Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest analiza wzorców projekcji neuronów ruchowych w późnych stadiach rozwoju embrionów Drosophila melanogaster. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu rozwoju układu nerwowego, takie jak prowadzenie aksonów ruchowych i formowanie podjednostek nerwowych. Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie precyzyjnej wizualizacji aksonów ruchowych w rozwijających się embrionach, co pozwala na rzetelną analizę wytyczania ścieżek aksonalnych oraz identyfikację defektów w warunkach badawczych.

Jeden dzień po przygotowaniu płytek do zbierania jaj zamień je na nowe, zawierające niewielką ilość świeżo przygotowanej pasty drożdżowej. Po trzech godzinach przebywania na świeżych płytkach przenieś muchy do nowych butelek z pożywką. Płytki z jajami inkubuj przez noc w temperaturze 25 °C.

Rano do płytek należy dodać 1,8 ml roztworu PBT. Następnie, używając patyczka higienicznego, należy odseparować embriony. Po tym czasie, za pomocą pipety o pojemności 1 ml, należy przenieść embriony wraz z roztworem do probówki do mikrocentryfugi.

Gdy zarodki opadną na dno, odessać jak największą ilość roztworu. Następnie dwukrotnie przemyć zarodki, używając jednego mililitra PBT na każde płukanie. Aby zdekoronować zarodki, zastąpić ostatnie płukanie jednym mililitrem 50% bleach i delikatnie kołysać probówką przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.

Aby usunąć wybielacz, przemyj embriony trzykrotnie roztworem PBT. Następnie zastąp ostatni płukania 0,5 ml 100% heptanu oraz 0,5 ml 4% paraformaldehydu. Następnie inkubuj embriony przez 15 minut przy delikatnym kołysaniu.

Po inkubacji należy usunąć spodnią warstwę roztworu i dodać 500 µL 100% methanol. Następnie należy energicznie wstrząsać probówką przez 30 sekund w celu dewitellinizacji embrionów. Potem należy usunąć wierzchnią warstwę roztworu, ponownie dodać 500 µL 100% methanol i wstrząsać probówką przez kolejne 10 sekund.

Po potrząśnięciu probówką należy ją lekko opukać, aby pomóc embrionom opaść na dno, a następnie usunąć jak największą ilość roztworu. Następnie embriony należy krótko przepłukać 100% metanolem. Potem należy niezwłocznie przepłukać embriony trzy razy w PBT.

Następnie resuspenduj zarodki w 1 ml świeżego PBT. Inkubuj zarodki w temperaturze 37 °C przez 15 minut, aby przygotować je do barwienia LacZ. Podczas inkubacji zarodków przygotuj 1 ml alikwotu roztworu barwiącego X-gal.

Ogrzewaj alikwot w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C, aż stanie się mętny. Następnie przenieś go do bloku grzejnego o temperaturze 37 °C. Po 15 minutach ogrzewania embrionów usuń roztwór PBT i zastąp go 1 ml alikwotem roztworu barwiącego.

Następnie dodaj 20 µL podłoża X-gal. Inkubuj probówkę przez około dwie do czterech godzin w temperaturze 37 °C, delikatnie kołysząc, aż powstanie niebieski osad. Następnie usuń roztwór barwiący i wypłucz embriony trzykrotnie w PBT o temperaturze pokojowej.

Po wypłukaniu należy za pomocą sondy igłowej lub pęsety ręcznie wyselekcjonować zarodki pod mikroskopem sekcyjnym. Wybarwione zarodki, które są przedmiotem badania, należy zebrać do probówki do mikrowirówki o pojemności 0,5 mm za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Następnie wyselekcjonowane zarodki należy przemyć 0,4 ml PBT.

Następnie należy zastąpić PBT 0,3 mililitrami roztworu blokującego i inkubować zarodki przez 15 minut przy delikatnym mieszaniu. Po 15 minutach należy dodać 75 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego i kontynuować inkubację przez noc. Następnego ranka zarodki należy płukać w PBT przez około dwie godziny, wymieniając roztwór płuczący mniej więcej co 30 minut.

Po przemyciu dodaj 0,3 ml roztworu blokującego zawierającego przeciwciało wtórne i inkubuj probówkę w temperaturze pokojowej przez noc, delikatnie kołysząc. Następnego ranka przemywaj zarodki w PBT przez około trzy godziny. Wymień PBT co najmniej pięciokrotnie w czasie trwania procesu płukania.

