Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Ogólnym celem tego eksperymentu jest analiza wzorców projekcji neuronów ruchowych w późnym stadium zarodków Drosophila melanogaster. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju neuronalnego, takie jak prowadzenie aksonów motorycznych i tworzenie neuronów podcu. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia precyzyjną wizualizację aksonu ruchowego u rozwijających się zarodków, co pozwala na rzetelną analizę pathfindingu aksonów i celowanie w wadę schorzenia.

Dzień po ustawieniu talerzy do zbierania jaj wymień talerze na nowe, zawierające odrobinę świeżo przygotowanej pasty drożdżowej. Po trzech godzinach na świeżych talerzach przenieś muchy do nowych butelek z jedzeniem. I inkubuj talerze jajowe przez noc w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Rano dodaj 1,8 mililitra roztworu PBT do płytek. I użyj bawełnianego wacika, aby usunąć zarodki. Następnie za pomocą pipety o pojemności 1 mililitra przenieś zarodki i roztwór do probówki mikrowirówkowej.

Gdy zarodki osiądą na dnie, odessać jak najwięcej roztworu. Następnie dwukrotnie przepłucz zarodki, używając jednego mililitra PBT na płukanie. Aby ozdobić zarodki, zastąp ostatnie płukanie jednym mililitrem 50% wybielacza i kołysz tubką przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.

Aby usunąć wybielacz, spłucz zarodki trzykrotnie PBT. Następnie zastąp ostatnie płukanie pół mililitra 100% heptanu i pół mililitra 4% paraformaldehydu. Teraz wysiaduj zarodki przez 15 minut, delikatnie kołysząc.

Po inkubacji usuń leżącą poniżej warstwę roztworu i dodaj z powrotem 500 mikrolitrów 100% metanolu. Teraz przez 30 sekund energicznie potrząsaj probówką, aby zdewitynizować zarodki. Następnie usuń leżący od niego roztwór, dodaj z powrotem 500 mikrolitrów 100% metanolu i potrząsaj probówką przez kolejne 10 sekund.

Po potrząśnięciu rurką postukaj w nią, aby pomóc zarodkom się uspokoić i usunąć jak najwięcej roztworu. Następnie krótko spłucz zarodki 100% metanolem. Następnie natychmiast trzykrotnie przepłucz zarodki PBT.

Teraz ponownie zawieś zarodki w jednym mililitrze świeżego PBT. I inkubuj zarodki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby przygotować je do barwienia LacZ. Podczas inkubacji zarodków przygotuj jednomililitrową porcję roztworu barwiącego X-gal.

Podgrzej podwielokrotność w łaźni wodnej o temperaturze 65 stopni Celsjusza, aż stanie się mętna. Następnie przenieś go do bloku grzewczego o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po ogrzaniu zarodków przez 15 minut usuń roztwór PBT i zastąp go jedną mililitrową porcją roztworu barwiącego.

Następnie dodaj 20 mikrolitrów substratu X-gal. Przez około dwie do czterech godzin inkubuj probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie kołysząc, aż utworzy się niebieski osad. Następnie usuń roztwór barwiący i trzykrotnie spłucz zarodki PBT o temperaturze pokojowej.

Po płukaniu użyj sondy igłowej lub kleszczy, aby ręcznie posortować zarodki pod mikroskopem preparacyjnym. Zbierz barwione zarodki do półmilimetrowej mikroprobówki wirówkowej za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra. Następnie umyj wybrane zarodki 0,4 mililitra PBT.

Następnie zastąp PBT 0,3 mililitra roztworu blokującego i pozwól zarodkom inkubować z delikatnym mieszaniem przez 15 minut. Po 15 minutach dodaj 75 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego i kontynuuj inkubację przez noc. Następnego ranka myj zarodki PBT przez około dwie godziny, zmieniając roztwór płuczący co około 30 minut.

Po umyciu dodać 0,3 mililitra roztworu blokującego zawierającego przeciwciało drugorzędowe i inkubować probówkę, delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej przez noc. Następnego ranka myj zarodki PBT przez około trzy godziny. Zmień PBT co najmniej pięć razy w okresie prania.

