Ulepszony test i narzędzia do pomiaru mechanicznej nocycepcji u larw Drosophila

Protokół ten jest istotny, ponieważ pozwala użytkownikowi zbudować narzędzie, które można wykorzystać do precyzyjnego pomiaru mechanicznych odpowiedzi nocycepcji u genetycznie podatnych larw Drosophila. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona proste materiały do budowy niestandardowych narzędzi, które można wykorzystać do pomiaru mechanicznej nocycepcji od zakresu podprogowego do w pełni responsywnego. Te narzędzia i metody mogą być używane do pomiaru wyjściowej mechanicznej nocycepcji i uczulenia nocyceptywnego po urazie lub chorobie.

Sondowanie larw za pomocą niestandardowych włókien wymaga praktyki. Użytkownicy powinni być w stanie wygenerować krzywe dawka-odpowiedź z larwami kontrolnymi przed przystąpieniem do eksperymentu. Aby skonstruować sondę mechaniczną, użyj małego obcinaka do drutu, aby przyciąć każde włókno Nitinol na określoną długość prostopadle do jego długiej osi.

Filamenty są dostępne w trzech różnych wstępnie ustawionych średnicach. Zbadaj końcówkę włókien pod mikroskopem stereoskopowym, aby upewnić się, że nie pozostały żadne ostre lub nieregularne krawędzie, które mogłyby spowodować uszkodzenie tkanki skóry larwy i zakłócić kalibrację. Następnie użyj kamienia do ostrzenia, aby ręcznie wygładzić krawędzie sondy, aż nie pozostaną żadne ostre nierówności.

Następnie użyj igły podskórnej, aby zrobić dziurę w pobliżu końca drewnianego patyczka do lodów. Nałóż klej do drewna na pojedynczy filament nitinolowy i włóż filament pokryty klejem do szczeliny igły. Gdy klej wyschnie, dociśnij sondę do skali, aż sonda się ugnie, aby określić maksymalną siłę, jaką można zarejestrować w gramach.

Użyj wzoru, aby przeliczyć zarejestrowaną masę na siłę w miliniutonach. Następnie podziel zmierzoną siłę przez pole powierzchni końcówki filamentu, aby przeliczyć obliczoną siłę na kilopaskale ciśnienia. Przygotowanie wielu sond przy użyciu włókien o różnych średnicach i długościach pozwoli wygenerować pełny zestaw, obejmujący zakres reakcji dla larw Drosophila.

Aby przygotować larwy Drosophila do eksperymentu, należy hodować potomstwo larw na standardowym pokarmie w inkubatorze o temperaturze 25 stopni Celsjusza przez około 96 godzin. Kiedy larwy osiągną trzecie stadium rozwojowe, przygotuj korek z pokarmem dla much na małej szalce Petriego dla larw do badania i użyj kleszczy, aby delikatnie oddzielić średniej wielkości larwy w połowie trzeciego stadium od mniejszych larw w drugim i wczesnym trzecim stadium rozwojowym oraz większych późnych lub wędrujących larw w trzecim stadium rozwojowym. Następnie za pomocą kleszczy przenieś od 20 do 30 larw w środkowym trzecim stadium rozwojowym na małą szalkę Petriego zawierającą mały korek z pokarmem dla much zwilżonym wodą o temperaturze pokojowej.

Aby wykonać mechaniczny test nocycepcji, użyj kleszczy, aby umieścić larwę w środkowym stadium na ciemnej cienkiej winylowej podkładce pod mikroskopem stereoskopowym Brightfield i ułóż światła światłowodowe między soczewkami obiektywu mikroskopu a podkładką. Użyj ręcznika papierowego, aby wytrzeć nadmiar wody otaczającej larwę i przesuń podkładkę, aby zorientować głowę i pysk larwy w kierunku niedominującej ręki badacza. Wybierz sondę mechaniczną i przyłóż ją do tylnej grzbietowej strony larwy w przybliżeniu w segmencie brzusznym A8 na jedną do dwóch sekund, ostrożnie ściskając larwę w leżącej poniżej opuszki w miejscu styku sondy, aż sonda zginie się i wywoła wcześniej zmierzony nacisk.

Pozytywna odpowiedź nocyceptywna jest wskazana, jeśli larwa w ciągu trzech sekund wykaże pełny wałek korkociągu o 360 stopni wzdłuż osi swojego ciała. Rejestruj reakcję behawioralną dla każdej larwy. Następnie wyrzuć badaną larwę i przygotuj następną larwę do testu.

Te niestandardowe sondy mechaniczne z włóknami nitinolowymi mogą być używane do wywoływania zachowań wywoływanych mechanicznie i generowania pełnej krzywej behawioralnej dawka-odpowiedź przy użyciu zarówno nieszkodliwych, jak i szkodliwych sond mechanicznych o różnej intensywności. Jak pokazują wyniki tych testów behawioralnych, sondy, które wywierają nacisk 200 kilopaskali lub mniej, nie wywołują awersyjnej reakcji toczenia u larw Drosophila. Zgodnie z oczekiwaniami, te podprogowe lub nieszkodliwe sondy mechaniczne nie wywołują widocznych uszkodzeń tkanki neuronalnej.

I odwrotnie, sondy superprogowe lub szkodliwe wywołują zwiększoną reakcję behawioralną, a także uszkodzenie tkanek samych obwodowych neuronów czuciowych w sposób zależny od dawki. Sondy te mogą być również używane do pomiaru nadwrażliwości mechanicznej po urazie. Około 20% larw reaguje awersyjnym toczeniem już dwie godziny po zabiegu UV, podczas gdy 50% zareagowało cztery godziny w porównaniu z pozorowanymi zwierzętami napromieniowanymi promieniowaniem UV.

Ponieważ sonda użyta do tej analizy miała normalnie podpróg 200 kilopaskala, odpowiedź ta została uznana za allodynię mechaniczną. W późniejszych punktach czasowych reakcja behawioralna larw poddanych działaniu promieniowania UV jest nieznacznie zwiększona, ale nie różni się statystycznie od odpowiedzi w grupie kontrolnej poddanej próbie napromieniowania. Larwy badane sondą o masie 462 kilopaskali po czterech, ośmiu i szesnastu godzinach po leczeniu promieniowaniem UV wykazują znaczny wzrost awersyjnej reakcji toczenia, przy czym cztery godziny to szczyt nadwrażliwości behawioralnej, ponieważ bodziec był początkowo szkodliwy.

Za odpowiedź uznano hiperalgezję mechaniczną. Przygotowanie sondy oraz selekcja i kompresja larw mają kluczowe znaczenie dla powodzenia procesu. Za pomocą tych sond można zmierzyć wyjściową nocycepcję i mechaniczną nadwrażliwość nocyceptywną po urazie.

Korzystając z tych narzędzi i testów, molekularne i genetyczne podstawy mechanicznej nocycepcji i nadwrażliwości nocyceptywnej można zmierzyć w genetycznie wykonalnym modelu Drosophila.