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych w celu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Tutaj opisujemy budowę mutantów zerowych Aeromonas w określonych glikozylotransferazach lub regionach zawierających glikozylotransferazy, testy ruchliwości i oczyszczanie wici przeprowadzone w celu ustalenia udziału i funkcji kodowanych przez nie enzymów w biosyntezie glikanu, a także rolę tego glikanu w patogenezie bakterii.

Generowanie mutantów zerowych w celu wyjaśnienia roli glikozylotransferaz bakteryjnych w ruchliwości bakterii

Koniugacja pośredniczy w poziomym transferze genów poprzez mobilizację plazmidowego DNA przez dwie różne komórki, ułatwiając rozprzestrzenianie korzystnych genów. W pracy opisano szeroko stosowaną metodę skutecznego wykrywania sprzęgającego transferu plazmidu, opartą na zastosowaniu markerów różnicowych u plazmidu koniugacyjnego, dawcy i biorcy w celu wykrycia transkoniugacji.

Wykrywanie horyzontalnego transferu genów, w którym pośredniczą naturalne plazmidy koniugacyjne w E. coli

W tym manuskrypcie opisujemy protokół do funkcjonalnego badania transkrypcji i hamującej aktywności środków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na bakteryjną transkrypcję.

In vitro Testy transkrypcji i ich zastosowanie w odkrywaniu leków

Tutaj prezentujemy protokół, który ułatwia funkcjonalną charakterystykę genów i konstruktów promotorowych w wtórnej tkance pnia drzewa w stosunkowo krótkim czasie. Jest wydajny, łatwy w użyciu i ma szerokie zastosowanie w przypadku wielu gatunków drzew.

Wykorzystanie indukowanej analizy sektora somatycznego (ISSA) do badania genów i promotorów zaangażowanych w tworzenie drewna i wtórny rozwój łodyg

Poznaj metodę testów kojarzeniowych do analizy białek transferowych w koniugacji bakteryjnej. Technika ta umożliwia identyfikację regionów interakcji białkowych w systemie sekrecji typu IV.

Testy kojarzenia koniugacyjnego do specyficznej dla sekwencji analizy białek transferowych biorących udział w koniugacji bakteryjnej (Wideo) | JoVE Journal

Testy kojarzenia koniugacyjnego do specyficznej dla sekwencji analizy białek transferowych biorących udział w koniugacji bakteryjnej

Przeglądaj więcej filmów