Po umyciu ponownie zawieś zarodki w 0,3 mililitra roztworu do dabowania i dodaj dwa mikrolitry 3% nadtlenku wodoru. Następnie inkubuj je w ciemności, delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej, aż wytrąci się wystarczająca ilość osadu. Zwykle zajmuje to od 30 do 60 minut.

Następnie przepłucz zarodki czterokrotnie PBT i zawieś je ponownie w 0,2 mililitra roztworu montażowego. Teraz pozwól zarodkom zrównoważyć się w ciemności w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Aby filetować zarodki, umieść je na szklanym szkiełku.

Najpierw przenieś je do kropli glicerolu brzuszną stroną do góry. Następnie pod mikroskopem preparacyjnym odetnij przednią część i 1/4 długości ciała i usuń najbardziej tylny obszar, który jest wolny od aksonów motorycznych. Teraz za pomocą sondy igłowej wysunąć preparat z glicerolu, zorientowany grzbietowo do góry i ustawić go poziomo w polu widzenia.

Następny krok wymaga cienkiej igły wolframowej, która została włożona w pusty obszar sondy igłowej, a następnie wygięta na końcu. Za pomocą igły wolframowej wykonaj małe nacięcie na tylnym końcu zarodka i kontynuuj cięcie grzbietowej linii środkowej. Upewnij się, że końcówka igły wolframowej nie dotyka powierzchni szkiełka podczas sekcji, ponieważ igła łatwo zgina się na szkle.

Następnie, z sondą, przygotuj się z powrotem do kropli glicerolu i umieść ją grzbietową stroną do góry. Tam odłącz jelito od ściany ciała, rozkładając każdą ścianę ciała w kierunku brzuszno-bocznym. Dwie ściany korpusu powinny się od siebie rozejść.

Teraz za pomocą sondy ostrożnie przesuń klapy ścianki korpusu na szklane szkiełko. Na szkiełku użyj igły wolframowej, aby usunąć narządy wewnętrzne, popychając je na boki. Aby ustabilizować igłę wolframową i zapobiec jej uszkodzeniu, należy przytrzymać wydrążoną igłę i przytrzymać igłę wolframową przyciśniętą do powierzchni szkiełka podczas manipulowania igłą wolframową.

Teraz zamontuj preparaty w ośmiu mikrolitrach roztworu montażowego na nowym szkiełku podstawowym. Przymocuj szkiełko nakrywkowe i uszczelnij krawędzie zwykłym lakierem do paznokci. Następnie rejestruj obrazy w wysokiej rozdzielczości za pomocą optyki DIC.

Za pomocą opisanej metody zarodki w stadium 16 wybarwiono przeciwciałem Fas2 i przygotowano do wizualizacji neuronów ruchowych i półsegmentów brzusznych A3 i A4. Zwykle co najmniej siedem neuronów ruchowych rozciąga się i fascykuluje swoje aksony, tworząc gałąź nerwową ISNb. W tym preparacie można było również zidentyfikować wiele otaczających wiązek nerwowych. Kiedy międzysegmentowa wiązka nerwowa osiąga punkt wyboru w mięśniu 6 i 7, dwa aksony selektywnie defacykulują i osłabiają mięśnie 6 i 7.

To samo dzieje się w innych punktach wyboru, gdy wiązka rozciąga się grzbietowo. Następnie, w ostatnim punkcie wyboru, dwa aksony osłabiają mięsień 12. Natomiast w zmutowanych zarodkach Sema-1a te same aksony nie są w stanie odczepić się w wybranych przez siebie punktach.

Nie jest to zaskakujące, ponieważ produkt Sema-1 aegean jest znany z tego, że pomaga tworzyć połączenia między aksonami motorycznymi a mięśniami docelowymi podczas rozwoju neuronalnego. Tym samym opisana metoda może być wykorzystana do analizy zmutowanych fenotypów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak sortować pożądane zmutowane zarodki, jak immunobarwić wzorce projekcji aksonalnej neuronów ruchowych i jak preparować utrwalone zarodki w celu płaskiego przygotowania.