Po przemyciu ponownie zawiesić zarodki w 0,3 ml roztworu dab i dodać dwa mikrolitry 3% nadtlenku wodoru. Następnie inkubować je w ciemności, delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej, aż do powstania odpowiedniej ilości osadu. Zazwyczaj trwa to od 30 do 60 minut.

Następnie zarodki należy przepłukać czterokrotnie w PBT i zawiesić je ponownie w 0,2 mililitra roztworu montażowego. Teraz należy pozostawić zarodki do równowagi w ciemności w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić filetowanie zarodków, należy umieścić je na szkiełku przedmiotowym.

Najpierw przenieś je do kropli glicerolu stroną brzuszną do góry. Następnie, pod mikroskopem sekcyjnym, odetnij część przednią oraz 1/4 długości ciała i usuń najbardziej tylny region, który jest pozbawiony aksonów ruchowych. Teraz, używając igły sondującej, przenieś preparat z glicerolu, orientując go stroną grzbietową do góry, i umieść go poziomo w polu widzenia.

Kolejny krok wymaga użycia cienkiej igły wolframowej, która została wprowadzona w głąb pustego wnętrza sondy igłowej, a następnie zagięta na końcu. Używając igły wolframowej, wykonaj niewielkie nacięcie na tylnym końcu zarodka, a następnie kontynuuj nacinanie wzdłuż linii środkowej grzbietu. Upewnij się, że końcówka igły wolframowej nie dotyka powierzchni szkiełka przedmiotowego podczas sekcji, ponieważ igła może łatwo wygiąć się o szkło.

Następnie, za pomocą sondy, przenieś preparat z powrotem do kropli gliceryny i ułóż go stroną grzbietową do góry. Następnie oddziel jelito od ściany ciała, rozkładając każdą ze ścian ciała w kierunku brzuszno-bocznym. Dwie ściany ciała powinny się rozdzielić.

Następnie za pomocą sondy ostrożnie przenieś płaty ściany ciała na szkiełko przedmiotowe. Na szkiełku, używając igły wolframowej, usuń narządy wewnętrzne, przesuwając je bocznie. Aby ustabilizować igłę wolframową i zapobiec jej uszkodzeniu, zachowaj igłę wewnątrz kaniuli i trzymaj igłę wolframową opartą o powierzchnię szkiełka przedmiotowego podczas manipulowania nią.

Następnie przygotowane próbki zamocuj w 8 µL medium montażowego na nowym szkiełku przedmiotowym. Nałóż szkiełko nakrywkowe i zabezpiecz krawędzie zwykłym lakierem do paznokci. Następnie wykonaj zdjęcia w wysokiej rozdzielczości, korzystając z optyki DIC.

Stosując opisaną metodę, zarodki w stadium 16 zabarwiono przeciwciałem Fas2 i przygotowano do wizualizacji neuronów ruchowych oraz brzusznych półsegmentów A3 i A4. Zazwyczaj co najmniej siedem neuronów ruchowych wysyła i wiąże swoje aksony, tworząc gałąź nerwu ISNb. W tym preparacie możliwe było również zidentyfikowanie wielu otaczających pęczków nerwowych. Gdy międzymsegmentowy pęczek nerwowy dociera do punktu rozgałęzienia przy mięśniach 6 i 7, dwa aksony selektywnie oddzielają się od pęczka i unerwiają mięśnie 6 i 7.

To samo dzieje się w innych punktach decyzyjnych, gdy pęczek rozciąga się grzbietowo. Następnie, w ostatnim punkcie decyzyjnym, dwa aksony unerwiają mięsień 12. W przeciwieństwie do tego, w embrionach z mutacją Sema-1a te same aksony nie ulegają defasykulacji w swoich punktach decyzyjnych.

Nie jest to zaskakujące, ponieważ produkt Sema-1 aegean jest znany z tego, że pomaga w tworzeniu połączeń między aksonami ruchowymi a mięśniami docelowymi podczas rozwoju układu nerwowego. Zatem opisana metoda może być wykorzystana do analizy fenotypów mutantów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak sortować pożądane embriony mutantów, jak przeprowadzać immunostację wzorców projekcji aksonalnych neuronów ruchowych oraz jak preparować utrwalone embriony do przygotowania płaskiego.