Name: Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Poznaj metodę immunohistochemiczną do wizualizacji projekcji neuronów ruchowych u embrionów Drosophila melanogaster. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę trajektorii aksonów i rozpoznawania celów podczas rozwoju nerwowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękuję Alexowi L. Kołodkinowi, ponieważ nauczyłem się tego protokołu przygotowania filetów w jego laboratorium. Dziękuję również Young Gi Hong za pomoc techniczną. Badanie to było wspierane przez NRF-2013R1A1A4A01011329 (S.J.).

1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotować 500 ml buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (PBS) z roztworem t-oktylofenoksypolietylenu (PBT), dodając 0,5 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,5 ml t-oktylofenoksyetoksyetanolu (patrz tabela materiałów) do 500 ml 1X PBS i mieszając przez co najmniej 30 minut. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Stosować w miarę świeżej i przechowywać roztwór w czystej butelce.</li>
	<li>Przygotuj 10 ml 4% paraformaldehydu, dodając 2,5 ml 16% podstawowego roztworu paraformaldehydu i 1 ml 10x PBS do 6,5 ml wody dejonizowanej. Przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu tygodnia. 
	UWAGA: Unikać kontaktu skóry z roztworem paraformaldehydu, ponieważ jest on wysoce toksyczny.</li>
	<li>Przygotować substrat X-Gal (10% w/v X-Gal w dimetylosulfotlenku (DMSO)) przez rozpuszczenie 0,1 g substratu X-Gal na 1 ml DMSO. Przechowywać w temperaturze -20 °C w 100 μl porcji.</li>
	<li>Przygotować roztwór barwiący X-Gal przy użyciu 10 mM buforu fosforanowego (pH 7,2), 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 3 mM K4[FeII(CN)6], 3 mM K3[FeIII(CN)6] i 0,3% t-oktylofenoksyetoksyetanolu. Przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Przygotuj 3% roztwór nadtlenku wodoru, rozcieńczając 30% nadtlenku wodoru w stosunku 1:10 wodą dejonizowaną.</li>
	<li>Przygotować roztwór 3,3′-diaminobenzydyny (DAB), całkowicie rozpuszczając 1 tabletkę (10 mg) DAB w 35 ml świeżego roztworu PBT. Przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,2 μm i przechowywać w temperaturze -20 °C w 910 μl porcji. 
	UWAGA: Wyrzuć wszystkie odpady DAB do wybielacza, aby zniszczyć DAB.</li>
	<li>Zrób talerze jajkowe z sokiem jabłkowym. Dodać 35 g agaru i 1 l wody dejonizowanej do kolby o pojemności 2 l. Do kolby o pojemności 1 litra dodać 33 g sacharozy, 2 g tegoseptu i 375 ml soku jabłkowego. Rozpuść je w autoklawie przez 30 minut. Pozostawić oba roztwory do ostygnięcia do temperatury około 60 °C. Połączyć i dobrze wymieszać te roztwory, mieszając. Wlać ~11 ml połączonego roztworu na 60 mm naczynie hodowlane.</li>
	<li>Przygotuj pastę drożdżową, mieszając drożdże piekarskie z wodą dejonizowaną (w stosunku 1:0,8) i przechowuj w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Pobieranie zarodków (Dzień 1)
<ol>
	<li>Zbierz młode samice i samce much (młodsze niż 5 dni) i przez 1-2 dni trzymaj je w plastikowej klatce z talerzem jajowym (60 mm x 15 mm), który zawiera niewielką ilość pasty drożdżowej pośrodku.</li>
	<li>W celu optymalnego pobrania zarodków w późnym stadium 16 należy ustawić koszyk na bidon z muchami (> 50) około godziny 17:00 i pozwolić im złożyć jaja w temperaturze 25 °C przez 3 godziny.</li>
	<li>Przenieś muchy do butelki ze świeżym jedzeniem.</li>
	<li>Zamknij talerz jaj pokrywką i inkubuj go do góry nogami w temperaturze 25 °C w nawilżanym inkubatorze (~70% wilgotności) przez noc.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zarodków do barwienia immunologicznego (Dzień 2)
<ol>
	<li>Dodaj 1,8 ml roztworu PBT do talerza jaj około godziny 10:20 i użyj bawełnianego wacika, aby poluzować zarodki z płytki, przechylając ją. 
	Uwaga: Delikatnie rozgniatając pastę drożdżową za pomocą bawełnianego wacika, rozpuść ją w przypadku, gdy znajdzie się na niej duża liczba zarodków. Rozpocznij pobieranie zarodków ~40 minut przed fiksacją (około godziny 11:00).</li>
	<li>Przenieś zarodki z płytki jajowej do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Pozwól zarodkom się uspokoić i odessać roztwór PBT tak bardzo, jak to możliwe. Przepłukać zarodki dwukrotnie 1 ml roztworu PBT. Zasysać roztwór PBT tak bardzo, jak to możliwe.</li>
	<li>Napełnij probówkę 1 ml 50% wybielacza (tj. rozcieńczonego w wodzie dejonizowanej) i zdekorionuj zarodki, inkubując je na nutatorze przez 3 minuty w temperaturze pokojowej (RT). 
