Optymalizacja, projektowanie i unikanie pułapek w manualnej multipleksowej immunohistochemii fluorescencyjnej

Multipleksowa immunohistochemia fluorescencyjna identyfikuje wiele typów komórek i ich lokalizacje w nienaruszonej, utrwalonej w formalinie tkance zatopionej w parafinie, umożliwiając nie tylko identyfikację komórek, ale także analizę przestrzenną między komórkami. Główną zaletą tej ręcznej techniki jest zastosowanie wielu przeciwciał tego samego gatunku bez reaktywności krzyżowej. Technika ta pozwala na dogłębny wgląd w interakcje komórek odpornościowych i nowotworowych w mikrośrodowisku guza.

Wypróbowując tę technikę po raz pierwszy, poczekaj na około trzy do czterech dni barwienia i całkowicie śledź każdy krok podczas procesu. Słabsza metoda procesu barwienia i projekt multipleksu mają kluczowe znaczenie dla zmniejszenia typowych i oczekiwanych pułapek. Zacznij od deparafinizacji i ponownego nawodnienia szkiełek.

Ułóż je w piekarniku do hybrydyzacji chusteczką do góry i piecz w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez godzinę. Wyjmij szkiełka z piekarnika i pozwól im ostygnąć przez pięć do 10 minut na pionowym stojaku na prowadnice. Następnie użyj zestawu do barwienia szkiełek, aby potraktować szkiełka trzy razy ksylenem i raz 100% etanolem, 95% etanolem i 70% etanolem przez 10 minut każde.

Umyj stojak szkiełek wodą dejonizowaną, a następnie zamocuj szkiełka, zanurzając je w neutralnej buforowanej formalinie na 30 minut. Myć szkiełka wodą przez dwie minuty i kontynuować pobieranie antygenu. Umieść stojak ze szkiełkami w żaroodpornym pudełku wypełnionym buforem do odzyskiwania antygenu o pH 6,0 lub pH 9,0.

Przykryj pudełko folią i zabezpiecz gumką. Umieść pudełko w kuchence mikrofalowej wyposażonej w inwerter na krawędzi obracającej się płyty i podgrzewaj szkiełka przez 45 sekund przy 100% mocy, a następnie 15 minut przy 20% mocy. Pozwól szkiełkom ostygnąć przez 15 do 20 minut po podgrzaniu w kuchence mikrofalowej.

W międzyczasie przygotuj roztwory robocze przeciwciał i fluoroforów. Przygotować pierwszorzędowy rozcieńczalnik przeciwciał, rozpuszczając 0,5 grama granulek białka bydlęcego w 50 mililitrach TBST lub 1X PBS. Rozcieńczyć każdy roztwór roboczy przeciwciała pierwszorzędowego do wcześniej określonego zoptymalizowanego stężenia.

Rozcieńczyć każdy fluorofor w rozcieńczalniku fluoroforowym w stężeniu od jednego do 100. W ostatnim dniu barwienia przygotuj roztwór roboczy DAPI, dodając trzy krople DAPI do jednego mililitra TBST. Po ostygnięciu szkiełka wyjmij je z kuchenki mikrofalowej i zdejmij folię.

Myj je wodą dejonizowaną przez dwie minuty, a następnie przez dwie minuty myj TBST. Po umyciu osusz szkiełko wokół chusteczki delikatną chusteczką i obrysuj po zewnętrznej stronie chusteczki hydrofobowym pisakiem barierowym, uważając, aby nie dotknąć chusteczki ani nie pozostawić jej do wyschnięcia. Umieść każde szkiełko w komorze nawilżacza i dodaj około czterech kropli roztworu blokującego do tkanki.

Następnie inkubować szkiełka przez 10 minut w temperaturze pokojowej i przystąpić do aplikacji przeciwciał pierwotnych. Usuń roztwór blokujący z każdego szkiełka, stukając bokiem szkiełka w stos ręczników papierowych i użyj delikatnej chusteczki do zadań, aby usunąć pozostały roztwór. Umieść szkiełko z powrotem w wilgotnej komorze, dodaj około 200 mikrolitrów działającego przeciwciała pierwszorzędowego i inkubuj przez godzinę.

Po inkubacji umyj szkiełka trzy razy, zanurzając je w TBST na dwie minuty na mycie. Zetrzyj pozostałą TBST z każdego szkiełka i nałóż około trzech do czterech kropli przeciwciała drugorzędowego. Inkubuj szkiełka w wilgotnej komorze przez 10 minut.