	Uwaga: Ten etap nie zabija zarodków z odkorionowaną zarodkami.</li>
	<li>Pozwól zarodkom z odciętą kosmówką się uspokoić, odessaj 50% wybielacza tak bardzo, jak to możliwe, i przepłucz zarodki 3 razy 1 ml roztworu PBT.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml heptanu, a następnie dodać 0,5 ml 4% roztworu paraformaldehydu do probówki w temperaturze pokojowej około godziny 11:00.</li>
	<li>Inkubować zarodki na nutatorze przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń 4% roztwór paraformaldehydu (dolna warstwa).</li>
	<li>Dodaj 0,5 ml 100% metanolu i zdewitelinizuj zarodki, energicznie potrząsając probówką przez 30 sekund.</li>
	<li>Usuń heptan (tj. górną warstwę).</li>
	<li>Dodaj 0,5 ml 100% metanolu i energicznie potrząsaj probówką przez 10 sekund.</li>
	<li>Pozwól zarodkom się uspokoić, stukając w rurkę i odessaj metanol tak bardzo, jak to możliwe. Opłucz zarodki 1 ml 100% metanolu, wstrząsając przez mniej niż 10 s. 
	Uwaga: Długotrwała ekspozycja na metanol niszczy aktywność β-Gal.</li>
	<li>Usunąć metanol i przepłukać zdewitynizowane zarodki 3 razy 1 ml roztworu PBT.</li>
</ol>
4. Genotypowanie zarodków za pomocą barwienia LacZ (Dzień 2)
<ol>
	<li>Dodać 1 ml roztworu PBT do probówki i inkubować probówkę w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C lub łaźni wodnej przez 15 minut.</li>
	<li>Podczas inkubacji umieścić roztwór barwiący X-Gal (1 ml na probówkę) w temperaturze 65 °C w łaźni wodnej, aż stanie się mętny. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odessać roztwór PBT i dodać do probówki 1 ml roztworu barwiącego X-Gal i 20 μl podłoża X-Gal.</li>
	<li>Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C z nutacją, aż do uzyskania widocznego niebieskiego osadu. 
	Uwaga: Czas inkubacji dla 2. i 3. niebieskiej wyważarki wynosi na ogół od 2 do 4 godzin.</li>
	<li>Usuń roztwór barwiący X-Gal i spłucz zarodki 3 razy 1 ml roztworu RT PBT.</li>
	<li>Za pomocą sondy igłowej lub kleszczy ręcznie posortuj zarodki o pożądanym genotypie (tj. niebarwione białe zarodki) za pomocą lekkiego mikroskopu preparacyjnego (obiektywy 1,6X-2,5X). 
	Uwaga: Ponieważ niektóre niebieskie równoważniki, takie jak CyO, aktyna-LacZ i TM3, aktyna-LacZ, przenoszą transgeniczny konstrukt eksprymujący bakteryjny β-Gal (LacZ) pod kontrolą promotora aktyny, zarodki zabarwione na niebiesko w wszechobecny sposób zawierają jedną lub dwie kopie chromosomów niebieskiego balansera. Dlatego niebarwione białe zarodki są homozygotyczne pod względem pożądanego allelu letalnego.</li>
</ol>
5. Barwienie immunologiczne zarodków za pomocą przeciwciał anty-fasciclin II (Dzień 2-3)
<ol>
	<li>Pobrać i przenieść zarodki o pożądanym genotypie (tj. niebarwione białe zarodki) do mikroprobówki o pojemności 0,5 ml za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml. 
	Uwaga: Na tym etapie zarodki mogą być z grubsza klasyfikowane zgodnie z kryteriami morfologicznymi, w tym wzorcami segmentacji naskórka oraz strukturami głowy i ogona9. Podczas inwolucji głowy, między 10 a 16 godzinami po złożeniu jaj, zarodek ulega wyraźnemu zmniejszeniu najbardziej przedniego segmentu9.</li>
	<li>Umyj zarodki raz 0,4 ml roztworu PBT i dodaj 0,3 ml roztworu blokującego (5% normalnej surowicy koziej i 5% DMSO w roztworze PBT).</li>
	<li>Zablokuj zarodki za pomocą nutacji w RT na 15 minut.</li>
	<li>Dodać 75 μl przeciwciała anty-fasciclin II i inkubować probówkę z nutacją w temperaturze pokojowej przez noc.</li>
	<li>Umyj zarodki 4 razy 0,4 ml roztworu PBT przez co najmniej 20 minut na przemycie.</li>
	<li>Dodać 0,3 ml roztworu blokującego (5% normalnej surowicy koziej w roztworze PBT) zawierającego kozie przeciwciało anty-mysie-HRP (2 μg/ml) i inkubować probówkę z nutacją w temperaturze pokojowej przez noc.</li>
	<li>Umyj zarodki 6 razy 0,4 ml roztworu PBT przez co najmniej 20 minut na płukanie.</li>
	<li>Dodać 0,3 ml roztworu DAB do probówki. 
	UWAGA: Załóż rękawice i umieść wszystkie odpady/tuby/końcówki DAB w wybielaczu.</li>
	<li>Dodać 2 μl 3% nadtlenku wodoru i inkubować probówkę w ciemności z nutacją w temperaturze pokojowej, aż do wytworzenia pożądanej ilości osadu. 
	Uwaga: Czas inkubacji dla immunohistochemii 1D4 ogólnie waha się od 0,5-1 godziny.</li>
	<li>Przemyć zarodki 4 razy 0,4 ml roztworu PBT. 
	UWAGA: Usuń roztwór DAB i pierwsze dwa płukania pipetą i wyrzuć je do wybielacza.</li>
	<li>Dodać 0,2 ml 70% roztworu glicerolu/PBS do probówki i przechowywać w temperaturze pokojowej lub 4 °C. 
	Uwaga: Trzymaj rurkę z dala od światła. Bardziej klarowne preparaty można uzyskać, umieszczając zarodki w 90% roztworze glicerolu/PBS10. Jednak trudniej jest wypreparować zarodki oczyszczone w 90% roztworze glicerolu/PBS niż te oczyszczone w 70% roztworze glicerolu/PBS10.</li>
</ol>
6. Inscenizacja, preparacja, montaż i obrazowanie zarodków (Dzień 4)
<ol>
	<li>W celu oceny stopnia zaawansowania przenieść zarodki zrównoważone 70% glicerolem/PBS na szkiełko podstawowe.</li>
	<li>Zbierz zarodki w późnym stadium 16, które mają nerwy ISN segmentu brzusznego 7 (A7), A8 i A9 zbiegające się, aby się stykać lub / i mają jelito środkowe podzielone na trzy pasma. 
	Uwaga: Zarodki barwione przeciwciałem 1D4 mogą być klasyfikowane na podstawie wzorców projekcji aksonów motorycznych ISN i ISNb. Po wyjściu z OUN, nerwy A7, A8 i A9 ISN zarodków w późnym stadium 16 zbiegają się, aby się stykać, a następnie rozchodzą się, aby rozciągnąć się daleko do mięśni grzbietowych (grot strzałki w <silna klasa = "xfig">Ryc. 1A). Jednak w zarodkach w środkowym stadium 16 nerwy ISN A7 rozciągają się równolegle z nerwami A8/A9 (nawias kwadratowy w <silna klasa = "xfig">Ryc. 1B). Ponadto osie projekcyjne nerwów A6 ISNb (prostopadłych do mięśni brzuszno-bocznych) w obu półsegmentach są z grubsza wyrównane z tylnym końcem pęczków aksonów podłużnych OUN (strzałki i linia w <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C). Te kryteria morfologiczne różnią się nieco w zależności od różnych genotypów. Alternatywnie, zarodki mogą być klasyfikowane na podstawie morfologii jelit9,11. Przed etapem 17 jelito środkowe ma kształt przypominający serce, podczas gdy jelito środkowe jest podzielone na trzy pasma według etapu 1712.</li>
	<li>Wypreparuj zarodki.
	<ol>
		<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wyjmij każdy zarodek z kropli glicerolu i umieść zarodek brzusznie do góry. Odetnij przednią część na 1/4 długości ciała i najbardziej tylny obszar, który jest wolny od aksonów motorycznych.</li>
		<li>Za pomocą sondy igłowej wyjmij odcięty koniec zarodka z kropli glicerolu, zwiń, aby ustawić go grzbietem do góry i umieść poziomo na polu. 
		Uwaga: Kiedy zarodek jest usuwany z kropli glicerolu, odrobina glicerolu związanego z zarodkiem sprawia, że staje się on lepki.</li>
		<li>Przeciąć zarodek wzdłuż grzbietowej linii środkowej za pomocą pojedynczej, bardzo cienkiej igły wolframowej13. Wykonaj małe nacięcie na tylnym końcu zarodka, a następnie kontynuuj cięcie grzbietowej linii środkowej w kierunku przedniej; Cięcie w przeciwnym kierunku jest również w porządku.</li>
		<li>Za pomocą sondy igłowej przenieś zarodek przecięty w linii środkowej do kropli glicerolu, umieść go grzbietem do góry i odłącz jelito od ściany ciała, rozkładając każdą ścianę ciała w kierunku brzuszno-bocznym (ukośnym) (obiektyw 2,5x). 
		Uwaga: Upewnij się, że grzbietowa linia środkowa jest całkowicie przecięta, co spowoduje całkowite oddzielenie lewej i prawej ściany ciała.</li>
		<li>Ostrożnie wysuń zarodek wycięty w linii środkowej z kropli glicerolu, a następnie połóż dwa płaty ściany ciała na szkiełku podstawowym za pomocą sondy cienkoigłowej (obiektyw 2,5x).</li>
		<li>Za pomocą bardzo cienkiej igły wolframowej usuń narządy wewnętrzne z wypreparowanego zarodka, popychając je na boki (obiektyw 5X). 
		Uwaga: Bardziej szczegółowy opis innej podobnej procedury preparacji można znaleźć na stronie internetowej5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do montażu dodaj 2-3 μl 70% roztworu glicerolu/PBS do czystych, wypreparowanych zarodków i za pomocą sondy cienkoigłowej przenieś je na nowe szkiełko podstawowe, na którym rozprowadzono 8 μl 70% roztworu glicerolu/PBS w środku (obiektyw 2,5X).</li>
	<li>Założyć szkiełko nakrywkowe (18 mm x 18 mm). Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego zwykłym lakierem do paznokci (przezroczystym lub kolorowym jest w porządku).</li>
	<li>Rejestruj obrazy w wysokiej rozdzielczości (obiektywy zanurzeniowe 20X, 40X i 63X) pod mikroskopem świetlnym z kontrastem interferencyjnym (DIC), zgodnie z instrukcjami producenta. 
	Uwaga: Lepsza wizualizacja i charakterystyka fenotypowa, szczególnie w przypadku aksonów motorycznych ISNb, można uzyskać przy użyciu obiektywu 63X z zanurzeniem w olejku.</li>
</ol>