Ponownie umyć szkiełka TBST i nałożyć około 100 mikrolitrów roztworu roboczego fluoroforu. Włóż szkiełka z powrotem do nawilżonej komory i inkubuj przez 10 minut. Powtórzyć płukanie TBST, a następnie podgrzać szkiełka w kuchence mikrofalowej zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, aby usunąć przeciwciała.

Ważną rzeczą, o której należy pamiętać podczas tego wielodniowego procesu barwienia, jest zatrzymanie się po etapie podgrzewania w kuchence mikrofalowej i pozostawienie szkiełek w buforze do odzyskiwania antygenu na noc, zapewniając integralność tkanek i barwników. Usunąć ostatnie podanie przeciwciała roztworem do pobierania antygenu i umyć szkiełka wodą dejonizowaną, a następnie TBST przez dwie minuty na mycie. Powtórz kroki barwienia dla pozostałych par fluroforów przeciwciał, a następnie przystąp do aplikacji DAPI.

Nałóż około 150 mikrolitrów roboczego roztworu DAPI na każde szkiełko i inkubuj je w wilgotnej komorze przez 10 minut. Po inkubacji umyć szkiełka preparatem TBST przez około 30 sekund i założyć szkiełka nakrywkowe. Po wyschnięciu nośnika montażowego nałóż przezroczysty lakier do paznokci w czterech rogach szkiełka nakrywkowego, aby go zabezpieczyć.

Aby przeanalizować monopleks, zobrazuj szkiełka pod mikroskopem z 250-milisekundową ekspozycją za pomocą DAPI do ustawiania ostrości. Oceń każdy slajd monopleksowy, patrząc na intensywność fluorescencji barwionego markera i porównaj tę intensywność z tłem. Użyj pozycji slajdu w końcowym multipleksie, jeśli intensywność zabarwionego znacznika jest co najmniej pięć razy większa niż tło.

Podczas barwienia multipleksu wybierz odpowiednią kolejność dla każdego przeciwciała i przypisz każdy fluorofor do przeciwciała. Kontynuuj barwienie multipleksu zgodnie z wcześniejszym opisem i przygotuj puste szkiełko, które otrzyma rozcieńczalnik przeciwciał, rozcieńczalnik fluoroforowy i TBST zamiast pierwszorzędowego przeciwciała, fluoroforu lub DAPI. Gdy będziesz gotowy do zobrazowania multipleksu pod mikroskopem, ustaw ekspozycję na 250 milisekund dla wszystkich kanałów i uchwyć każdy obraz za pomocą DAPI do ustawiania ostrości.

Następnie użyj oprogramowania analitycznego, aby ocenić każdy multipleks za pomocą fluorescencyjnego fałszywego koloru i widoku patologii, który potwierdzi specyficzność każdego markera. Aby zapewnić powodzenie testu multipleksowego, należy przeprowadzić test monopleksowy w celu określenia kolejności każdego przeciwciała. Na przykład, gdy Foxp3 znajduje się na trzeciej pozycji matrycy, demonstrowane jest specyficzne i wytrzymałe barwienie oraz kolokalizacja z CD3.

W przeciwieństwie do tego, gdy Foxp3 znajduje się na pierwszej pozycji, następuje niespecyficzne barwienie Foxp3. Ziarniste i wylewne obszary czerwieni są obecne na większości slajdu, a intensywność fluorescencji tych obszarów jest niska. Kolejnym ważnym krokiem w tym teście jest barwienie przeciwstawne DEPI, które jest podstawą do identyfikacji komórek i dalszej analizy.

Można zauważyć wyraźny kontrast między obrazami z działającym i niedziałającym DAPI. W przypadku testu multipleksowego piękne obrazy kompozytowe nie zawsze odzwierciedlają dokładne zabarwienie. Podczas gdy CD3 jest wizualizowany i wykazuje specyficzne barwienie, patologiczny widok jasnego pola CD163 dowodzi, że przeciwciało jest niespecyficzne.

Optymalny obraz multipleksowy wykazuje specyficzne barwienie w obrazie złożonym, a swoistość CD3 i CD163 jest potwierdzana za pomocą widoku jasnego pola patologii. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić obliczenia autofenotypowania i analizy przestrzennej w celu dalszej analizy interakcji między komórkami. Technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania przestrzennych wzorców komórek i nienaruszonych tkanek, pogłębiając naszą wiedzę na temat mikrośrodowiska immunologicznego guza.