<ol><li>Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+development+of+larval+muscles+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The embryonic development of larval muscles in Drosophila.</a> Development. 110 (3), 791-804 (1990).</li>
<li>Landgraf, M., Thor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Drosophila+motoneurons%3A+specification+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 17 (1), 3-11 (2006).</li>
<li>Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+growth+cone+guidance+in+Drosophila%3A+fasciclin+II+functions+as+a+neuronal+recognition+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule.</a> Cell. 67 (1), 45-57 (1991).</li>
<li>Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+control+neuromuscular+specificity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila.</a> Cell. 73 (6), 1137-1153 (1993).</li>
<li>Zinn Lab. , California Institute of Technology. Available from:
	 <a target="_blank" href="https://www.its.caltech.edu/~zinnlab/motoraxons.html">https://www.its.caltech.edu/~zinnlab/motoraxons.html</a> (2017).</li>
<li>Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+growth+cone+guidance+in+Drosophila%3A+genes+necessary+for+guidance+toward+or+away+from+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting growth cone guidance in Drosophila: genes necessary for guidance toward or away from the midline.</a> Neuron. 10 (3), 409-426 (1993).</li>
<li>Thor, S., Thomas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+islet+gene+governs+axon+pathfinding+and+neurotransmitter+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Drosophila islet gene governs axon pathfinding and neurotransmitter identity.</a> Neuron. 18 (3), 397-409 (1997).</li>
<li>Roh, S., Yang, D. S., Jeong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+ligand+regulation+of+PlexB+signaling+in+motor+neuron+axon+guidance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential ligand regulation of PlexB signaling in motor neuron axon guidance in Drosophila.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 55, 34-40 (2016).</li>
<li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+JA+%22The+embryonic+development+of+Drosophila+melanogaster%22">The embryonic development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer-Verlag. New York. (1985).</li>
<li>Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPatel%2C+NH+%22Methods+in+cell+biology%2C+vol+44.+Drosophila+melanogaster%3A+practical+uses+in+cell+biology%22">Methods in cell biology, vol 44. Drosophila melanogaster: practical uses in cell biology</a>. Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. 44, Academic Press. New York. 445-487 (1994).</li>
<li>Lee, H. K., Wright, A. P., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+dissection+of+Drosophila+embryos%3A+streamlined+methods+for+screening+mutant+collections+by+antibody+staining%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live dissection of Drosophila embryos: streamlined methods for screening mutant collections by antibody staining.</a> J. Vis. Exp. (34), (2009).</li>
<li>Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHartenstein%2C+V+%22Atlas+of+Drosophila.+development%22">Atlas of Drosophila. development</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/52.htm">http://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/52.htm</a> 52(1993).</li>
<li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+making+very+fine%2C+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bull. World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).</li>
<li>Kolodkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fasciclin+IV%3A+sequence%2C+expression%2C+and+function+during+growth+cone+guidance+in+the+grasshopper+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Fasciclin IV: sequence, expression, and function during growth cone guidance in the grasshopper embryo.</a> Neuron. 9 (5), 831-845 (1992).</li>
<li>Jeong, S., Juhaszova, K., Kolodkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Control+of+semaphorin-1a-mediated+reverse+signaling+by+opposing+pebble+and+RhoGAPp190+functions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Control of semaphorin-1a-mediated reverse signaling by opposing pebble and RhoGAPp190 functions in Drosophila.</a> Neuron. 76 (4), 721-734 (2012).</li>
<li>Winberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plexin+A+is+a+neuronal+semaphorin+receptor+that+controls+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plexin A is a neuronal semaphorin receptor that controls axon guidance.</a> Cell. 95 (7), 903-916 (1998).</li>
<li>Yang, D. S., Roh, S., Jeong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axon+guidance+function+of+Rap1+small+GTPase+is+independent+of+PlexA+RasGAP+activity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The axon guidance function of Rap1 small GTPase is independent of PlexA RasGAP activity in Drosophila.</a> Dev. Biol. 418 (2), 258-267 (2016).</li>
<li>Yu, H. H., Araj, H. H., Ralls, S. A., Kolodkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transmembrane+Semaphorin+Sema+I+is+required+in+Drosophila+for+embryonic+motor+and+CNS+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The transmembrane Semaphorin Sema I is required in Drosophila for embryonic motor and CNS axon guidance.</a> Neuron. 20 (2), 207-220 (1998).</li>
<li>Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHartenstein%2C+V+%22Atlas+of+Drosophila.+development%22">Atlas of Drosophila. development</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/52.htm">http://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/52.htm</a> 52(1993).</li>
<li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).</li>
<li>Kidd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roundabout+controls+axon+crossing+of+the+CNS+midline+and+defines+a+novel+subfamily+of+evolutionarily+conserved+guidance+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Roundabout controls axon crossing of the CNS midline and defines a novel subfamily of evolutionarily conserved guidance receptors.</a> Cell. 92 (2), 205-215 (1998).</li>
<li>Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+neural+circuits+into+shape+with+semaphorins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Getting neural circuits into shape with semaphorins.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (9), 605-618 (2012).</li>
</ol>

Autor oświadcza, że nie ma konkurencyjnych interesów finansowych.

Szczegóły wad prowadzenia aksonów motorycznych są oceniane szybciej i z większą dokładnością przez filetowane przygotowanie zarodków barwionych DAB niż przez laserową skaningową mikroskopię konfokalną zarodków znakowanych fluorescencyjnie. W związku z tym filetowany preparat zarodków utrwalonych i wybarwionych 1D4 najlepiej nadaje się do funkcjonalnej charakterystyki cząsteczek wskazówek. Cztery główne klasy wskazówek naprowadzających, w tym netryny, szczeliny, semaforyny (Semas) i efryny oraz ich pokrewne receptory mają...

Precyzyjne i selektywne połączenia między aksonami motorycznymi a docelowymi mięśniami podczas rozwoju embrionalnego są niezbędne do prawidłowego poruszania się u larw Drosophila. Embrionalny wzór 30 włókien mięśniowych w każdym z półsegmentów brzusznych A2-A7 jest ustalany przez etap 161. 36 neuronów ruchowych, które są generowane w brzusznym rdzeniu nerwowym, rozciąga swoje aksony na obrzeża, aby unerwić określone mięśnie docelowe2. Odnajdywanie ścieżki aksonu ruchowego i rozpoznawanie celu można zwizualizować za pomocą immunohistochemii z przeciwciałem (mysie przeciwciało monoklonalne 1D4)3,4. Wiele obrazów wzorców projekcji aksonów motorycznych w zarodkach typu dzikiego jest dostępnych na stronie internetowej5. Przeciwciało 1D4 oznacza wszystkie aksony ruchowe i trzy podłużne pęczki aksonów po każdej stronie linii środkowej embrionalnego ośrodkowego układu nerwowego (OUN)4,6 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C i <silna klasa="xfig">Rysunek 2A). W związku z tym immunohistochemia z przeciwciałem FasII stanowi potężne narzędzie do identyfikacji genów wymaganych do połączeń nerwowo-mięśniowych w celu zademonstrowania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw kierowania aksonami ruchowymi i rozpoznawania celów.
W każdym z półsegmentów brzusznych A2-A7, aksony motoryczne wystają i selektywnie łączą się na dwie główne gałęzie nerwowe, nerw segmentowy (SN) i nerw międzysegmentowy (ISN)2,4, oraz mniejszą gałąź nerwową, nerw poprzeczny (TN)7. SN selektywnie defacykuluje, dając początek dwóm gałęziom nerwowym zwanym SNa i SNc, podczas gdy ISN dzieli się na trzy gałęzie nerwowe zwane ISN, ISNb i ISNd2,4. Wśród nich wzorce projekcji aksonów motorycznych ISN, ISNb i SNa są najdokładniej wizualizowane, gdy zarodki w późnym stadium 16 są barwione przeciwciałem FasII i filetowane (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C i <silna klasa = "xfig">Figura 2A). Neurony ruchowe ISN rozciągają swoje aksony do unerwienia mięśni grzbietowych 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 i 202,4 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Neurony ruchowe ISNb unerwiają mięśnie brzuszno-boczne 6, 7, 12, 13, 14, 28 i 302,4 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A i 2B). Gałąź nerwowa SNa wystaje do unerwienia mięśni bocznych 5, 8, 21, 22, 23 i 242,4 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). TN, który składa się z dwóch aksonów motorycznych, wystaje ipsilateralnie wzdłuż granicy segmentu, aby unerwić mięsień 25 i tworzy synapsy z bocznym dwubiegunowym neuronem dendrytycznym (LBD) na peryferii7 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Te docelowe unerwienie mięśni wymaga nie tylko selektywnej defacykulacji aksonów ruchowych w określonych punktach wyboru, ale także rozpoznania mięśni docelowych. Ponadto niektóre przypuszczalne mezodermalne komórki przewodnie, które działają jako cele pośrednie, zostały znalezione zarówno w szlakach ISN, jak i SNa, ale nie wzdłuż szlaku ISNb4. Może to sugerować, że odnajdywanie ścieżki aksonu motorycznego ISNb może być regulowane w odmienny sposób w porównaniu z prowadzeniem aksonów motorycznych ISN i SNa, a także wskazuje, że peryferyjne prowadzenie aksonów motorycznych stanowi atrakcyjny model eksperymentalny do badania zróżnicowanych lub konserwatywnych ról pojedynczej cząsteczki wskazującej naprowadzanie8.
Ta praca przedstawia standardową metodę wizualizacji wzorców projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila. Opisane protokoły obejmują sposób preparowania utrwalonych zarodków wybarwionych przeciwciałem 1D4 i przetworzonych w 3,3′-diaminobenzydynie (DAB) do filetowanych preparatów. Jedną z kluczowych zalet płaskich preparatów utrwalonych zarodków jest lepsza wizualizacja projekcji aksonalnych i wzorców mięśniowych na obrzeżach. Co więcej, praca ta pokazuje również, w jaki sposób genotypować utrwalone zarodki w celu sortowania pożądanych zmutowanych zarodków za pomocą metody barwienia LacZ.

<table><tbody><tr><td>Surowica bydlęca Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>t-oktylofenoksyetoksyetanol</td></tr><tr><td>16% roztwór paraformaldehydu</td><td>Ted Pella</td><td>18505</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30435</td><td></td></tr><tr><td>Jednozasadowy fosforan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71500</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże X-Gal</td><td>US Biological</td><td>X1000</td><td>X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galaktozyd galaktopiranozyd)</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Heksacyjanożelazian(II) potasu trójwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>Heksacyjanożelazian(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244023</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Sigma-Aldrich 216763</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrachlorowodorek 3,3'-diaminobenzydyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>US Biological</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Tegosept (4-hydroksybenzoesan metylu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie hodowlane (60 mm)</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Zlewka Tricon</td><td>Simport</td><td>B700-100</td><td>Służy do wykonania plastikowej klatki na zlewkę do pobierania zarodków.</td></tr><tr><td>Yeast</td><td>Societe Industrielle Lesaffre</td><td>Saf Instant Drożdżowy czerwony</td><td></td></tr><tr><td>wacik bawełniany (drewniany bawełniany z pojedynczą końcówką PK100)</td><td>VWR</td><td>14220-263</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tube (1.5 ml)</td><td>Sarstedt</td><td>#72.690</td><td></td></tr><tr><td>Wybielacz</td><td>The Clorox Company</td><td>Clorox</td><td></td></tr><tr><td>Heptane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246654</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>J.T. Baker</td><td>UN1230</td><td></td></tr><tr>Normalne <td>technologie życia</td><td>w surowicy koziej</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr>Badania rozwojowe<td>przeciwciał anty-FasciculinII</td><td>Bank Hybridoma</td><td>1D4 anty-Fasciclin II</td><td></td></tr><tr><td>Koza Przeciwciało anty-mysie-HRP</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-006-068</td><td>AffiniPure F(ab')2 Fragment kozy Anty-mysia IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Szkło ślizgowe</td><td>Duran Group</td><td>235501403</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Duran Group</td><td>235503104</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>1 ml Strzykawka</td><td>Becton Dickinson Medical(s)</td><td>301321</td><td></td></tr><tr><td>Igła wolframowa</td><td>Ted Pella</td><td>#27-11</td><td>Drut wolframowy, &oslash; 0,13 mm/6,1 m (&oslash;. 005"/20 stóp)</td></tr><tr><td>Nutator (Mini twister)</td><td>Koreańska nauka</td><td>KO. VS-96TWS</td><td>Alternatywnie, nutator marki BD Clay Adams (BD 421125)</td></tr></tbody></table>

wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Tworzenie funkcjonalnych obwodów nerwowo-mięśniowych opiera się na precyzyjnych połączeniach między rozwijającymi się aksonami motorycznymi a docelowymi mięśniami. Neurony ruchowe wydłużają stożki wzrostu, aby poruszać się po określonych ścieżkach, reagując na dużą liczbę wskazówek przewodnich aksonów, które emanują z otaczającego środowiska zewnątrzkomórkowego. Rozpoznawanie celu stożka wzrostu również odgrywa kluczową rolę w specyficzności nerwowo-mięśniowej. W niniejszej pracy przedstawiono standardowy protokół immunohistochemiczny do wizualizacji projekcji neuronów ruchowych zarodków Drosophila melanogaster w późnym stadium 16. Protokół ten obejmuje kilka kluczowych kroków, w tym procedurę genotypowania, w celu sortowania pożądanych zmutowanych zarodków; procedura barwienia immunologicznego w celu znakowania zarodków przeciwciałem przeciwko fasciclin II (FasII); oraz procedura preparacji w celu wytworzenia filetowanych preparatów z utrwalonych zarodków. Projekcje aksonów ruchowych i wzorce mięśniowe na obrzeżach są znacznie lepiej uwidocznione w płaskich preparatach filetowanych zarodków niż w zarodkach pełnomocowanych. W związku z tym, filetowane przygotowanie utrwalonych zarodków barwionych przeciwciałem FasII stanowi potężne narzędzie do charakteryzowania genów wymaganych do odnajdywania ścieżki aksonów ruchowych i rozpoznawania celu, a także może być stosowane zarówno do badań genetycznych utraty funkcji, jak i wzmocnienia funkcji.

Precyzyjne połączenia między aksonami ruchowymi a mięśniami docelowymi podczas rozwoju neuronalnego zależą od selektywnego odpychania akson-akson oraz rozpoznawania celu w określonych punktach decyzyjnych4. U Drosophila selektywne odpychanie między aksonami ruchowymi jest częściowo regulowane przez skojarzone działanie semaforyn klasy 1 i 2 (Sema), w tym Sema-1a, Sema-2a i Sema-2b8,14,<s...

Ta praca opisuje standardową metodę immunohistochemiczną do wizualizacji projekcji neuronów ruchowych zarodków Drosophila melanogaster w późnym stadium 16. Wyfiletowany preparat utrwalonych zarodków wybarwionych przeciwciałem FasII stanowi potężne narzędzie do scharakteryzowania genów wymaganych do znajdowania ścieżki aksonów ruchowych i rozpoznawania celów podczas rozwoju neuronalnego.

Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest analiza wzorców projekcji neuronów ruchowych w późnych stadiach rozwoju embrionów Drosophila melanogaster. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu rozwoju układu nerwowego, takie jak prowadzenie aksonów ruchowych i formowanie podjednostek nerwowych. Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie precyzyjnej wizualizacji aksonów ruchowych w rozwijających się embrionach, co pozwala na rzetelną analizę wytyczania ścieżek aksonalnych oraz identyfikację defektów w warunkach badawczych.Jeden dzień po przygotowaniu płytek do zbierania jaj zamień je na nowe, zawierające niewielką ilość świeżo przygotowanej pasty drożdżowej. Po trzech godzinach przebywania na świeżych płytkach przenieś muchy do nowych butelek z pożywką. Płytki z jajami inkubuj przez noc w temperaturze 25 °C.Rano do płytek należy dodać 1,8 ml roztworu PBT. Następnie, używając patyczka higienicznego, należy odseparować embriony. Po tym czasie, za pomocą pipety o pojemności 1 ml, należy przenieść embriony wraz z roztworem do probówki do mikrocentryfugi.Gdy zarodki opadną na dno, odessać jak największą ilość roztworu. Następnie dwukrotnie przemyć zarodki, używając jednego mililitra PBT na każde płukanie. Aby zdekoronować zarodki, zastąpić ostatnie płukanie jednym mililitrem 50% bleach i delikatnie kołysać probówką przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.Aby usunąć wybielacz, przemyj embriony trzykrotnie roztworem PBT. Następnie zastąp ostatni płukania 0,5 ml 100% heptanu oraz 0,5 ml 4% paraformaldehydu. Następnie inkubuj embriony przez 15 minut przy delikatnym kołysaniu.Po inkubacji należy usunąć spodnią warstwę roztworu i dodać 500 µL 100% methanol. Następnie należy energicznie wstrząsać probówką przez 30 sekund w celu dewitellinizacji embrionów. Potem należy usunąć wierzchnią warstwę roztworu, ponownie dodać 500 µL 100% methanol i wstrząsać probówką przez kolejne 10 sekund.Po potrząśnięciu probówką należy ją lekko opukać, aby pomóc embrionom opaść na dno, a następnie usunąć jak największą ilość roztworu. Następnie embriony należy krótko przepłukać 100% metanolem. Potem należy niezwłocznie przepłukać embriony trzy razy w PBT.Następnie resuspenduj zarodki w 1 ml świeżego PBT. Inkubuj zarodki w temperaturze 37 °C przez 15 minut, aby przygotować je do barwienia LacZ. Podczas inkubacji zarodków przygotuj 1 ml alikwotu roztworu barwiącego X-gal.Ogrzewaj alikwot w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C, aż stanie się mętny. Następnie przenieś go do bloku grzejnego o temperaturze 37 °C. Po 15 minutach ogrzewania embrionów usuń roztwór PBT i zastąp go 1 ml alikwotem roztworu barwiącego.Następnie dodaj 20 µL podłoża X-gal. Inkubuj probówkę przez około dwie do czterech godzin w temperaturze 37 °C, delikatnie kołysząc, aż powstanie niebieski osad. Następnie usuń roztwór barwiący i wypłucz embriony trzykrotnie w PBT o temperaturze pokojowej.Po wypłukaniu należy za pomocą sondy igłowej lub pęsety ręcznie wyselekcjonować zarodki pod mikroskopem sekcyjnym. Wybarwione zarodki, które są przedmiotem badania, należy zebrać do probówki do mikrowirówki o pojemności 0,5 mm za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Następnie wyselekcjonowane zarodki należy przemyć 0,4 ml PBT.Następnie należy zastąpić PBT 0,3 mililitrami roztworu blokującego i inkubować zarodki przez 15 minut przy delikatnym mieszaniu. Po 15 minutach należy dodać 75 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego i kontynuować inkubację przez noc. Następnego ranka zarodki należy płukać w PBT przez około dwie godziny, wymieniając roztwór płuczący mniej więcej co 30 minut.Po przemyciu dodaj 0,3 ml roztworu blokującego zawierającego przeciwciało wtórne i inkubuj probówkę w temperaturze pokojowej przez noc, delikatnie kołysząc. Następnego ranka przemywaj zarodki w PBT przez około trzy godziny. Wymień PBT co najmniej pięciokrotnie w czasie trwania procesu płukania.Po przemyciu ponownie zawiesić zarodki w 0,3 ml roztworu dab i dodać dwa mikrolitry 3% nadtlenku wodoru. Następnie inkubować je w ciemności, delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej, aż do powstania odpowiedniej ilości osadu. Zazwyczaj trwa to od 30 do 60 minut.Następnie zarodki należy przepłukać czterokrotnie w PBT i zawiesić je ponownie w 0,2 mililitra roztworu montażowego. Teraz należy pozostawić zarodki do równowagi w ciemności w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić filetowanie zarodków, należy umieścić je na szkiełku przedmiotowym.Najpierw przenieś je do kropli glicerolu stroną brzuszną do góry. Następnie, pod mikroskopem sekcyjnym, odetnij część przednią oraz 1/4 długości ciała i usuń najbardziej tylny region, który jest pozbawiony aksonów ruchowych. Teraz, używając igły sondującej, przenieś preparat z glicerolu, orientując go stroną grzbietową do góry, i umieść go poziomo w polu widzenia.Kolejny krok wymaga użycia cienkiej igły wolframowej, która została wprowadzona w głąb pustego wnętrza sondy igłowej, a następnie zagięta na końcu. Używając igły wolframowej, wykonaj niewielkie nacięcie na tylnym końcu zarodka, a następnie kontynuuj nacinanie wzdłuż linii środkowej grzbietu. Upewnij się, że końcówka igły wolframowej nie dotyka powierzchni szkiełka przedmiotowego podczas sekcji, ponieważ igła może łatwo wygiąć się o szkło.Następnie, za pomocą sondy, przenieś preparat z powrotem do kropli gliceryny i ułóż go stroną grzbietową do góry. Następnie oddziel jelito od ściany ciała, rozkładając każdą ze ścian ciała w kierunku brzuszno-bocznym. Dwie ściany ciała powinny się rozdzielić.Następnie za pomocą sondy ostrożnie przenieś płaty ściany ciała na szkiełko przedmiotowe. Na szkiełku, używając igły wolframowej, usuń narządy wewnętrzne, przesuwając je bocznie. Aby ustabilizować igłę wolframową i zapobiec jej uszkodzeniu, zachowaj igłę wewnątrz kaniuli i trzymaj igłę wolframową opartą o powierzchnię szkiełka przedmiotowego podczas manipulowania nią.Następnie przygotowane próbki zamocuj w 8 µL medium montażowego na nowym szkiełku przedmiotowym. Nałóż szkiełko nakrywkowe i zabezpiecz krawędzie zwykłym lakierem do paznokci. Następnie wykonaj zdjęcia w wysokiej rozdzielczości, korzystając z optyki DIC.Stosując opisaną metodę, zarodki w stadium 16 zabarwiono przeciwciałem Fas2 i przygotowano do wizualizacji neuronów ruchowych oraz brzusznych półsegmentów A3 i A4. Zazwyczaj co najmniej siedem neuronów ruchowych wysyła i wiąże swoje aksony, tworząc gałąź nerwu ISNb. W tym preparacie możliwe było również zidentyfikowanie wielu otaczających pęczków nerwowych. Gdy międzymsegmentowy pęczek nerwowy dociera do punktu rozgałęzienia przy mięśniach 6 i 7, dwa aksony selektywnie oddzielają się od pęczka i unerwiają mięśnie 6 i 7.To samo dzieje się w innych punktach decyzyjnych, gdy pęczek rozciąga się grzbietowo. Następnie, w ostatnim punkcie decyzyjnym, dwa aksony unerwiają mięsień 12. W przeciwieństwie do tego, w embrionach z mutacją Sema-1a te same aksony nie ulegają defasykulacji w swoich punktach decyzyjnych.Nie jest to zaskakujące, ponieważ produkt Sema-1 aegean jest znany z tego, że pomaga w tworzeniu połączeń między aksonami ruchowymi a mięśniami docelowymi podczas rozwoju układu nerwowego. Zatem opisana metoda może być wykorzystana do analizy fenotypów mutantów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak sortować pożądane embriony mutantów, jak przeprowadzać immunostację wzorców projekcji aksonalnych neuronów ruchowych oraz jak preparować utrwalone embriony do przygotowania płaskiego.

visualization-axonal-projection-pattern-embryonic-motor-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisujemy procedurę przygotowania zarodków Drosophila na różnych etapach rozwoju w celu wizualizacji embrionalnego układu nerwowego podczas embriogenezy.

Wizualizacja embrionalnego układu nerwowego w całych zarodkach Drosophila

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół montowania barwionych zarodków Drosophila w pozycji pionowej, co umożliwia obrazowanie przekrojów poprzecznych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Obrazowanie w układzie pionowym embrionów Drosophila

Źródło: Inal, M. A. et. al., wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila przy użyciu lipofilowych barwników fluorescencyjnych. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje metodę wstecznego znakowania neuronów ruchowych Drosophila za pomocą barwników lipofilowych. Barwnik dostaje się do aksonu, przemieszcza się wstecz i oznacza neurony na zielono, umożliwiając szczegółową wizualizację ich morfologii i projekcji pod mikroskopem konfokalnym.

Wsteczne znakowanie neuronów ruchowych Drosophila za pomocą fluorescencyjnych barwników lipofilowych

Źródło: Guan, W., et. al. Wizualizuj Drosophila Aksony neuronu ruchowego nóg przez dorosły naskórek. J. vis. exp. (2018) Ten film pokazuje obrazowanie Drosophila z zielonymi fluorescencyjnymi neuronami ruchowymi eksprymującymi białko za pomocą mikroskopii konfokalnej. Laser i dwa detektory wychwytują GFP i autofluorescencję naskórków. Obrazy są przetwarzane przez dzielenie kanałów, odejmowanie autofluorescencji i łączenie w kolorowy obraz kompozytowy w celu wizualizacji aksonów w segmencie nogi.

Obrazowanie znakowanych fluorescencyjnie neuronów ruchowych w nodze dorosłego Drosophila

Source: &lt; style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/57546/visualization-of-motor-axon-navigation-and-quantification-of-axon-arborization-in-mouse-embryos-using-light-sheet-fluorescence-microscopy'&gt;Liau, E. S. et al. Wizualizacja motorycznej nawigacji aksonów i kwantyfikacja arboryzacji aksonów w zarodkach myszy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą lekkiej mikroskopii fluorescencyjnej. J. Vis. Exp. (2018). Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii...

Wizualizacja projekcji neuronów ruchowych i rozgałęzień aksonów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego

Źródło: Jeong, S. Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje wizualizację projekcji aksonalnych w zarodkach Drosophila. Znakowanie immunologiczne neuronów ruchowych, precyzyjna sekcja w celu odsłonięcia struktur neuronalnych oraz mikroskopia kontrastowa z różnicową interferencją łącznie ujawniają szczegółową architekturę neuronów, podkreślając wzorce projekcji aksonalnej.

Wizualizacja wzorców projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Prezentujemy tutaj zoptymalizowany protokół genotypu, barwienia i przygotowania płodów myszy do obrazowania obwodowych projekcji aksonów nocyceptora u całego zwierzęcia, jako skuteczną metodę oceny fenotypów wzrostu aksonów czuciowych u genetycznie modyfikowanych myszy.

Obrazowanie w całości projekcji czuciowych aksonów zarodków myszy

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Tutaj opisujemy protokół wizualizacji projekcji neuronów ruchowych i arboryzacji aksonów w transgenicznych zarodkach myszy Hb9::GFP. Po barwieniu immunologicznym neuronów ruchowych użyliśmy mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego do obrazowania zarodków do późniejszej analizy ilościowej. Protokół ten ma zastosowanie do innych procesów nawigacji neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym.

Wizualizacja nawigacji aksonów ruchowych i kwantyfikacja arboryzacji aksonów w zarodkach myszy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

Tutaj opisujemy protokół wizualizacji celowania aksonalnego za pomocą białka fluorescencyjnego w odnóżach dorosłych Drosophila poprzez etapy fiksacji, montażu, obrazowania i po obrazowaniu.

Wizualizuj aksony neuronu ruchowego nóg Drosophila przez naskórek dorosłego człowieka

Opisujemy metodę wstecznego śledzenia embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych.

Wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych

Poznaj metodę immunohistochemiczną do wizualizacji projekcji neuronów ruchowych u embrionów Drosophila melanogaster. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę trajektorii aksonów i rozpoznawania celów podczas rozwoju nerwowego.

Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów